專利名稱：牛胚胎性別早期判定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于生物技術(shù)領(lǐng)域控制牛胚胎性別的一種途徑和方法。
性別控制問題，特別是對家畜的性別控制問題，長期以來一直是生物科學(xué)家致力于研究的重大的理論課題之一，許多科學(xué)家曾根據(jù)X型和Y型兩種不同類型的精子的物理和化學(xué)特性間的差異，先后采用電泳法、沉降法、逆流離心法、超聲波處理法以及H-Y抗原等方法，試圖把含有X染色體和Y染色體兩種不同類型的精子分離，再分別進行人工授精，以實現(xiàn)人工控制性別的目的。遺撼的是，這些有益的嘗試至今尚未取得令人滿意的結(jié)果。
本發(fā)明是采用一種特殊的手段先取得胚胎細胞，然后利用染色體技術(shù)直接制備胚胎細胞的染色體，通過對染色體的顯微觀察和分析，對胚胎的性別作出判定，實現(xiàn)人工控制性別，達到提高母犢出生率，增加畜群中母畜比例的目的。
這里應(yīng)用的對牛胚胎性別的早期判定方法，是采用染色體技術(shù)，通過對Y染色體的探測來實現(xiàn)的。這種判定性別的方法，為解決家畜性別控制這一生物領(lǐng)域的重大課題開辟了新途徑，創(chuàng)造了一種行之有效的新方法。是生物技術(shù)領(lǐng)域的新突破。這項發(fā)明不僅具有重大的理論意義，而且在畜牧業(yè)生產(chǎn)實踐中也具有重大的應(yīng)用價值。
如把該項技術(shù)應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，可以提高畜群中母畜的比例，特別是應(yīng)用于奶牛業(yè)生產(chǎn)，能大大提高母犢的出生率，可望獲得顯著的經(jīng)濟效益。對胚胎性別判定越早經(jīng)濟效益越明顯。本項研究證明，牛胚胎性別的判定早在母牛妊娠后20天左右即可進行，但對牛胚胎性別判定的最適宜時間是母牛妊娠后30-40天。
這項發(fā)明所采用的技術(shù)路線是，吸取胚胎絨毛膜組織細胞，應(yīng)用細胞研究技術(shù)進行組織培養(yǎng)，然后通過對染色體制片作顯微觀察和分析，作出性別判定。
具體的技術(shù)路線如下1、吸取胚胎絨毛膜組織細胞的方法(1)用穿刺針頭，如

圖1中的標號1(外徑2mm，長度165mm，不銹鋼制品)，在后海穴位注射2%普魯卡因10ml，目的在于松馳子宮口。
(2)應(yīng)用直腸把握法，將子宮頸開張器，如圖1中標號2(外徑3mm，頂球外徑4.5mm，長度400mm，不銹鋼制品)，先通過子宮頸，然后將子宮頸通過管，如圖1中標號3(外徑6mm，內(nèi)徑5mm，長度360mm，金屬制品)套在子宮頸開張器(圖1中標號2)上使其通過子宮頸，待子宮頸通過管(圖1中的標號3)通過子宮頸后把子宮頸開張器(圖1標號2)拉出。
(3)將吸取胚胎組織軟管，如圖1中的標號4(外徑3-4mm，內(nèi)徑2-3mm，長度700mm，軟塑料透明管)沿著子宮頸通過管(圖1中的標號3)的內(nèi)壁進入子宮，使吸取胚胎組織軟管(圖1中的標號4)造成一定負壓，然后輕輕拉出吸取胚胎組織軟管(圖1中的標號4)，這樣一次可吸得胚胎絨毛膜組織5-10mg。
2、利用胚胎絨毛膜組織細胞制備染色體的方法(1)培養(yǎng)基的制備按常規(guī)法制備RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)至PH7.2，抽濾滅菌，分裝培養(yǎng)瓶，每瓶3ml，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> (2)培養(yǎng)將吸得的胚胎絨毛膜組織細胞立即放入備用的培養(yǎng)瓶中，加秋水仙素，使其最終濃度為0.03-0.05ug/ml，置38℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3小時。
(3)低滲處理將培養(yǎng)物連同培養(yǎng)液倒入離心管，置1000轉(zhuǎn)/分，離心8-10分鐘;吸棄上清液，加濃度為0.8-1.2%檸檬酸納8ml，置入預(yù)溫37℃恒溫水浴中低滲30分鐘。
(4)預(yù)固定把固定液，甲醇冰醋酸(3∶1)1ml加入低滲液中，輕輕打勻，固定20分鐘。
(5)固定(6)再固定離心棄去上清液，再加固定液8ml，輕輕打勻，固定20分鐘。
(7)用60%冰醋酸處理離心棄去上清液，加入1-1.5ml60%冰醋酸，輕輕搖動2分鐘，使絨毛膜細胞從上皮組織上脫落下來，制成細胞懸液。
(8)離心以1000轉(zhuǎn)/分，離心8-10分鐘，棄去上清液。
(9)制片留沉淀物，加適量的固定液(0.5-1ml)制成細胞懸液，滴片、干燥。
(10)染色用4∶1(PH7.4)Giemsa染色20-30分鐘、沖洗、干燥、鏡檢。
(11)胚胎性別判定牛(Bostaurus)的體細胞染色體為30對，2n＝60，常染色體為29對，均為端著絲點，性染色體公母不同，母牛為XX(即X型)，公牛為XY(即Y型)，X染色體和Y染色體雖都是近中著絲點，但X染色體比Y染色體要長的多，胚胎是否屬于Y型[如圖2牛胚胎絨毛細胞染色體制片顯微照片(Y型)]在高倍顯微鏡下很容易確定。如作顯微鏡攝影放大分析更清楚。
權(quán)利要求
1.牛胚胎性別早期判定方法，其技術(shù)特征是用吸取牛胚胎絨毛組織細胞的方法，將吸得的胚胎絨毛細胞應(yīng)用染色體技術(shù)，分析胚胎細胞的染色體是屬于X型還是屬于Y型，作出是公犢還是母犢的性別判定。吸取牛胚胎絨毛膜組織細胞早在母牛妊娠后20天左右即可進行，最適宜的取樣時間為母牛妊娠后30-40天。
2.按照權(quán)利1所述，吸取牛胚胎絨毛膜組織細胞的方法，其技術(shù)特征是用穿刺針頭在后海穴位注射2%普魯卡因10ml后，應(yīng)用直腸把握法，將子宮頸開張器通過子宮頸，接著使子宮頸通過管通過子宮頸后，把子宮頸張開器拉出，再將吸取胚胎組織軟管沿著子宮頸通過管的內(nèi)壁進入子宮，使吸取胚胎組織軟管造成一定負壓，然后輕輕拉出吸取胚胎組織軟管，這樣一次可吸得胚胎絨毛膜組織5-10mg。
3.按照權(quán)利1所述，應(yīng)用染色體技術(shù)用胚胎絨毛膜細胞制備染色體的方法，其技術(shù)特征是(1)利用牛胚胎絨毛膜細胞直接制備染色體。(2)利用濃度為0.8-1.2%檸檬酸鈉作低滲處理。(3)利用60%冰醋酸處理。(4)利用牛(Bos taurus)29對常染色體都屬于端著絲點，而X染色體明顯長于Y染色體的特點，分析胚胎是屬于X型還是屬于Y型，判定是公犢還是母犢。其具體步驟是培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)、低滲處理、離心、預(yù)固定、固定、再固定、60%冰醋酸處理、離心、制片、Giemsa染色、鏡檢分析胚胎是屬于X型還是Y型判定牛胚胎性別。
全文摘要
利用染色體技術(shù)對牛胚胎的性別早期判定方法。是采用一種特殊手段取得早期牛的胚胎細胞，利用染色體技術(shù)作染色體分析，探測Y染色體，判定胚胎的性別。
文檔編號A61B10/00GK1033556SQ8710119
公開日1989年7月5日 申請日期1987年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月19日
發(fā)明者晁玉慶, 年景聲 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院