專利名稱：巴曲酶的突變核苷酸序列、突變的α因子分泌信號序列和使用其制備巴曲酶的方法
巴曲酶的突變核苷酸序列、突變的α因子分泌信號序列和 使用其制備巴曲酶的方法發(fā)明背景 發(fā)明領域本發(fā)明涉及編碼巴曲酶的核苷酸序列和/或包含特定序列的突變的α因子分泌 信號序列、以及使用其的載體和轉化體。
背景技術：
一般地，毒液對哺乳動物包括人的凝血級聯(lián)和溶解纖維蛋白途徑的作用已研究 了很長時間，并且已分離且表征了數(shù)種有效試劑。已知在毒液中包括的各種組分直接 或間接影響纖維蛋白凝固、血小板聚集等等，因此被用作促凝血劑或抗凝血劑(Meaume， J.Toxicon，4 2558(1966) ；Matsui 等人，Biochim. Biophys. Acta.，1477 :146_156 (2000))。 某些組分已得到表征且廣泛用于血栓形成的診斷和治療。特別地，已積極進行關于通過切 割纖維蛋白肽使纖維蛋白原轉變成纖維蛋白的凝血酶樣酶的研究，已報告了超過20種蛋 白質，并且已表征了某些的cDNA。凝血酶樣酶最初水解纖維蛋白原分子的纖維蛋白肽A，以形成不像凝血酶(哺乳 動物天然血液凝固蛋白質)的不穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊(des-A-纖維蛋白)，但這種不穩(wěn)定的 纖維蛋白凝塊通過體內纖維蛋白溶解系統(tǒng)隨著時間被快速降解，以最終降低血液纖維蛋白 原水平(Pirkle，H.和 Stocker，K. Thromb. Haemost，65 444-450 (1991) ；Marsh,N. A. ,Blood Coagu1. Fibrinolysis, 5 :339_410(1994))。因此，通過使用酶的這些兩面特征，凝血酶樣酶在臨床領域中被用作止血劑或血 栓形成的治療和預防試劑。這種酶對其他凝血因子和血小板激活沒有影響，由于這個優(yōu)點， 在手術前1-2小時靜脈內或肌內注射少量酶(2NIH單位/60kg)顯示有效的止血活性。另一 方面，通過控制酶的劑量和施用時間，可以降低血液纖維蛋白原水平而不引起在使用血栓 溶解酶時可能發(fā)生的副作用，例如出血。在上述過程期間形成的des-A-纖維蛋白和FDP (纖 維蛋白原降解產(chǎn)物)的釋放刺激血液內皮細胞，以誘導纖溶酶原激活物產(chǎn)生。該酶被用作 血栓形成的治療和預防試劑，因為該酶可以抑制凝血酶活性(Schumacher等人，Thromb. Res.，81 187-194 (1996)；和 Bell W, R. Jr. , Drugs, 54 18-30 (1997)) 近來，據(jù)報告凝血酶樣酶的這種纖維蛋白原減少效應對治療肝素誘發(fā)的血 小板減少癥或由肝素施用造成的急性缺血性中風有效(Dempfle等人，Blood,96 2793-2802(2000))。臨床上使用的所有凝血酶樣酶都是從毒液中分離并純化的天然蛋白質。從Latin 毒蛇邁阿密矛頭蝮蛇(Bothrops atrox moojeni)的毒液中分離的巴曲酶可以從Italian Solco Basle Ltd. Company和Swiss Pentapharm Company通過商購獲得，并且作為商品名 如立止血(r印tilase，用于止血)、去纖酶(用于溶栓)、立止血試劑(用于診斷試劑)銷 售。從Latin毒蛇美洲矛頭蝮蛇(Bothrops jararaca)的毒液中分離的巴曲酶(用于止血，
3Italian Ravizza Company),Π^ β (Calloselasma rhodostoma)的_夕夜中
分離的 Malayan pit viper 禾口 Ancrod(American Knoll PharmaceuticalCompany)也是可 以通過商購獲得的。近來，使用巴曲酶作為自體纖維蛋白粘合劑用于手術操作中的出血預防和縫合的 Vivostat System (Denmark, Vivosolution Co.)也是弓I 人注目的。同樣地，產(chǎn)生重組蛋白質的方法已由眾多研究者進行了深入研究，因為大量生產(chǎn) 從蛇中純化的巴曲酶是有限的。在微生物中表達來自真核生物的蛋白質的研究中，由于在 真核基因轉錄后的翻譯中具有大腸桿菌(原核生物)的低翻譯效率的基因密碼子，蛋白質 表達減少。為了克服這一點，通常通過使用重組大腸桿菌菌株進行改善蛋白質翻譯的方 法，其中將外源真核tRNA基因轉化到所述大腸桿菌菌株內，以識別在大腸桿菌中具有低頻 率的氨基酸密碼子。盡管存在這些努力，但在大腸桿菌中表達的蛋白質的重折疊過程中產(chǎn) 生無活性蛋白質(Yang 等人，Biotechnol. Lett. ,25 101-104(2003) ；Fanetal.，Biochem. Mol. Biol. Int.，47 :217_225 (1999) ；Maeda 等人，J. Biochem.，109 :632_637 (1991))。如迄 今為止報告的，仍未報告其中重組凝血酶樣酶在大腸桿菌中表達且隨后具有與天然酶的比 活性相比較而言相似活性的任何成功案例。本申請全文中提及了各種出版物和專利，并且在括號中提供了引證。這些出版物 和專利整體的公開內容在此通過引用合并入本申請，以便充分描述本發(fā)明和本發(fā)明所屬領 域的技術水平。發(fā)明詳述本發(fā)明人已進行深入研究，以開發(fā)在酵母特別是畢赤酵母屬(Pichia)中高產(chǎn)率 的重組巴曲酶的表達系統(tǒng)。作為結果，我們已發(fā)現(xiàn)通過使用突變的巴曲酶cDNA或突變的編 碼α因子前導肽的核苷酸序列，可以以較高產(chǎn)率收集生物學上有活性的重組巴曲酶。因此，本發(fā)明的一個目的是提供編碼巴曲酶的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供包含所述核苷酸序列的載體。本發(fā)明的另外一個目的是提供由該載體轉化的轉化體。本發(fā)明的進一步目的是提供重組巴曲酶的制備方法。本發(fā)明的再進一步目的是提供編碼α因子分泌信號肽的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供包含所述核苷酸序列的載體。本發(fā)明的另外一個目的是提供由該載體轉化的轉化體。本發(fā)明的進一步目的是提供重組巴曲酶的制備方法。根據(jù)下述詳述連同隨附的權利要求和附圖，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將是顯而易 見的。在本發(fā)明的一個方面，提供了編碼巴曲酶的核苷酸序列，其中包含SEQ ID NO :3、 NO :5或NO :7的核苷酸序列。本發(fā)明人已進行深入研究，以開發(fā)在酵母特別是畢赤酵母屬中高產(chǎn)率的重組巴曲 酶的表達系統(tǒng)。作為結果，我們已發(fā)現(xiàn)通過使用突變的巴曲酶cDNA或突變的編碼α因子 前導肽的核苷酸序列可以以較高產(chǎn)率收集生物學上有活性的重組巴曲酶。本發(fā)明中代表的SEQ ID NO :3、Ν0 5或NO 7的核苷酸序列包括這些核苷酸序列， 以在酵母中，優(yōu)選在畢赤酵母屬中有關的微生物中，并且最優(yōu)選在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中，以高產(chǎn)率表達巴曲酶。術語“核苷酸序列”在本文中用于指具有經(jīng)修飾的糖或堿基的類似物以及天然 核昔酸(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ；UhIman 禾口 Peyman, Chemical Reviews,90 :543_584(1990))。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的核苷酸序列是SEQ ID NO :5或NO :7，且最優(yōu)選 是 SEQ ID NO :7ο如下文實施例中舉例說明的，與天然存在的編碼巴曲酶的序列相比較，通過使用 本發(fā)明的核苷酸序列，以4-13倍產(chǎn)率獲得重組巴曲酶。在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含上述編碼巴曲酶的核苷酸序列的載體。本發(fā)明的載體系統(tǒng)可以通過本領域技術人員已知的各種方法進行構建，所述方法 公開于 Sambrook 等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，所述參考文獻通過引用合并入本文。一般地，本發(fā)明的載體可以構建為克隆或表達載體。本發(fā)明的載體利用酵母，優(yōu)選 畢赤酵母屬中有關的微生物，并且更優(yōu)選巴斯德畢赤酵母，作為宿主。使用酵母如巴斯德畢赤酵母作為宿主，本發(fā)明的載體利用基因的啟動子，所述基 因例如醇氧化酶ι (A0X1)、醇氧化酶2(A0X2)、3_磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛 脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變 位酶或丙酮酸激酶，并且最優(yōu)選醇氧化酶I(AOXl)的啟動子。為了以簡單方式純化由本發(fā)明的載體表達的巴曲酶，其他序列可以與之融合。例 如，融合序列包括谷胱甘肽-S-轉移酶(Pharmacia，USA)、麥芽糖結合蛋白質(NEB，USA)、 FLAGdBI, USA)和6xHis (六組氨酸；Quiagen，USA)等等。由于存在用于純化的添加序列， 所以可以通過親和色譜法以高通量和簡單方式純化宿主中表達的蛋白質。另一方面，本發(fā)明的表達載體包括本領域普通技術人員已知的抗生素抗性基因作 為選擇標記，例如針對氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉 素和四環(huán)素的抗性基因。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的載體包括編碼分泌信號肽的核苷酸序列。更優(yōu) 選地，本發(fā)明的載體包括編碼α因子分泌信號肽的核苷酸序列作為分泌信號肽，且最優(yōu)選 是由SEQ ID Ν0:11突變的編碼α因子分泌信號肽的核苷酸序列。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的載體是具有

圖19的基因圖的載體。優(yōu)選地， ColEl代表圖19中pBR322衍生的復制起點，并且大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和酵母 的組氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作選擇標記，啟動子基因衍生自酵母的醇氧化酶 1(A0X1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO :3、N0 :5或NO :7的核苷酸序列，并且α因子分泌信 號序列包括由SEQ ID Ν0:11突變的α因子分泌信號肽序列。在本發(fā)明的另外一個方面，提供了被包含編碼巴曲酶的核苷酸序列的載體轉化的 轉化體。本發(fā)明的載體在其中穩(wěn)定且相繼地克隆且表達的宿主細胞也利用本領域技 術人員已知的酵母細胞中的任何一種，例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica) > 多形漢森酵母(Hansenulapolymorpha)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)禾口栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
最優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的宿主細胞是巴斯德畢赤酵母。巴斯德畢赤酵母是一 類甲醇酵母，并且具有幾個優(yōu)點(i)以低成本在培養(yǎng)基中快速和方便的生長，(ii)蛋白質 的大量表達。在包含AOXl啟動子的載體中，通過向培養(yǎng)基中加入甲醇可強烈誘導蛋白質表 達。在包含α因子分泌信號肽的載體中，通過所需巴曲酶分泌到培養(yǎng)基內可容易地進行蛋 白質純化。將本發(fā)明的載體遞送到宿主細胞內的系統(tǒng)包括CaCl2方法(Cohen，S.N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA，9 :2110-2114 (1973) )、Hanahan 方法(Cohen, S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA, 9 2110-2114 (1973)；和 Hanahan，D.，J. Mol. Biol.，166 557-580(1983))、顯微注射(Capecchi，M. R.，Cell, 22 :479 (1980))、磷酸鈣沉淀(Graham,
F.L.等人，Virology，52 456 (1973))、電穿孔(Neumann, E.，等人，EMBO J.，1 841 (1982))、 脂質體介導的轉染(Wong, Τ. K.等人，Gene，10 :87 (1980))、DEAE-葡聚糖處理(Gopal, Mol. Cell Biol.，5 1188-1190 (1985))和基因轟擊(Yang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci，87 9568-9572(1990))。在本發(fā)明的另外一個方面，提供了重組巴曲酶的制備方法，其包括步驟(a)使用 本發(fā)明的載體轉化宿主細胞；和(b)培養(yǎng)經(jīng)轉化的細胞以提供重組巴曲酶。經(jīng)轉化的細胞的培養(yǎng)可以通過本領域技術人員已知的各種方法來進行。微生 物培養(yǎng)和發(fā)酵的詳細描述公開于Kubitschek，H. E.，Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs, NJ. :Prentice_Hall, Inc. , 1970 ；Mandelstam, J.，等人，Biochemistry of Bacterial Growth,第 3 版Oxford :Blackwell, 1982 ;Meynell,
G.G.,等人，Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第 2 版 Cambridge Cambridge University Press,1970 ；禾口 Gerhardt, P.,編輯，Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington :Am. Soc. Microbiol, 1981 Ijf1SIffi 合并入本文。例如，經(jīng)轉化的細胞通過接種在BMG(緩沖的小量甘油)液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)， 并且當細胞密度達到預定點時，通過向培養(yǎng)基中加入甲醇誘導通過AOXl啟動子的巴曲酶 蛋白質表達，獲得分泌到培養(yǎng)基內的巴曲酶。根據(jù)本領域技術人員已知的各種純化方法以純化形式收集分泌到培養(yǎng)基內的巴 曲酶。例如，使用純化方法例如使用硫酸銨的溶解度分級、大小分級過濾(超濾)和各種色 譜法(使用大小、電荷、疏水性或親和力的分離)，獲得純化形式的巴曲酶。在本發(fā)明的一個方面，提供了由SEQ ID NO 11的核苷酸序列組成的編碼α因子 分泌信號肽的核苷酸序列。由SEQ ID NO=Il的核苷酸序列組成的編碼α因子分泌信號肽的核苷酸序列包括 所述核苷酸序列，以在酵母中，優(yōu)選在畢赤酵母屬中有關的微生物中，并且最優(yōu)選在巴斯德 畢赤酵母中，以高產(chǎn)率比表達蛋白質。術語“核苷酸序列”在本文中用于指具有經(jīng)修飾的糖或堿基的類似物以及天然 核昔酸(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ；UhIman 禾口 Peyman, Chemical Reviews,90 :543_584(1990))。如下文實施例中舉例說明的，與用天然的編碼α因子分泌信號肽的序列相比較， 通過使用本發(fā)明的核苷酸序列，以高約2-3倍的產(chǎn)量獲得到重組蛋白質(例如巴曲酶)。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了包括核苷酸序列的載體，所述核苷酸序列包含突 變的α因子分泌信號。本發(fā)明的載體系統(tǒng)可以通過本領域技術人員已知的各種方法進行構建，所述方法 公開于 Sambrook 等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中，所述參考文獻通過引用合并入本文。一般地，本發(fā)明的載體可以構建為克隆或表達載體。本發(fā)明的載體利用酵母，優(yōu)選 畢赤酵母屬中有關的微生物，并且更優(yōu)選巴斯德畢赤酵母，作為宿主。使用酵母如巴斯德畢赤酵母作為宿主，本發(fā)明的載體利用基因的啟動子，所述基 因例如醇氧化酶ι (A0X1)、醇氧化酶2(A0X2)、3_磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、3-磷酸甘油醛 脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變 位酶或丙酮酸激酶，并且最優(yōu)選醇氧化酶I(AOXl)基因的啟動子。為了以簡單方式純化由本發(fā)明的載體表達的蛋白質，其他序列可以與之融合。例 如，融合序列包括谷胱甘肽-S-轉移酶(Pharmacia，USA)、麥芽糖結合蛋白質(NEB，USA)、 FLAGdBI, USA)和6xHis (六組氨酸；Quiagen，USA)等等。由于存在用于純化的添加序列， 所以可通過親和色譜法以高通量和簡單方式純化宿主中表達的蛋白質。另一方面，本發(fā)明的表達載體包括本領域普通技術人員已知的抗生素抗性基因作 為選擇標記，例如針對氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉 素和四環(huán)素的抗性基因。由本發(fā)明的載體表達的蛋白質并無特別限制，并且包括但不限于激素、激素類似 物、酶、酶抑制劑、信號轉導蛋白質或其部分、抗體或其部分、單克隆抗體、結合蛋白質或其 結合結構域、抗原、粘附蛋白質、結構蛋白質、調節(jié)蛋白質、毒性蛋白質、細胞因子、轉錄因 子、血液凝固因子和植物防御相關蛋白質。優(yōu)選地，由本發(fā)明載體表達的蛋白質是巴曲酶。優(yōu)選地，SEQID NO :1、NO :3、NO 5 或 NO 7 的核苷酸序列，更優(yōu)選 SEQ ID NO :3、 NO :5或NO :7的核苷酸序列，且最優(yōu)選地SEQ ID NO :5或NO :7的核苷酸序列在巴曲酶表達 中使用的本發(fā)明載體中用作編碼巴曲酶的序列。在酵母中，優(yōu)選在畢赤酵母屬中有關的微 生物中，并且最優(yōu)選在巴斯德畢赤酵母中，SEQ ID NO :3、NO :5或NO :7的核苷酸序列以高 產(chǎn)率表達巴曲酶。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的載體是具有圖19的基因圖的載體。優(yōu)選地， ColEl在圖19中代表pBR322衍生的復制起點，并且大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和酵母 的組氨酸氨基酸生物合成基因(His4)用作選擇標記，啟動子基因衍生自酵母的醇氧化酶 1 (A0X1)。巴曲酶基因包括SEQ ID NO =UNO 3、NO :5或NO :7的核苷酸序列，并且α因子 分泌信號序列包括由SEQ ID Ν0:11突變的α因子分泌信號肽序列。在本發(fā)明的另外一個方面，提供了通過上文描述的載體轉化的轉化體。本發(fā)明的載體在其中穩(wěn)定且相繼地克隆且表達的宿主細胞也利用本領域技術人 員已知的酵母細胞中的任何一種，例如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、多形漢森酵母、釀 酒酵母和栗酒裂殖酵母。最優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的宿主細胞是巴斯德畢赤酵母。巴斯德畢赤酵母是一 類甲醇酵母，并且具有幾個優(yōu)點(i)以低成本在培養(yǎng)基中快速和方便的生長，(ii)蛋白質 的大量表達。在包含AOXl啟動子的載體中，可通過向培養(yǎng)基中加入甲醇強烈誘導蛋白質表達。在包含α因子分泌信號肽的載體中，通過所需巴曲酶分泌到培養(yǎng)基內可容易地進行蛋 白質純化。將本發(fā)明的載體遞送到宿主細胞內的系統(tǒng)包括CaCl2方法(Cohen，S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA，9 :2110-2114 (1973) )、Hanahan 方法(Cohen, S. N.等 人，Proc. Natl. Acac. Sci USA, 9 2110-2114 (1973)；和 Hanahan，D.，J. Mol. Biol.，166 557-580(1983))、顯微注射(Capecchi, M. R.，Cell, 22 :479 (1980))、磷酸鈣沉淀(Graham,
F.L.等人，Virology，52 456 (1973))、電穿孔(Neumann, E.，等人，EMBO J.，1 841 (1982))、 脂質體介導的轉染(Wong, Τ. K.等人，Gene，10 :87 (1980))、DEAE-葡聚糖處理(Gopal, Mol. Cell Biol.，5 1188-1190 (1985))和基因轟擊(Yang 等人，Proc. Natl. Acad. Sci，87 9568-9572(1990))。在本發(fā)明的另外一個方面，提供了重組巴曲酶的制備方法，其包括步驟(a)使用 本發(fā)明的載體轉化宿主細胞；和(b)培養(yǎng)經(jīng)轉化的細胞以提供重組巴曲酶。經(jīng)轉化的細胞的培養(yǎng)可以通過本領域技術人員已知的各種方法來進行。微生 物培養(yǎng)和發(fā)酵的詳細描述公開于Kubitschek，H. E.，Introduction to Research with Continuous Cultures.EnglewoodCliffs, NJ. Prentice-Hall, Inc. , 1970 ；Mandelstam, J.，等人，Biochemistry of Bacterial Growth,第 3 版 Oxford :Blackwell, 1982 ;Meynell,
G.G.,等人，Theory and Practice in ExperimentalBacteriology,第 2 版 Cambridge Cambridge university Press,1970 ；禾口 Gerhardt， P.，編輯，Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington :Am. Soc. Microbiol, 1981 Ijf1SIffi 合并入本文。例如，經(jīng)轉化的細胞通過接種在BMG(緩沖的小量甘油)液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)， 并且當細胞密度達到預定點時，通過向培養(yǎng)基中加入甲醇誘導通過AOXl啟動子的蛋白質 表達，獲得分泌到培養(yǎng)基內的蛋白質。根據(jù)本領域技術人員已知的各種純化方法以純化形式收集分泌到培養(yǎng)基內的蛋 白質。例如，使用純化方法，例如使用硫酸銨的溶解度分級、大小分級過濾(超濾)和各種 色譜法(使用大小、電荷、疏水性或親和力的分離)，獲得純化形式的蛋白質。本發(fā)明的特征和優(yōu)點概括如下(i)本發(fā)明的編碼巴曲酶的核苷酸序列在酵母、特別是巴斯德畢赤酵母中顯示出 極佳的表達效率，并且重組巴曲酶以比天然存在的編碼巴曲酶的序列高4-13倍的產(chǎn)率獲得。(ii)本發(fā)明的突變的α因子分泌信號肽序列也導致重組巴曲酶的產(chǎn)量高約2-3倍。(iii)因此，使用本發(fā)明的編碼巴曲酶的核苷酸序列以及突變的α因子分泌信號 肽序列的蛋白質表達系統(tǒng)以比天然存在的編碼巴曲酶的序列高約20倍的產(chǎn)率獲得重組巴 曲酶。(iv)與天然存在的巴曲酶相比較，使用本發(fā)明的序列制備的重組巴曲酶具有極佳 的活性。(ν)使用本發(fā)明的序列制備的重組巴曲酶具有顯著的可靠的穩(wěn)定性。附圖簡述
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圖1代表使天然巴曲酶cDNA和本發(fā)明的突變的cDNA的表達相比較的 SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)。圖2代表使天然巴曲酶cDNA和本發(fā) 明的突變的cDNA的表達相比較的Western印跡。在圖1和圖2中，每個泳道如下泳道1， 對照(包含天然cDNA的pPIC-rBat)；泳道2，突變的重組克隆(pBatMd)；泳道3，pBatMx ； 泳道4，pBatSMx ；泳道M，分子大小標記；泳道5，分泌信號SMF取代的天然rbat ；泳道6， SMFbatMd ；泳道 7，SMFBatMx ；和泳道 8，SMFBatSMx。圖3代表用內切酶H處理的SDS-PAGE，以檢查巴曲酶蛋白質的糖基化。泳道1、泳 道2、泳道3、泳道4的每個條帶代表衍生自天然rbat、SMFBatMd, SMFBatMx, SMFBatSMx的 完整巴曲酶；泳道5，天然rbat ；泳道6，SMFBatMd ；泳道7，SMFBatMx ；和泳道8，SMFBatSMx。圖4-5是代表重組巴曲酶的純化的色譜圖。圖4和圖5分別是苯基_瓊脂糖和肝 素-瓊脂糖色譜圖。通過使用SMFBatSMx基因制備重組巴曲酶。箭頭指示包含最高量的重 組巴曲酶的級分。圖6是通過使用各種核苷酸序列制備的重組巴曲酶的制備產(chǎn)率的曲線圖。圖7代表通過使用SMFBatSMx基因制備的重組巴曲酶的MALDI-TOF分析。圖8-9分別是分析通過天然和重組巴曲酶的血液凝固的曲線圖。圖10代表通過經(jīng)由使用各種核苷酸序列制備的重組巴曲酶的纖維蛋白凝固活性 的曲線圖。圖11-12代表通過經(jīng)由使用各種核苷酸序列制備的重組巴曲酶的纖維蛋白凝固 活性的反相酶譜法(zymographies)。圖13-14是代表在重組巴曲酶的動物模型系統(tǒng)中減少出血時間(圖13)和全血凝 固時間(圖14)的活性的曲線圖。圖15-17是測量PT(凝血酶原時間，圖15)、APTT(活化的部分凝血活酶時間，圖 16)和TT (凝血酶時間，圖17)的曲線圖。圖18是關于重組巴曲酶的pH穩(wěn)定性的曲線圖。圖19代表本發(fā)明的載體的基因圖。5' A0X1,5' AOXl基因的啟動子；3' AOXl, 3' AOXl基因的啟動子；氨芐青霉素，氨芐青霉素抗性基因；His4，His4基因的開放讀碼框； MF- α , α因子分泌信號序列；CoIEl，pBR322衍生的起點；巴曲酶，巴曲酶基因?，F(xiàn)在將通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明。對于本領域技術人員顯而易見的是， 這些實施例意欲更具體地舉例說明，并且如隨附權利要求書中闡述的本發(fā)明的范圍并不限 于實施例或受實施例限制。
實施例實施例1 毒液衍生的天然巴曲酶cDNA克隆邁阿密矛頭蝮蛇的成熟形式巴曲酶的催化結構域獲自包含pPIC-rBat載體(酵 母表達載體)的GSrBAT菌株(專利申請
發(fā)明者孫英德, 洪性洧, 申志勛, 鄭光會, 金京俊, 金范俊, 金鈺奐, 黃載勛 申請人:Biobud有限公司