專利名稱：一種檢測(cè)牛x、y精子分離純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種檢測(cè)牛X、Y精子分離純度的方法。
背景技術(shù)：
性別控制在畜牧生產(chǎn)中有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，借助于性別控制技術(shù)，可選擇不同 性別的家畜滿足生產(chǎn)需要，X、Y精子分離是性別控制最根本的技術(shù)手段，同時(shí)X、Y精子分離 的準(zhǔn)確程度直接關(guān)系到性別控制的效果，所以快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)體系的建立有利于分離方 法的優(yōu)化與提高，更關(guān)系到性別控制技術(shù)的可信度，有助于性控精液的推廣與市場(chǎng)普及。目前對(duì)于分離后精子純度鑒定主要采用流式細(xì)胞儀重分析評(píng)價(jià)法和熒光原位雜 交評(píng)價(jià)法(Fluorescent In Site Hybridization, FISH)。流式細(xì)胞儀重分析評(píng)價(jià)法流式細(xì)胞儀重分析評(píng)價(jià)法，將分離后的精子先超聲斷尾，僅留下精子頭部，以增加 精子的定向效應(yīng)；然后用熒光染料Hoechst33342進(jìn)行染色體染色，使染料定量地與DNA重 新結(jié)合，精子以100 200個(gè)/秒的速度通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行重分析。雖然流式細(xì)胞儀重 分析評(píng)價(jià)法準(zhǔn)確，但是受到專用儀器的限制，也犧牲了很多寶貴的機(jī)時(shí)，X精子和Y精子DNA 含量差別很小時(shí)，流式細(xì)胞重分析不能保證準(zhǔn)確性，采用同一臺(tái)儀器進(jìn)行分離結(jié)果的評(píng)價(jià) 分析，也可能造成結(jié)果的偏差，同時(shí)流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴，很多實(shí)驗(yàn)室不能夠配備。熒光原位雜交(FISH)評(píng)價(jià)法FISH是在細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè) 技術(shù)，是利用堿基互補(bǔ)原理，將標(biāo)記上非放射性熒光物質(zhì)(如熒光素、DAPI等)的染色體特 異核酸探針與細(xì)胞核中的染色體序列雜交。熒光原位雜交評(píng)價(jià)法由于使用了染色體特異探 針等，可以得到高質(zhì)量的鑒定結(jié)果；同時(shí)探針?lè)€(wěn)定，熒光試劑安全。但是FISH評(píng)價(jià)法要求在 短時(shí)間內(nèi)制備很多樣品，無(wú)形中增加了勞動(dòng)量，完成整個(gè)鑒定過(guò)程需要較長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)熒光 試劑價(jià)格昂貴，不利于此技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，非常有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)X、Y精子分離純度的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種可檢測(cè)牛單精子性別的特異PCR擴(kuò)增引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述引物檢測(cè)X、Y精子分離純度的PCR方法。本發(fā)明針對(duì)牛牙釉基因在X、Y染色體上的等位基因序列(GI :29126030和GI 29126032，序列報(bào)道長(zhǎng)度分別為6451bp和6264bp)設(shè)計(jì)了能夠檢測(cè)到牙釉基因在不同性別 精子間等位基因長(zhǎng)度多態(tài)的特異引物AML395，其核苷酸序列如表1所示(也見(jiàn)隨附的序列 表 SEQ ID NO. 1&2)表1引物AML395序列及相關(guān)信息
引物代號(hào)引物序列引物Tm值GC含產(chǎn)物長(zhǎng)度(。C)量(％)長(zhǎng)度AML395F: TTCTCACCAGTACCCTTCCTA R.-TCAGAGGCAGGTCAGGAAGCA21 2162 6847.6 61.9395bp(Y) 458bp(X)利用上述引物，對(duì)單個(gè)牛精子進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，擴(kuò)增產(chǎn) 物長(zhǎng)度為458bp的單精子為X精子，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為395bp的單精子為Y精子。應(yīng)用本發(fā)明引物建立的檢測(cè)單精子性別的方法，包括單精子的分離，單精子的裂 解，PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為458bp的單精子為X精子，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為395bp 的單精子為Y精子。應(yīng)用本發(fā)明引物建立的檢測(cè)單精子性別的方法，包括單精子的分離，單精子的裂 解，PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)和結(jié)果統(tǒng)計(jì)五個(gè)環(huán)節(jié)。具體地說(shuō)，本發(fā)明采用高濃度的堿性裂解液(500mmol/L KOH, 125mmol/L DTT)裂 解精子，每管單精子加1 1. 3uL堿性裂解液，65°C裂解lOmin，然后將中和液(900mmol/L Tris-HCl, pH8. 3，每管單精子2. 3 2. 8uL)直接加入除模板以外的總反應(yīng)體系，通常采 用25ii LPCR反應(yīng)體系，其中Taq酶1. 5U，dNTP濃度為200 y mol/L，引物濃度為180pmol/ L,各離子濃度分別為 90mmol/L Tris_HCl、30mmol/LKCl 和 1. 5mmol/L MgCl2。擴(kuò)增產(chǎn)物采 用GoldViewna 〗熒光染料(靈敏度比EB高10倍左右)染色觀察。本發(fā)明進(jìn)一步提供一 種用于上述PCR擴(kuò)增的優(yōu)化PCR反應(yīng)程序，該反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；然后94°C IS, 55°C 1S，循環(huán)29次；最后72°C延伸3min。利用本發(fā)明的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為長(zhǎng)395bp的Y染色體等位基因特異產(chǎn)物和長(zhǎng) 458bp的X染色體等位基因特異產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)單精子DNA模板擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，如擴(kuò)增 產(chǎn)物長(zhǎng)度為395bp則表明該精子為Y精子，如檢測(cè)到了長(zhǎng)度為458bp的產(chǎn)物條帶則表明被 檢測(cè)精子為X精子。由于不論是X精子還是Y精子都能檢測(cè)到特異產(chǎn)物，所以不會(huì)產(chǎn)生假 陽(yáng)性和假陰性，因此避免了由于使用內(nèi)標(biāo)引物帶來(lái)的復(fù)雜雙重PCR和較難的技術(shù)操作，檢 測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果也更加靈敏、可靠。本發(fā)明利用牛牙釉基因在性染色體上的兩個(gè)等位基因存在序列長(zhǎng)度多態(tài)特點(diǎn)，在 相應(yīng)位點(diǎn)上設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用快速PCR方法對(duì)單個(gè)精子牙釉基因的等位基因進(jìn)行擴(kuò)增 檢測(cè)，可在Y精子中檢測(cè)到長(zhǎng)約395bp的Y染色體特異產(chǎn)物條帶，在X精子中檢測(cè)到長(zhǎng)約 458bp的X染色體特異產(chǎn)物條帶，利用兩個(gè)染色體特異擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異通過(guò)瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果進(jìn)行單個(gè)精子性別鑒定。還可以通過(guò)對(duì)分離精液中各牛精子進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增 和瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)對(duì)單個(gè)精子性別檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)分離精子純度做出 最終評(píng)價(jià)。本發(fā)明同時(shí)通過(guò)改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件，而實(shí)現(xiàn)30 40分鐘左右完成PCR 擴(kuò)增。本發(fā)明不涉及任何專有儀器，只利用現(xiàn)有常規(guī)儀器和國(guó)產(chǎn)化試劑即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的， 降低了檢測(cè)成本，此外，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員均可實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)牛分離X、Y精液純度的快速PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，為現(xiàn)有牛X、Y精子分離技術(shù)的迅速提高及精子分離新方法的探索提供快速靈敏的 技術(shù)支持，并有助于性別控制精液的應(yīng)用與推廣，從而在牛繁殖過(guò)程中推動(dòng)性別控制技術(shù) 的應(yīng)用。


圖1為公牛和母牛血液及公牛精液DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中，bl_b8泳道 為母牛血液PCR擴(kuò)增結(jié)果，al-a4為公牛血液PCR擴(kuò)增結(jié)果，cl-c4泳道為公牛精液DNA的 PCR擴(kuò)增結(jié)果，ck為陰性對(duì)照；圖2為從常規(guī)精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中1-10泳道為 單精子擴(kuò)增結(jié)果(1_3、6、9為X精子，4、5、7、8、10為Y精子)，CK道為陰性對(duì)照；圖3為從分離的X精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中11、12 泳道為精液DNA的陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，其余泳道為單精子擴(kuò)增結(jié)果(2、17為Y精子，其余為 X精子)，ck為陰性對(duì)照；圖4為從分離的Y精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中11、12 泳道為精液DNA的陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，其余泳道為單精子擴(kuò)增結(jié)果(8、9為X精子，其余為 Y精子)，ck為陰性對(duì)照。上述4個(gè)圖中，M均為Marker I，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、 400bp、500bp 和 600bp。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 以牛血液DNA和精液DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增堿性裂解法制備?；蚪MDNA需要堿性裂解液和中和液兩個(gè)部分，堿性裂解液的 成分包括KOH 500mmol/L, DTT 125mmol/L ；中和液的成分包括Tris. HC1 900mmol/L, pH
=8. 3o各取公牛和母牛10 ii L抗凝血于0. 2mL高壓滅菌PCR管中，加90 yl雙蒸水，充分 混勻。12000rpm離心2-3分鐘，棄去上層液體；對(duì)于公牛精液則取一支精液采用1ml 0. 25% 的蔗糖溶液，吸打混勻，12000rpm離心10分鐘，可重復(fù)兩次。向血液細(xì)胞或精子細(xì)胞中分別 加入lOiU堿性裂解液充分吸打混勻，65°C裂解10分鐘，加入25iU中和液充分吸打混勻 立即用于PCR檢測(cè)，或-20°C保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O(shè)計(jì)依據(jù)GenBank中收錄的性染色體上的牙釉基因序列(GI 29126030和GI 29126032，序列報(bào)道長(zhǎng)度分別為6451bp和6264bp)，設(shè)計(jì)引物AML395，由上海英俊生物技術(shù) 有限公司合成，引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。表1引物AML395序列及相關(guān)信息
5引物代號(hào)
引物序列引物Tm值GC含量產(chǎn)物長(zhǎng)度(°C)(%)長(zhǎng)度F: TTCTCACCAGTACCCTTCCTA216247. 6395bp(Y)R TCAGAGGCAGGTCAGGAAGCA216861.9458bp(X)
AML395
PCR反應(yīng)體系
采用25 yl反應(yīng)體系，由以下幾個(gè)部分組成(見(jiàn)表2) 表225 ill反應(yīng)體系
元素用量終濃度ddH2010.9^1dNTP (lmmol/L)5(il0.2mMlOxPCR buffer1.5^10.6xPCR bufferPrimer AML 395 (2uM)2.5…180pMTaq (2.5U/(iL)0.6…1.5UDNA模板4|iil
伸 3min
擴(kuò)增產(chǎn)物采用GoldViewna 〗熒光染料(靈敏度比EB高10倍左右)染色觀察。 PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，然后(94°C 1S，55°C IS)循環(huán)29次，最后72°C延
采用120V電壓、2%瓊脂糖凝膠電泳20min，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析，PCR結(jié)果如圖 1所示。其中，bl-b8道為母牛血液PCR擴(kuò)增結(jié)果，al-a4為公牛血液PCR擴(kuò)增結(jié)果，cl-c4 泳道為公牛精液DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果，ck為陰性對(duì)照，M為Marker I，從下至上的條帶依次 為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。結(jié)果表明公牛血液和精液PCR產(chǎn)物均出現(xiàn) 了 395bp以及458bp條帶，母牛血液PCR結(jié)果則僅有458bp產(chǎn)物條帶。陰性對(duì)照均不存在 上述條帶。說(shuō)明本發(fā)明方法可信度高，不存在非特異性擴(kuò)增。實(shí)施例2 單精子PCR擴(kuò)增1、瓊脂糖鋪片分離單個(gè)精子1. 1使用蔗糖溶液(250mM蔗糖，5mM Tris.堿)洗滌精子a.取3支高壓滅菌1. 5ml離心管。b.從液氮中分別取出常規(guī)精液、X精液、Y精液各一支，放入40°C水中瞬間解凍。c.用剪刀剪去細(xì)管棉塞一端，將剪去棉塞管口對(duì)準(zhǔn)1.5ml離心管口，用剪刀剪去 另一端，精子順管口流入1. 5ml離心管內(nèi)，剩余精子用10 yl移液器吹入離心管內(nèi)。d.將5 ill未稀釋精子加入495 ill去離子水內(nèi)，用移液器充分吸打混勻，取約 20 yl混勻精子鋪滿整個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在普通光學(xué)顯微鏡10倍鏡下計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)。e.將未稀釋精液12000rpm離心10分鐘，棄去上層液體后，加入lml蔗糖溶液充分 吸打混勻，12000rpm離心10分鐘。f.棄去上層液體，加入lml ddH20洗滌精子，12000rpm離心10分鐘，再棄去上層 液體，加入適量蔗糖溶液(調(diào)整精子為lX107mL)充分吸打混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?.2分離單個(gè)精子
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a.取0. lg低熔點(diǎn)瓊脂糖溶于20ml ddH20，用微波爐加熱制成0. 5%低熔點(diǎn)瓊脂糖 溶液。b.低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液37°C左右時(shí)加入經(jīng)洗滌并重懸精子1 Pi (約1000個(gè)精子) 充分吸打混勻。c.將混有精子的低熔點(diǎn)瓊脂糖平鋪于直徑10cm培養(yǎng)皿。d.室溫凝固后放入37 °C烘箱，烘干2小時(shí)。e.準(zhǔn)備好放單精子高壓滅菌0. 2ml PCR管，lml注射器改制的挖膠勺。f.將鋪好平板放在倒置顯微鏡載物臺(tái)上，在10倍或20倍鏡下尋找單精子位置。g.使用自制挖膠勺挖取單個(gè)精子放入PCR管內(nèi)，-20°C保存?zhèn)溆谩?、單精子 PCR2. 1單精子裂解a.取出放有單精子的0. 2ml PCR管，3000g瞬時(shí)離心。b.向 PCR 管內(nèi)加入 1 u 1 堿性裂解液(500mmol/L KOH, 125mmol/LDTT)，65°C裂解 10分鐘，作為單精子PCR擴(kuò)增的模板。注意精子中和液(900mmol/L Tris HC1，pH8. 3)加入總反應(yīng)體系。2. 2 單精子 PCR本實(shí)驗(yàn)是利用單精子PCR對(duì)分離精液進(jìn)行純度鑒定，以公牛血液DNA作為陽(yáng)性 對(duì)照，裂解的單精子作為模板。反應(yīng)體系見(jiàn)表3，其中10XPCR buffer(500mM KClUOOmM Tris.HCl、0. 1 % 明膠)，采用 Eppendorf Mastercycler gradient PCR 儀(德國(guó))進(jìn)行 PCR反應(yīng)。表 3元素體積使用濃度Lysis 溶液(500mmol/L KOH，1卩LLysis 溶液(20mmol/L125mmol/L DTT)KOH, 5mmol/L DTT)1 OX緩沖液1.5 iiL0.6XMgCl2(62.5mM)0.6 |aL1.5 mMdNTP (ImM)5 (0.L0.2 mMTris HCl(900mM)2.5^190mMAML395(2_2.5jiL180 pMddH2010.3 yLTaq 酶(2.5un_L)0.6 ^L模版1 ^iL總計(jì)25 pLPCR 反應(yīng)條件:94°C 3min ； (94°C IS, 55°C IS)循環(huán) 29 次；72°C 3min。2. 3瓊脂糖凝膠電泳a.瓊脂糖凝膠制備取0.6g瓊脂糖溶入30mL的0.8XTBE中，置電爐上加熱并不 時(shí)搖動(dòng)至完全熔化，室溫冷至50 60°C，加4. 5 ii IGoldViewnaTMl熒光染料(靈敏度比EB 高10倍左右)立即搖勻，倒入電泳槽模具內(nèi)，室溫下放置20min以上，帶凝膠凝固后拔出梳子。b. PCR產(chǎn)物上樣電泳各取6iU PCR產(chǎn)物上樣電泳，用DNAMarker I作為分子量 標(biāo)準(zhǔn)。120V電壓電泳20min。c.結(jié)果檢測(cè)常規(guī)精液、X精液、Y精液的單精子PCR結(jié)果分別見(jiàn)圖2、3、4。其中， M 為 Marker I，從下至上的條帶依次為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp 和 600bp。圖2為從常規(guī)精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中1-10道為單 精子擴(kuò)增結(jié)果(1_3、6、9為X精子，4、5、7、8、10為Y精子)，CK為陰性對(duì)照；圖3為從分離的X精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中11、12 泳道為陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果，其余泳道為單精子擴(kuò)增結(jié)果(2、17為Y精子，其余為X精子)， ck為陰性對(duì)照；圖4為從分離的Y精液中隨機(jī)挖取單精子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，其中11、12泳 道為陽(yáng)性對(duì)照的快擴(kuò)增結(jié)果，其余泳道為單精子擴(kuò)增結(jié)果(8、9為X精子，其余為Y精子)， ck為陰性對(duì)照。
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按照上述方法、對(duì)樣本中抽取的單精子進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出X、Y單精子所占的比例， 從而判斷該樣本精子的分離純度。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)牛單精子性別或牛分離精液中X、Y精子純度的引物，其包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述引物在檢測(cè)牛單精子性別中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述引物在檢測(cè)牛分離X、Y精子純度中的應(yīng)用。
4.含有權(quán)利要求1所述引物的性別鑒定PCR試劑盒。
5.一種檢測(cè)牛單精子性別的方法，其采用權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求4所述試劑 盒對(duì)牛單個(gè)精子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，具有擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為458bp的單精 子為X精子，具有擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為395bp的單精子為Y精子。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min；然后94°C 1S，55°C 1S，循環(huán) 29 次；最后 72°C延伸 3min。
7.—種檢測(cè)分離精液中X、Y精子純度的方法，其采用權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求 4所述試劑盒對(duì)分離精液中各個(gè)精子DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)分析，判斷分離精液中X、Y精子純度。
8.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求4所述 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，具有擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為458bp的單精子為X精子，具有擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 395bp的單精子為Y精子。
9.如權(quán)利要求7或8所述方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min；然后 940C 1S，55°C 1S，循環(huán) 29 次；最后 72°C延伸 3min。 全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)牛單精子性別或牛分離精液中X、Y精子純度的引物及其應(yīng)用。所述引物包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列，本發(fā)明利用上述引物采用快速PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，利用兩個(gè)染色體特異擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行單個(gè)精子性別鑒定；通過(guò)對(duì)分離精液中分離的各單個(gè)牛精子進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)對(duì)單個(gè)精子性別檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)分離精子純度做出最終評(píng)價(jià)。該方法在任意精子細(xì)胞中均能擴(kuò)增出特異PCR產(chǎn)物，不需設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)引物，是一種成本低廉，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定牛X、Y精子分離純度的技術(shù)，為后續(xù)性控精液的推廣應(yīng)用及精子分離方法的優(yōu)化與創(chuàng)新提供了可靠、必要的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101935698SQ20101018276
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者吳承疆, 朱化彬, 杜衛(wèi)華, 林博, 王棟, 程金華, 趙學(xué)明, 郝海生 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所