專利名稱：：一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因重組方法制備定點(diǎn)突變的巴曲酶~~Batroxobin。其關(guān)鍵是巴曲酶基因的定點(diǎn)改造、合成、克隆、表達(dá)及產(chǎn)物的發(fā)酵表達(dá)和分離純化制備。突變的巴曲酶既可以作為止血藥的主要成份，也可以直接用作止血藥物。
背景技術(shù)：
：自1963年奧地利學(xué)者VonKlobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(5o決ra/w^rax)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶)，也就是所說的巴曲酶。至今已發(fā)現(xiàn)30多種蛇毒中含有類凝血酶組份，并有20多種先后得到分離和純化，它們都能作用于哺乳動物血漿中纖維蛋白原A鏈中的Arg"-Gly"間的肽鍵，釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，這些纖維蛋白就能聚集成疏松的栓子來封閉傷口，實現(xiàn)快速止血的效果。同時，在體內(nèi)它并不激活凝血因子xm，由其水解產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊的側(cè)鏈不能交聯(lián)，易被纖維蛋白溶酶降解，所以不會造成血液系統(tǒng)的栓塞。巴曲酶現(xiàn)已經(jīng)被成功地開發(fā)成止血藥——進(jìn)口的有立止血(Reptilase)，國產(chǎn)的有巴曲亭，在臨床上具有很好的止血效果。成熟的巴曲酶分子是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，其氨基酸序列如下1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNRRFMRIHLGKHAGSVANYDEWRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDWHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP其DNA序列如下1GTCATTGGAGGTGATGMTGTGACAT雄TGMCATCCTTTCCTTGCATTCATGTACTAC61TCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATGACTTTGATCMCCAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCA121CACTGTAACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGT嵐CATGCCGGAAGTGTAGC嵐T181TATGATGAGGTGGTMGATACCCAAAGGAGMGTTCATTTGTCCCMTMGAAAAAAMT241GTCATMCGGACMGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCMAMCAGTGM301CACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCMCCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATT361ATGGGATGGGGCGCMTCACAACTTCTGMGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT421AACATTAACCTGTTCMTMTACGGTGTGTCGTGMGCTTACAATGGGTTGCCGGCG嵐481ACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGA541CCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC601GMCCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCMGGTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGC661ATTATTGCAGGAMTAAAACTGCGACTTGCCCG理論計算出其分子量為25.5KD,等電點(diǎn)為7.39，國外從5o決ra/w^m毒液中提取的巴曲酶，其實際分子量為42KD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，其分子內(nèi)有兩個N-糖基化位點(diǎn)Asn"、Asn"-Thr"s和Asn^Lys氣Thr228。此外，5o決ro，a/rnx的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29.1KD到42KD不等，這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個半胱氨酸，根據(jù)己知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結(jié)果，推測這12個半胱氨酸可能有Cys:Cys139、Cys26-CyS42、CyS74-Cys23G、Cys118-Cys184、Cys15。-CyS168、Cys174-Cys199六個分子內(nèi)二硫鍵的形成(Itohn.etal.TheJ.ofBiologicalChemistry,262,3132,1987)。考慮到從巴西進(jìn)口蛇毒原料成本較高，同時，巴西矛頭蝮蛇是稀有的保護(hù)蛇種，蛇毒產(chǎn)量有限。因此，我們設(shè)想采用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組巴曲酶，我們首先構(gòu)建了表達(dá)天然巴曲酶的基因工程菌種，但發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵表達(dá)時，目的蛋白有嚴(yán)重的降解現(xiàn)象，這就極大地影響了巴曲酶的產(chǎn)量。因此，我們想對巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，將巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行突變，避免其對發(fā)酵液中所表達(dá)的巴曲酶的降解，同時還不影響巴曲酶的凝血活性，這將極大地提高巴曲酶的產(chǎn)量，更好地滿足研究和臨床應(yīng)用的需要。巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是由于分子內(nèi)二硫鍵多，還有糖基化修飾等，所以采用基因工程手段生產(chǎn)這種蛋白有很大的技術(shù)難度。這也應(yīng)該是一直沒有重組產(chǎn)品問世的主要原因之一。雖然研究者對天然巴曲酶的性質(zhì)有比較多的了解，但是，對其分子生物學(xué)方面的研究一直進(jìn)展緩慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的cDNA和基因組DNA測序工作(NobuyukiItohetalJ.Biol.Chem.262(7):3132-3135，1987;J.Biol.Chem.,263:7628-7631,1988)。MaedaM等采用基因重組方法，在E.coli中，采用融合表達(dá)系統(tǒng)，以包涵體(InclusionBody)的形式表達(dá)出該成份，據(jù)報道得到了所謂有生物學(xué)活性巴曲酶(MaedaM.etal，JBiochem(Tokyo)，109(4):632-637，1991)，而且還為此申請了專利(Pat，No.:JP2124092，1990)。在中表達(dá)某些蛋白已經(jīng)是較為常規(guī)的生產(chǎn)藥用蛋白的基本手段，但是在對蛇毒類凝血酶實際研究中發(fā)現(xiàn)，在Eco//中表達(dá)蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用RT-PCR法擴(kuò)增出蝮蛇"gHs/rodo"/w/"戶a/Zos)蛇毒類凝血酶基因Pallas，以表達(dá)載體pET-24a(+)構(gòu)建T-7啟動子控制下的表達(dá)質(zhì)粒pET-Pallas，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，并用0.4mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Pallas表達(dá)(潘華等，蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達(dá)研究，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1999，31，79)。Fan等采用PCR法擴(kuò)增出蝮蛇C4g/b'欣oJow"cwft^)的蛇毒類凝血酶基因Acutin，克隆到表達(dá)載體pET-24a，在￡.co//BL21DE(3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(dá)(FanCY.等,BiochemistryandMolecularBiologyInternational,1999，47，217)。但它們的表達(dá)效率普遍較低，沒有實際生產(chǎn)價值。楊青等報道了用甲醇酵母表達(dá)Gussurobin,獲得每升發(fā)酵液產(chǎn)10mg有活性的Gussurobin(楊青等，BiotechnologyLetters,2002，24，135);Weon-KyooYou等報道了用甲醇酵母表達(dá)Batroxobin，獲得了每升發(fā)酵液產(chǎn)13.16mg有活性的Batroxobin(Weon-KyooYou等，F(xiàn)EBSLetters，2004，571,67)。上海萬興生物制藥有限公司申請了基因工程表達(dá)Batroxobin的專利(公開號CN1534093A，2004)，在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達(dá)，但在大腸桿菌中表達(dá)的Batroxobin均為無活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)每毫升發(fā)酵液20克氏單位(20KU/ml)，這一產(chǎn)量已初步具備生產(chǎn)意義。上述研究結(jié)果表明利用基因工程方法生產(chǎn)蛇毒類凝血酶是可行的，但要用真核表達(dá)系統(tǒng)。到目前為止，Batroxobin的基因工程產(chǎn)品還沒有上市。采用基因工程的手段生產(chǎn)富含多對二硫鍵的蛋白一直是一個技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有六對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體，雖然對包涵體的變性復(fù)性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本決定了不具備實際生產(chǎn)意義。真核表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲細(xì)胞等)能保證較高的二硫鍵配對正確率。另外，蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核細(xì)胞不能對所表達(dá)的外原蛋白進(jìn)行糖基化，而糖基對蛋白的空間結(jié)構(gòu)和酶活性都起穩(wěn)定作用。因此空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。而真核表達(dá)系統(tǒng)除能保證較高的二硫鍵配對正確率外，還能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一定程度的糖基化，雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保證了表達(dá)產(chǎn)物的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，它能夠通過以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)獲得，同時具有較高的生物活性。本發(fā)明提供了一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動物血漿凝固，其特征在于所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶氨基酸序列相對于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變?yōu)長ys，具體為1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNI^FMRIHLGKHAGSVANYDEWRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVL(JGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP本發(fā)明具有生物活性的定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，可以通過將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，或者在CHO細(xì)胞或其它哺乳動物細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。優(yōu)選地，本發(fā)明定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶可以通過甲醇酵母菌以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。在甲醇酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)時，可以依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，再將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因重組到甲醇酵母菌表達(dá)載體/7尸/C9尺和；尸/CZff中。其中人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列最好為1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTTTGGCTTT51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTTTGATTAACCAAG101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAM^TTTATGAGAATTCAT151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA301CATATTGCTCCATTGTCTTTGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTTTGT451AGAGAAGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACTTTGTGTGCTGGTGTTTT501GCAAGGTGGTATTGATACTTGTGGTGGTGATTCTGGTGGTCCATTGATTT551GTAACGGTCAATTTCAAGGTATTTTGTCTTGGGGTTCTGATCCATGTGCT601GAACCAAGAAAGCCAGCTTTTTACACTAAGGTTTTTGATTACTTGCCATG651GATTCAATCTATTATTGCTGGTAACAAGACTGCTACTTGTCCA在甲醇酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)時，可以利用酵母菌的a-信號肽，PHOl信號肽，或者利用巴曲酶的天然信號肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入KEX2蛋白酶識別序列AAAAGA。本發(fā)明定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，可作為止血藥的主要成份，也可以直接作為止血藥之用。本發(fā)明對巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)改造。核酸序列按酵母菌喜好的遺傳密碼子，將編碼第45位氨基酸的AGA(精氨酸)突變?yōu)锳AG(賴氨酸)，人工合成定點(diǎn)改造的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列，除定點(diǎn)突變外均為同義突變，即并沒改變氨基酸種類。本發(fā)明定點(diǎn)突變的意義就在于，通過定點(diǎn)突變，使巴曲酶分子中的KEX2酶切位點(diǎn)Arg-Arg突變?yōu)锳ig-Lys，使酵母菌產(chǎn)生的KEX2酶不能對酵母所表達(dá)的目的產(chǎn)物巴曲酶進(jìn)行酶解，從而大大地提高了巴曲酶的產(chǎn)量，并且這種突變并不影響巴曲酶的凝血活性。目前，在國內(nèi)外還未見對巴曲酶進(jìn)行定點(diǎn)改造的研究報道。將人工合成定點(diǎn)改造的巴曲酶的結(jié)構(gòu)基因重組到酵母菌表達(dá)載體pPIC9K和pPICZc中，在酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，確定了酵母菌最優(yōu)發(fā)酵表達(dá)條件，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了高活性的定點(diǎn)突變基因工程巴曲酶。結(jié)果表明，定點(diǎn)突變基因工程巴曲酶較從蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產(chǎn)率達(dá)58KU/ml發(fā)酵液。比沒有突變的基因工程巴曲酶的產(chǎn)量提高了近l倍。具體實施例方式實施例1根據(jù)美國Genebank中公開的巴曲酶(X12747)的核酸序列，選擇酵母菌喜好的遺傳密碼子，人工合成巴曲酶的定點(diǎn)改造的結(jié)構(gòu)基因序列，將編碼第45位的Aib的密碼AGA突變?yōu)榫幋aLys的AAG，將酵母菌內(nèi)源KEX2蛋白酶識別序列Arg-Arg突變?yōu)锳ig-Lys,因此KEX2蛋白酶就不會在此位點(diǎn)降解分泌到發(fā)酵液中的巴曲酶，從而使目的蛋白能夠大量積累。為使合成的目的基因重組到酵母菌分泌型表達(dá)載體pPICZff中，在基因的5'端添加XhoI酶切位點(diǎn)、基因的3'端添加終止密碼子TAATGA及SacII酶切位點(diǎn)。另外，在XhoI酶切位點(diǎn)與巴曲酶蛋白N-端第一個氨基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應(yīng)的密碼子AAAAGA，這就確保了目的蛋白在分泌到發(fā)酵液中時能夠順利地切除"-信號肽。將合成的目的基因及pPICZ"載體經(jīng)XhoI和SacII雙酶切，電泳、回收，將目的基因重組到pPICZ"中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplOF'中，進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化有pPICZ"的大腸桿菌ToplOF，在LB+25ug/mgZeocin的平板上的進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，XhoI和SacII雙酶切檢測或進(jìn)行a-factorpriming和3'AOX1primingPCR檢測，說明pPICZ"中含有目的基因，可以用來轉(zhuǎn)化尸&似"X-33，KM71H或GS115宿主菌。實施例2用DNA限制性內(nèi)切酶Sacl將pPICZa-Bg線性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy尸fc/7/aExpressionKitVersionB中的方法制備酵母宿主感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂在YPD+500ug/mlZeocin培養(yǎng)基上生長，30'C下放置3-4天可出現(xiàn)單菌落。挑選菌落大而飽滿的克隆進(jìn)行表達(dá)篩選。實施例3用在試管中篩選出的高表達(dá)的工程菌，接種到搖瓶中增殖作為種子液，再轉(zhuǎn)接至10L發(fā)酵罐，按甲醇酵母發(fā)酵的常規(guī)方法進(jìn)行中試規(guī)模的發(fā)酵。誘導(dǎo)72小時。將發(fā)酵液離心收集上清，或超濾濃縮脫鹽，采用疏水柱層析、離子交換柱層析、親和柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術(shù)，得到純度達(dá)97%以上的活性蛋白。采用同類產(chǎn)品活性的測定方法進(jìn)行體外凝血試驗，具體實驗方法為取人一枸櫞酸抗凝血漿0.2ml，加入直徑lcm的試管中，置37。C水浴中保溫3分鐘，加入37。(:預(yù)熱的樣品溶液0.21111，立即混勻計時，于40秒開始，檢査血漿凝固情況，記錄初凝時間，同時測定3管，3管初凝時間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄60土20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0.2ml人一枸櫞酸抗凝血漿在60秒凝固的酶量，定義為一個單位。實施例4種子液在2L酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中28'C發(fā)酵24小時后轉(zhuǎn)到40L發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基H3P04，27ml/L;CaS042H2O，0.9g/L;K2SO418g/L;MgSO47H20，15g/L;KOH，4.13g/L;甘油40g/L;4.4ml/L微量礦物質(zhì)溶液。在發(fā)酵過程中，用NH40H調(diào)pH值，使其維持在6.0。3(TC通氧劇烈攪拌(lOOOrpm)發(fā)酵，添加消泡劑。發(fā)酵24小時后，加入含12ml/L微量礦物質(zhì)的50%甘油，溶氧濃度為40%，繼續(xù)培養(yǎng)10小時。當(dāng)碳原饑餓30分鐘后，加入甲醇誘導(dǎo)。剛開始的5小時加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母適應(yīng)甲醇，100%甲醇含12ml/L微量礦物質(zhì)溶液，其溶氧量在40%以上。繼續(xù)發(fā)酵72小時，凝血活性達(dá)到58U/ml發(fā)酵液。實施例5對未經(jīng)定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，兩菌種除突變點(diǎn)外,其它遺傳背景完全相同，按照實施例4的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，凝血活性達(dá)到30KU/ml發(fā)酵液。實施例6發(fā)酵液離心，收集上清液，加入(NH4)2S04使其濃度達(dá)到1.6mol/L，然后加到phenyl-S印harose層析柱上，用(NH4)2S04從1.6~0mol/L進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰，然后上親和柱benzamidine-SepharoseCL-6B，50mMTris/HCl,pH8.2，洗脫液含0.5MNaCl，收集活性峰。接著上SephadexG-50，流動相50mMTris/HCl，pH8.2,含0.5MNaCl,收集活性峰。最后，SephadexG-25脫鹽，收集活性峰。凍干，存于-2(TC。SDS-PAGE電泳檢測純度達(dá)97%以上。送樣品測定氨基酸序列，結(jié)果同理論設(shè)計的完全一致。見定點(diǎn)突變后的batroxobin氨基酸序列。實施例7發(fā)酵液離心，收集上清液，用65%固體,)2804使活性蛋白鹽析低溫過夜，離心，收集沉淀，溶于50mmol/LTris-HCl，pH8.2，并透析，離心，取上清上親和柱benzamidine-S印haroseCL-4B，用含0.5mol/LNaCl的上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰。用50mmol/LTris-HCl,pH8.2緩沖液稀釋，上陰離子交換柱MonoQ，用含0.5mol/LNaCl上述緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，最后，上用相同緩沖液平衡好的SephacrylS-200柱，收集活性峰。SDS-PAGE電泳檢測純度達(dá)97。/。以上。凍干，存于-20。C。實施例7按照臨床研究指導(dǎo)原則，體內(nèi)凝血試驗采用小鼠斷尾法。結(jié)合巴曲酶臨床用量情況，小鼠用藥劑量按人的用藥劑量作相應(yīng)的調(diào)整，選擇中等用藥濃度lu/kg。取健康小鼠，隨機(jī)分為7組，每組5只，小鼠尾靜脈注射0.5ml,并于注射后15分鐘時，用剪刀在距小鼠尾尖0,3cm處剪斷，血液自行流出后立即計時，到血液凝固停止計時。以出血時間縮短作為判斷止血效果的指標(biāo)。同時用生理鹽水作為陰性對照，用從蛇毒中提取的巴曲亭做陽性對照。結(jié)果見下表表1類凝血酶(巴曲酶)體內(nèi)凝血試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果:用藥組小鼠剪尾出血時間與陰性對照組相比均有不同程度的縮短(33.8%43.0%)。其中突變和未突變的重組巴曲酶的止血時間短于蛇毒中提取的巴曲酶，但差別不是很顯著。權(quán)利要求1、一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動物血漿凝固，其特征在于所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶的氨基酸序列相對于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變?yōu)長ys，具體為1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNRKFMRIHLGKHAGSVANYDEVVRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP2、按照權(quán)利要求l所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述具有生物活性的定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，通過將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因在酵母菌中，或者在CHO細(xì)胞或其它哺乳動物細(xì)胞中，以分泌表達(dá)的方式大量產(chǎn)生獲得。3、按照權(quán)利要求2所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述酵母菌為甲醇酵母菌。4、按照權(quán)利要求3所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)時，依據(jù)巴曲酶的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列。5、按照權(quán)利要求4所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)時，將人工合成的定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因插入到甲醇酵母菌表達(dá)載體;iva^:或p戶/cz"中。6、按照權(quán)利要求4或5所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于所述人工合成定點(diǎn)突變的巴曲酶結(jié)構(gòu)基因序列為1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTTTGGCTTT51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTTTGATTAACCAAG101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAAAGTTTATGAGAATTCAT151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA301CATATTGCTCCATTGTCTTTGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTTTGT451AGAGAAGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACTTTGTGTGCTGGTGTTTT501GCAAGGTGGTATTGATACTTGTGGTGGTGATTCTGGTGGTCCATTGATTT551GTAACGGTCAATTTCAAGGTATTTTGTCTTGGGGTTCTGATCCATGTGCT601GAACCAAGAAAGCCAGCTTTTTACACTAAGGTTTTTGATTACTTGCCATG651GATTCAATCTATTATTGCTGGTAACAAGACTGCTACTTGTCCA7、按照權(quán)利要求3所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中實現(xiàn)分泌表達(dá)時，利用酵母菌的a-信號肽，PHOl信號肽，或者利用巴曲酶的天然信號肽將巴曲酶移出細(xì)胞，其中在信號肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入KEX2蛋白酶識別序列。8、權(quán)利要求17之一所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶在制造止血藥物方面的用途。全文摘要一種定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶，能使含抗凝劑的動物血漿凝固，其特征在于所述定點(diǎn)突變的基因工程巴曲酶氨基酸序列相對于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突變?yōu)長ys。本發(fā)明能夠通過以分泌表達(dá)的方式大量生產(chǎn)具有較高的生物活性的定點(diǎn)突變基因工程巴曲酶。文檔編號C12N9/50GK101319207SQ20071001156公開日2008年12月10日申請日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日發(fā)明者蘭海英,梅徐,英李,沈文彧,王宏英,珊蘇,雁薛,薛百忠,欣高申請人:沈陽守正生物技術(shù)有限公司