專利名稱：一種來源于矛頭蝮蛇毒x因子激活物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶及其提取方法，特別是提供了一種來源于矛頭蝮蛇毒X因子激活物的提取方法。
背景技術(shù)：
X因子激活酶是凝血作用最強的一個組分，凝血因子X(FX)是一種血漿糖蛋白，在凝血過程中起著重要的作用，它的活化形式ha，可以在凝血因子V、Caz+、磷脂的輔助作用下把凝血酶原活化為凝血酶。FX激活酶主要分布在圓斑蛙蛇(Rusesilviper)蛇毒中，在蛙蛇亞科和蝮蛇亞科及一些眼鏡蛇的蛇毒中也有發(fā)現(xiàn)。中國蛙蛇蛇毒中FX激活酶(CRVV)是從圓斑蝗蛇 (Russelv幣er)蛇毒中提取的X因子活化酶，能特異性激活凝血因子X而使血漿凝固，與外國同類產(chǎn)品Mypven reagent類同。FX激活酶能特異地激活血液中的凝血因子X(FX)，促進血液凝固，在臨床診斷，新藥物的開發(fā)以及蛋白結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)研究等眾多領(lǐng)域都有巨大應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活酶。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題，采取以下技術(shù)方案一種X因子激活酶，是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行DEAE-kpharose fast flow離子交換層析、透析、纖維素DEAE-52離子交換層析和kphadex-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的蛋白。本發(fā)明所述來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活酶具有以下特點由金屬蛋白酶(鈣離子依賴性磷脂非依賴性)和絲氨酸蛋白酶(鈣離子非依賴性)兩大類組成。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法，包括以下步驟(1)、將矛頭蝮蛇蛇毒溶于pH7-8、0. 05mol/L的1Tris-HCl緩沖液中，得到濃度為 100-120g/L的矛頭蝮蛇蛇毒液；O)、對步驟⑴獲得的矛頭蝮蛇蛇毒液進行離子交換層析，固相填充物為 DEAE-Sepharose fast flow,洗脫液為含 0-0· 2mol/L NaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫；(3)、收集洗脫液，在^Onm的波長下對洗脫液進行紫外分光廣度檢測，得到吸收圖譜，將各峰進行SDS-PAGE凝膠電泳，收集含有X因子激活酶的部分；(4)、濃縮除鹽，用pH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl ；(5)、再次離子交換層析，步驟4)的濃縮液進行離子交換層析，固相填充物為纖維素 DEAE-52 ；洗脫液為含 0-0. 5mol/LNaCl 的 pH6. 2,0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液直線梯度洗脫；(6)、將步驟(5)獲得的洗脫液各峰進行SDS-PAGE凝膠電泳，收集含有X因子激活酶的部分；
(7)、再次濃縮除鹽，用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除 NaCl ；(8)、將步驟(7)濃縮液進行凝膠過濾層析，固相填充物為kphadeX-G75，洗脫液為pH7. 5、0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，收集洗脫液，從中收集含有X因子激活酶部分，得到矛頭蝮蛇X因子激活酶原液。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟(1)中為獲得更好的實施效果，可先用離心的方法去除矛頭蝮蛇蛇毒液中的雜質(zhì)，離心條件可根據(jù)實際情況進行選擇，如在 4500rpm 下離心 15min。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟O)中的DEAE-kpharosefast flow 離子交換層析柱在使用前，先用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的 pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；所述步驟2) 中的Tris-HCl緩沖液優(yōu)選為ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液·。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟C3)中的收集方法可為依據(jù)^Onm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集；具有X因子激活酶部分的檢測方法為=SDS-PAGE電泳。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟⑷濃縮除鹽可選用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用pH6.2、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟(5)中纖維素DEAE-52層析柱在使用前，先用PH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后PH6. 2、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min。本發(fā)明所述X因子激活酶提取方法中，步驟(8)中kphadeX-G75層析柱使用前， 先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/min,層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/ min，用與步驟C3)相同的方法收集洗脫液中含有X因子激活酶的部分。本發(fā)明提供了一種從矛頭蝮蛇毒液中提取到的X因子激活酶。所述X因子激活酶具有以下特點(1)由金屬蛋白酶(鈣離子依賴性磷脂非依賴性)和絲氨酸蛋白酶(鈣離子非依賴性)兩大類組成；( 該酶的提取方法以常規(guī)的層析技術(shù)為主，通過變換層析條件和調(diào)節(jié)技術(shù)參數(shù)實現(xiàn)精確分離的目的，且可以在常溫下進行操作，并具有條件簡單容易放大，成本低(選擇的層析膠可以反復(fù)利用)，收率高和產(chǎn)品純度高的優(yōu)點?；谏鲜鎏攸c，可以本發(fā)明的X因子激活酶為活性成分制備治療外科出血、內(nèi)科出血、婦產(chǎn)科出血、五官科出血、兒科出血和組織活檢后出血等臨床出血及出血性疾病的藥物，將在生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1本實施例所述X因子激活酶的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號 080709)，用IOOml預(yù)冷的pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液于4_8°C的層析柜中攪拌溶解30min，4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將DEAE-S^)harose fast flow層析柱用pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用PH7、0. 05mol/L 的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；依據(jù)^Onm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析具有X因子激活酶部分，合并洗脫液，共得23^11，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度，濃縮樣品40ml ；上樣至纖維素DEAE-52層析柱，先用PH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后PH6. 2、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用pH7. 5,0. Olmol/L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，然后上樣kphadeX-G75層析柱，先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡 5-6小時，流速為3. Oml/min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/min。收集樣品45ml，收獲蛋白3%ig，HPLC分析純度為 97. 5%，SDS-PAGE 為一條帶。實施例2本實施例所述X因子激活酶的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號 080709)，用IOOrnl預(yù)冷的ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液于4-8°C的層析柜中攪拌溶解30min，4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將DEAE-S^harose fast flow層析柱用ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用PH7. 5、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 ρΗ7· 5、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；依據(jù)^Onm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析具有X因子激活酶部分，合并洗脫液，共得^5ml，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，濃縮樣品40ml ；上樣至纖維素DEAE-52層析柱，先用pH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為 3. Oml/min;層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后ρΗ6· 2、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 5mol/LNaCl的ρΗ6· 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，然后上樣kphadex-G75層析柱，先用pH7. 5,0. 01mol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/min。收集樣品58ml，收獲蛋白36. 2mg, HPLC分析純度為98. 3%, SDS-PAGE為一條帶。實施例3
本實施例所述X因子激活酶的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號 080709)，用IOOml預(yù)冷的ρΗ8· 0、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液于4-8°C的層析柜中攪拌溶解30min，4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將DEAE-S^harose fast flow層析柱用ρΗ8· 0、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用PH8. 0、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 ρΗ8· 0、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；依據(jù)^Onm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析具有X因子激活酶部分，合并洗脫液，共得Maul，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用PH6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，濃縮樣品40ml ；上樣至纖維素DEAE-52層析柱，先用pH6. 2,0. 05mol/L的1Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為 3. Oml/min;層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后pH-6. 2,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 5mol/LNaCl的pH6. 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，然后上樣kphadex-G75層析柱，先用pH7. 5,0. Olmol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/min。收集樣品39ml，收獲蛋白33. 4mg, HPLC分析純度為97. 9%，SDS-PAGE為一條帶。
權(quán)利要求
1.一種來源于矛頭蝮蛇毒X因子激活物的制備方法，其特征在于所述矛頭蝮蛇毒凝血X因子激活酶，是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行DEAE-kpharose fast flow離子交換層析、 透析、纖維素DEAE-52離子交換層析和kphadex-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血X 因子激活酶活性的蛋白；所述第一次DEAE-kpharose fast flow離子交換層析用pH7_8、 0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液進行直線梯度洗脫；所述纖維素DEAE-52離子交換層析用pH6. 2,0. 05mol/L的 Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 5mol/LNaCl的pH6. 2,0. 05mol/L的iTris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫；所述kphadex-G75凝膠過濾層析用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫。
2.按照權(quán)利要求1所述來源于矛頭蝮蛇毒X因子激活物的制備方法，其特征在于所述矛頭蝮蛇毒凝血X因子激活酶可分為金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶兩大類，金屬蛋白酶是由兩條輕鏈和一條重鏈經(jīng)鏈間二硫鍵形成的糖蛋白，其活性是鈣離子依賴性磷脂非依賴性的；激活FX的絲氨酸蛋白酶分子量較小，其活性為鈣離子非依賴性。
3.按照權(quán)利要求1所述來源于矛頭蝮蛇毒X因子激活物的制備方法，其特征在于所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法包括以下步驟(1)蛇毒預(yù)處理；(2)將預(yù)處理的蛇毒溶液上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE-kpharosefast flow離子交換層析，用 pH7-8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 2mol/LNaCl 的 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫；(3)收集洗脫液，在^Onm的波長下對洗脫液進行紫外分光廣度檢測，得到吸收圖譜， 將各峰進行SDS-PAGE凝膠電泳，收集含有X因子激活酶的部分；(4)將上述洗脫液進行超濾濃縮去除NaCl；(5)再次離子交換層析，步驟的濃縮液進行離子交換層析，固相填充物為纖維素 DEAE-52 用 ρΗ6· 2、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 5mol/LNaCl 的 ρΗ6· 2、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫；(6)將步驟( 獲得的洗脫液各峰進行SDS-PAGE凝膠電泳，收集含有X因子激活酶的部分；(7)超濾濃縮去除NaCl；(8)將步驟(7)濃縮液進行凝膠過濾層析，固相填充物為kphadex-G75，洗脫液為 pH7. 5、0. 01mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液。
4.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟(1)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用適量預(yù)冷的pH7-8、0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液溶解； 步驟(1)還包括用離心的方法去除矛頭蝮蛇蛇毒液中的雜質(zhì)的步驟。
5.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中DEAE-Sepharosefast flow離子交換層析柱在使用前，先用pH7_8、0. 05mol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. 0ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/ min0
6.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的收集方法為依據(jù)^Onm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集；具有X因子激活酶部分的檢測方法為=SDS-PAGE凝膠電泳。
7.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征于所述步驟(4) 中的濃縮方法為用PH6. 2、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl。
8.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟 (5)中纖維素DEAE-52層析柱在使用前，先用ρΗ6· 2、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡 5-6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min，用與步驟(3)相同的方法收集洗脫液中含有X因子激活酶的部分。
9.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟(7)中的濃縮方法為用pH7.5、0. Olmol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl。
10.按照權(quán)利要求3所述矛頭蝮蛇毒X因子激活酶的制備方法，其特征在于所述步驟(8)中kphadex-G75層析柱使用前，先用pH7.5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/min，用與步驟(3)相同的方法收集洗脫液中含有X因子激活酶的部分。
全文摘要
一種來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血X因子激活物及其提取方法，該激活物是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行DEAE-Sepharose fast flow離子交換層析、透析、纖維素DEAE-52離子交換層析和Sephadex-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血X因子激活酶活性的蛋白；以本發(fā)明的凝血X因子激活酶為活性成分制備治療外科出血、內(nèi)科出血、婦產(chǎn)科出血、五官科出血、兒科出血和組織活檢后出血等臨床出血及出血性疾病的藥物，將在生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N9/64GK102242102SQ201010166689
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者劉鵬輝, 孫東, 崔亮亮, 張宏杰, 曹麗麗, 王宏英, 薛百忠, 薛雁 申請人:遼寧諾康醫(yī)藥有限公司