專利名稱：一種巴曲酶及其制備方法與專用編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巴曲酶及其制備方法與專用編碼基因。
背景技術(shù)：
1963年，Klobusitzi和Konig從美洲矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶，即巴曲酶。迄今為止，已得到三十多種類凝血酶的全部和部分氨基酸序列，它們的一級結(jié)構(gòu)非常相似，這些凝血酶都能夠酶切哺乳動物的血漿纖維蛋白原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，從而影響動物的出血-凝血過程。在這些蛇毒類凝血蛋白酶中，尤其對巴曲酶和安克洛(Ancrod)的物理、化學(xué)性質(zhì)與臨床應(yīng)用，研究的較為清楚(Stocker K andBariow G.H.Methods Enzymol.1976，45214-223)。
巴曲酶的特異性作用底物是纖維蛋白原，與凝血酶不同的是，它只切割纖維蛋白原的A鏈，而不作用B鏈。當(dāng)它水解血漿纖維蛋白原A鏈中的Arg16-GLy17位鍵時，能夠釋放出纖維蛋白肽A，從而快速地將血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，接著這些纖維蛋白就能聚集成疏松的易于被纖維蛋白酶水解的血栓來封閉傷口，實現(xiàn)快速止血的功效。在使用較大劑量的時侯，巴曲酶有降低血中纖維蛋白原濃度，改善血液黏度和血液的流體力學(xué)特性，從而起到降纖酶的功效(Pirkle H and Stocker K.Thromb Haemost.1991，65444-450；MarshN.A.Blood Coagul Fibrinolysis.1994，5339-410)。基于這樣一些生物化學(xué)特性，巴曲酶已經(jīng)被成功地開發(fā)成止血藥和降纖藥。有高效止血功能的制劑(國外商品名Reptilase，中文譯名“立止血”，另外還含有凝血因子X激活物)；有降纖作用的制劑(國外商品名Defibrase，中文譯名“降纖酶”)。在歐洲，巴曲酶正在替代人凝血酶作為止血藥物。
目前在我國上市7種蛇毒毒液中分離純化的類凝血酶制劑。臨床使用歷史最悠久的類凝血酶是巴曲酶和馬來西亞紅口蝮蛇(A.rhodostoma)蛇毒的安克洛。國內(nèi)有五步蛇毒祛纖酶、東北白眉蝮蛇抗栓酶(清栓酶)、江浙蝮蛇抗栓酶和‘立止血’仿制品‘巴曲亭’(該藥(保護(hù)期為2001.8.21-2007.8.21>也是從蛇毒中提取制備而成)等用于臨床。但是從蛇的毒液中提取巴曲酶的生產(chǎn)成本太高。
巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈，但是巴曲酶分子中有12個半氨酸，形成六種分子內(nèi)二硫鍵；還有糖基化修飾，其分子內(nèi)有兩個N-糖基化位點(diǎn)Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr227。成熟的巴曲酶分子是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白，理論計算出其分子量為25.5kD，等電點(diǎn)為7.39，國外從B.atrx.moojuni毒液中生物提取的巴曲酶的實際分子量為42kD，這種分子量的偏差是由于糖基化修飾緣故。此外，B.atrox的其它亞種以及其它種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不過其分子量從29kD到42kD不等，這也是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。雖然研究者對巴曲酶的性質(zhì)有了比較多的了解，但是，對這種蛇毒成分的分子生物學(xué)研究一直進(jìn)展緩慢。1991年，日本科學(xué)家Maeda等首次利用重組DNA技術(shù)得到了B.atrox moojenii類凝血酶的基因，并克隆到大腸桿菌中獲得融合表達(dá)(MAEDA M，SATOH S，SUZUKI S，et al.J Biochem.1991，109632-637)。2002年，楊青等報道長白白眉蝮類凝血酶Gussruobin和大連蛇到蝮類凝血酶Gloshedobin在畢氏酵母中獲得表達(dá)(楊青，胡學(xué)軍，許小明，等.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報.2002，34(1)6-10)。2004年，K.H.Chung等亦是采用畢氏酵母表達(dá)B.atrox.moojuni的巴曲酶，具有與天然巴曲酶相同的生物學(xué)活性，純化后產(chǎn)量達(dá)到6.95μg/ml(Weon-Kyoo You，Kwang-Hoe Chung，et al.FEBS.2004，57167-73)。2004年，中國的黃秀東等(中國專利公告號為CN1534093)采用畢氏酵母表達(dá)B.atrox.moojuni的巴曲酶，純化后產(chǎn)量達(dá)到20KU/ml。
采用基因工程的手段生產(chǎn)富含二硫鍵和糖基化修飾的蛋白一直都是一個技術(shù)難題，尤其是生產(chǎn)有多對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶類分子。這是因為二疏鍵配對錯誤率很高，在原核中得到的幾乎全是包涵體。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(酵母、CHO和昆蟲細(xì)胞等)中能保證較高二硫鍵配對正確率。在真核生物中分泌蛋白的折疊和組裝是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)上完成的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有許多分子伴侶(molecular chaperone)。分子伴侶的概念為在生物大分子的折疊(folding)、組裝(assembly)、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解等過程中起協(xié)助作用，參與協(xié)助抗原的呈遞和遺傳物質(zhì)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及構(gòu)象的確立；參與細(xì)胞周期調(diào)控、抗衰老、凋亡調(diào)控等，但自身并不發(fā)生任何變化的一大類廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子。如結(jié)合蛋白(Kar2p，binding protein，Bip)，它能夠識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的信號序列(signal sequence)；Bip蛋白還具有ATP酶活性，能夠水解ATP提供其作用于蛋白質(zhì)折疊所需的能量；蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)可輔助二硫鍵的正確配對。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種巴曲酶及其制備方法與專用編碼基因。
本發(fā)明所提供的制備巴曲酶的專用基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經(jīng)替換1-3個堿基，編碼相同功能蛋白的核苷酸序列；3)在1)所述序列的5′端連接IL-2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。
4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)、2)或3)所述序列的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
所述IL-2信號肽基因的核苷酸序列為自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
所述編碼基因具有下述的核苷酸序列之一
1)序列表中序列2；2)序列表中序列4；3)序列表中序列6；4)序列表中序列8。
本發(fā)明所提供的制備巴曲酶的方法，是將上述的編碼基因通過真核表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌或哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)，獲得巴曲酶蛋白。
所述方法中，所述酵母菌可為畢赤酵母，優(yōu)選為畢赤酵母GS115/His-。
所述哺乳動物細(xì)胞系為CHO細(xì)胞系。
當(dāng)所述編碼基因?qū)虢湍妇袝r，所述真核表達(dá)載體為pPIC9；當(dāng)所述編碼基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞系中時，所述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1。
所述編碼基因?qū)虢湍妇l(fā)酵表達(dá)所用發(fā)酵培養(yǎng)基含有山梨醇和大豆蛋白胨。所述編碼基因?qū)虢湍妇l(fā)酵表達(dá)的方法優(yōu)選為在30℃，pH5.0，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基終發(fā)酵20小時后，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，饑餓30分鐘，再加入3g大豆蛋白胨，調(diào)pH至6.9，按0.2ml/min加入含0.2％體積山梨醇的甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)90小時；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為40g/L甘油，18g/L K2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/L H3PO4。
所述方法還包括將表達(dá)獲得的巴曲酶蛋白進(jìn)行純化。其中，酵母表達(dá)巴曲酶的純化方法為將發(fā)酵上清液加入2M硫酸銨鹽等預(yù)處理后，先經(jīng)過疏水層析介質(zhì)(STREAMLINETMPhenyl)，再經(jīng)過陽離子交換介質(zhì)(SP SepharoseTMFF)和肝素瓊脂糖凝膠FF介質(zhì)(HeparinSepharose FF)，最后再進(jìn)行一步凝膠過濾層析(SephacrylS-100)就可以制備出巴曲酶純品。
上述的方法制備的巴曲酶蛋白也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述巴曲酶蛋白的核苷酸序列是1)序列表中序列1；2)序列1的氨基端第59位Ala突變?yōu)锳rg的氨基酸序列(序列表中序列5)；3)序列1的氨基端第128位Thr突變?yōu)锳rg的氨基酸序列(序列表中序列7)；4)序列1的氨基端連接IL-2信號肽的氨基酸序列(序列表中序列3)；所述IL-2信號肽的氨基酸序列為自GENBANK號為NP_000577的氨基端第1-20位氨基酸序列。
本發(fā)明選擇酵母和CHO細(xì)胞都喜好的遺傳密碼子，人工合成了巴曲酶全長基因序列，將該基因分別插入到Pichia pastoris的分泌型表達(dá)載體pPIC9類載體和CHO細(xì)胞的表達(dá)載體pcDNA3.1中進(jìn)行分泌表達(dá)，成功地表達(dá)出了生物學(xué)活性高的巴曲酶蛋白。通過優(yōu)化發(fā)酵過程中的一系列條件，如加入一定量的山梨醇(有利于酵母產(chǎn)生更多的基礎(chǔ)蛋白包括分子伴侶，糖基化酶等)和大豆蛋白胨(可以延緩分泌蛋白的降解)，純化后產(chǎn)量達(dá)到每毫升發(fā)酵液10μg/ml或14巴曲酶單位(14BU/ml)，比活性為1400BU/mg。這一產(chǎn)量超過了其它已發(fā)表和報道的表達(dá)水平，適合規(guī)模化生產(chǎn)。
本發(fā)明的方法利用上述制備巴曲酶的專用基因，由酵母、CHO細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化的巴曲酶、突變的巴曲酶，它們具有使含抗凝劑的動物血漿凝結(jié)的特性；所說的抗凝劑包括肝素、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、水蛭肽和水蛭素等；本發(fā)明的方法生產(chǎn)的巴曲酶的氨基酸序列(SEQ-1)與Bothrops atrox moojeni毒液中巴曲酶(Batroxobin)氨基酸序列相同或者突變了幾個氨基酸，但其分子的糖基化修飾具有酵母或哺乳動物細(xì)胞的特點(diǎn)，且這類修飾是其生物活性所必須的；并且用本發(fā)明的方法在酵母中表達(dá)該巴曲酶，可以利用酵母的α-信號肽，其中信號肽序列與巴曲酶蛋白之間插入了KEX2蛋白酶識別序列，可以使表達(dá)的蛋白經(jīng)KEX2蛋白酶切后具有與自然的巴曲酶同樣的N端。
本發(fā)明的方法制備的巴曲酶和突變的巴曲酶可作為一種止血藥的主要成分，也可以直接作為降纖維藥之用。


圖1為巴曲酶基因表達(dá)載體pPIC9-BG0的構(gòu)建圖2為巴曲酶突變體基因(圖中均用BGm表示BGm1、BGm2、BGm3、BGm4)表達(dá)載體pPIC9-BGm1、pPIC9-BGm2、pPIC9-BGm3、pPIC9-BGm4(圖中均用pPIC9-BGm表示)的構(gòu)建流程3為pPIC9-BG0轉(zhuǎn)化GS115后菌落PCR鑒定結(jié)果圖4為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的不同發(fā)酵時間(0-90小時)的SDS-PAGE電泳圖譜圖5為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的疏水層析介質(zhì)分析圖譜(STREAMLINETMPhenyl)圖6為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的陽離子交換介質(zhì)分析圖譜(SP SepharoseTMFast Flow)圖7為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的肝素瓊脂糖凝膠FF介質(zhì)(Heparin Sepharose FF)分析圖譜圖8為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的凝膠過濾層析圖譜(SephacrylS-100)圖9為BG0在酵母中表達(dá)的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖10為BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白的分子量質(zhì)譜11為CH0表達(dá)的巴曲酶蛋白的SDS-PAGE電泳圖12為巴曲酶(2 NIH Units/kg)對小鼠出血時間的影響具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、重組巴曲酶基因BG0的合成及其表達(dá)巴曲酶的效果檢測1、重組巴曲酶基因BG0的獲得及表達(dá)載體的構(gòu)建
1)重組巴曲酶基因BG0的獲得根據(jù)Genebank中公開的巴曲酶(GENBANK Accession Number為X12747)的氨基酸序列資料，選擇酵母和CHO細(xì)胞都能較喜好的遺傳密碼子，人工合成了重組巴曲酶全長基因序列(具有序列表中序列2的核苷酸序列)。為使目的基因能插入pPIC9載體，在巴曲酶基因(Batroxobin Gene，BG)(GENBANK Accession Number為X12747自5′端第1-693位核苷酸)的5′-端添加限制酶XhoI的切點(diǎn)，3′-端添加TAA終止密碼以及EcoRI切點(diǎn)，另在XhoI切點(diǎn)與巴曲酶蛋白N-端第一個氨基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應(yīng)的密碼子AAA AGA，這就確保目的蛋白在分泌到發(fā)酵上清液中時能夠順利地切除a-信號肽序列，使工程菌表達(dá)的巴曲酶具有同蛇毒中提取的該蛋白一樣的N-端氨基酸序列。設(shè)計重組巴曲酶全長基因的核苷序列與Genebank Accession Number為X12747和黃秀東等合成的巴曲酶基因核苷酸序列(中國專利公告號為CN1534093)分別有18.9％和15.9％的差異。
基因的拼接過程采用遞歸式PCR(Recursive PCR)方法，具體方法為將整個基因分成相臨重疊的12個片段進(jìn)行合成，具體如下T15′-CTCGAGAAAAGAGTCATTGGAGGTGATGAATGTGACATCAACGAACACCCTTTCCTTGCCTTCATGTACTACTCTCCACG-3′；T25′-CAGTGTGCAGCGGTCAGGACCCATTCCTGGTTGATCAAAGTCATACCACAGAAGTAACGTGGAGAGTAGTACATGAAGGC-3′；T35′-CCTGACCGCTGCACACTGTAACAGAAGATTTATGCGTATCCACCTTGGTAAGCACGCCGGATCTGTCG-3′；T45′-CTTATTAGGACAAATGAACTTCTCCTTTGGGTATCTAACGACCTCATCGTAGTTGGCGACAGATCCGGCGTGC-3′；T55′-GGAGAAGTTCATTTGTCCTAATAAGAAGAAAAACGTCATTACCGACAAGGACATTATGTTGATCAGACTGGACAGACCTG-3′；T65′-CAACACTTGGAGGGTTGGAAGGCAAAGAGAGAGGAGCGATGTGTTCGGAGTTTTTGACAGGTCTGTCCAGTCTGATCAAC-3′；T75′-CCAACCCTCCAAGTGTTGGTTCCGTTTGCCGTATTATGGGATGGGGAGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTACCCAG-3′；T85′-GTAAGCCTCACGACAGACAGTATTGTTGAACAGGTTAATGTTAGCACAGTGAGGGACATCTGGGTAAGTGTCTTCAGAAG-3′；T95′-GTCTGTCGTGAGGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACCTTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGTATCGATACATGTGG-3′；T105′-CCCCAAGACAAGATTCCCTGGAATTGTCCATTACAGATCAGTGGTCCACCAGAGTCACCACCACATGTATCGATACCTCC-3′；T115′-GGGAATCTTGTCTTGGGGAAGTGATCCATGTGCCGAACCACGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTACCTTC-3′；
T125′-GAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATGATAGACTGAATCCATGGAAGGTAATCAAAGACCTTGG-3′。
以上述合成的12個片段T1-T12為模板，以5′端引物P15′-CAGCTCGAGAAAAGAGTCATTGGAG-3′；3′端引物P25′-CAGGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTG-3′為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系12段模板(7.5uM)各0.1μL，P1(15uM)和P2(15uM)各1μL，dNTP(各2.5mM)5μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL，10×KOD buffer 5μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應(yīng)程序94℃30s，51℃30s，72℃ 1min，25循環(huán)。最終獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)測序表明，該片段具有序列序列表中序列2的核苷酸序列，將其命名為BG0。自序列表中序列2的第13-705位核苷酸為巴曲酶編碼序列，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；自序列表中序列2的第1-12位核苷酸為KEX2蛋白酶識別序列的編碼序列。
2)在酵母中表達(dá)BG0的重組載體pPIC9-BG0的構(gòu)建(構(gòu)建流程圖如圖1所示)將最終PCR產(chǎn)物BG0回收，經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切，再1％瓊脂糖凝膠回收BG0片段，插入到pPIC9載體(購自Invetrogen公司)的XhoI和EcoRI酶識別位點(diǎn)之間，獲得的重組質(zhì)粒用LA(LB+100μg/ml Amp+)平板培養(yǎng)，挑選LA(LB+100μg/ml Amp+)平板上的單克隆，LA培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，XhoI和EcoRI雙酶切篩選含有BG0的克隆，用α-factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′測序引物分別從BG0的5′端和3′端進(jìn)行測序檢測，將檢測表明含有BG0的pPIC9重組載體命名為pPIC9-BG0。pPIC9-BG0中含有表達(dá)載體pPIC9可以用來轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115/His-。用質(zhì)粒提取試劑盒大量制備上述表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9-BG0，供轉(zhuǎn)化酵母之需。
2、BG0利用宿主菌GS115/His-生產(chǎn)巴曲酶即其活性檢測1)含有pPIC9-BG0重組菌的獲得將pPIC9-BG0用Bgl II線性化，轉(zhuǎn)化Pichia pastoris宿主菌GS115/His-，涂布組氨酸營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基MD(1.34％YNB，4×10-5生物素，1％葡萄糖，2g/100mL瓊脂)平板上得到重組GS115。用槍尖挑取少許在MD平板上生長出的酵母菌落，進(jìn)行菌落PCR驗證，以5′AOX1引物5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物。PCR反應(yīng)體系重組GS115菌落為模板，5′AOX1(15uM)和3′AOX1(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*rTaq buffer 2μL，ddH2O 15μL。PCR反應(yīng)程序94℃30s，55℃30s，72℃1分鐘，25循環(huán)。在重組過程中，如果pPIC9-BG0是插入到野生型GS115自身甲醇氧化酶基因5′AOX1或3′AOX1中，會形成Mut+(甲醇利用正常型)，如果pPIC9-BG0是替代野生型GS115自身甲醇氧化酶基因，會形成Muts(甲醇利用慢型)，所以，2200bp條帶為野生型GS115自身甲醇氧化酶基因的PCR產(chǎn)物，750bp條帶為BG0的PCR產(chǎn)物，即Mut+有兩條帶2200和750bp，Muts有一條帶750bp，Mut+和Muts均是含有pPIC9-BG0的陽性克隆。共篩選了50個含有pPIC9-BG0的陽性克隆。部分鑒定結(jié)果如圖3所示，圖3中泳道1，3和4為Mut+(甲醇利用正常型)的菌落PCR結(jié)果泳道2和5為Muts(甲醇利用慢型)的菌落PCR結(jié)果，泳道GS115為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的GS115/His-菌落PCR結(jié)果，泳道BG0為pPIC9-BG0的PCR結(jié)果，泳道m(xù)arker為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
2)巴曲酶的發(fā)酵生產(chǎn)巴曲酶的活性測定是利用巴曲酶能酶切纖維蛋白原，使含檸檬酸鈉的人血漿凝結(jié)這一方法來進(jìn)行的。具體方法為將上述PCR驗證含有pPIC9-BG0的陽性克隆菌落分別接入裝有3mL BMG(1L中含有100mM磷酸鉀pH 6.0，1.34％YNB，4×10-5生物素，1％甘油)培養(yǎng)液的試管中，30℃培養(yǎng)24小時，用0.5％甲醇誘導(dǎo)48小時，發(fā)酵至OD600＝25，參照從蛇毒中提取的巴曲酶的測活方法，用加入了檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿對發(fā)酵上清液中表達(dá)出的酶活性(表達(dá)量)進(jìn)行測定。巴曲酶活性(表達(dá)量)是，37℃下，將100μl發(fā)酵至OD600＝25酵母的發(fā)酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，凝結(jié)所需的時間。50個含有pPIC9-BG0的克隆，巴曲酶活性(表達(dá)量)為10mins-30mins。
畢赤酵母可以在簡單培養(yǎng)基中生長良好和表達(dá)有生物活性的重組巴曲酶。但在簡單培養(yǎng)基中分泌的重組蛋白易發(fā)生降解，使產(chǎn)物的得率降低。實驗中，在酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別選取大豆蛋白胨和山梨醇進(jìn)行了對比研究。具體方法為分別將上述篩出的巴曲酶表達(dá)量為10mins含有pPIC9-BG0的菌種(表型為Muts)上罐發(fā)酵，分別接種到3個裝有200mLBMG培養(yǎng)基的1L搖瓶中增殖作為種子液，再轉(zhuǎn)接至裝有3L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(40g/L甘油，18g/LK2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/L H3PO4)的5L發(fā)酵罐中，在30℃，pH 5.0發(fā)酵，發(fā)酵20小時后，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，饑餓30分鐘，在其中兩個發(fā)酵罐中，再加入3g大豆蛋白胨，其中一罐不加大豆蛋白胨，調(diào)pH至6.9，再在其中一個加入大豆蛋白胨的發(fā)酵罐按0.2ml/min加入甲醇(含0.2％體積山梨醇)，其他兩個發(fā)酵罐按0.2ml/min加入甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵每隔12小時取發(fā)酵上清液，用加入了檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿對發(fā)酵上清液中表達(dá)出的酶活性(表達(dá)量)進(jìn)行測定。巴曲酶活性(表達(dá)量)是，37℃下，將100μl發(fā)酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，凝結(jié)所需的時間。計算人血漿凝結(jié)速率(1/凝結(jié)所需時間)，實驗的結(jié)果如圖4中A所示，結(jié)果表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入山梨醇和大豆蛋白胨發(fā)酵的蛋白人血漿凝結(jié)速率最高，表明，加入山梨醇有利于酵母產(chǎn)生更多的基礎(chǔ)蛋白包括分子伴侶，糖基化酶等，促進(jìn)了巴曲酶的組裝和正確折疊，同時大豆蛋白胨延緩了巴曲酶的降解。圖4中A中1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入大豆蛋白胨，3為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入山梨醇和大豆蛋白胨。
將上述篩出的巴曲酶表達(dá)量為10mins含有pPIC9-BG0的菌種(表型為Muts)上罐發(fā)酵，接種到裝有200mL BMG培養(yǎng)基的1L搖瓶中增殖作為種子液，再轉(zhuǎn)接至裝有3L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(40g/L甘油，18g/L K2SO4，15g/L MgSO4.7H2O，4.13g/L KOH，0.9g/L CaSO4.2H2O，13.3mL/LH3PO4)的5L發(fā)酵罐中，在30℃，pH 5.0發(fā)酵，發(fā)酵20小時后，按0.8ml/min加入5％甘油100ml，饑餓30分鐘，再加入3g大豆蛋白胨，調(diào)pH至6.9，按0.2ml/min加入甲醇(含0.2％體積山梨醇)誘導(dǎo)培養(yǎng)90小時，此時發(fā)酵液的濃度為OD600＝360，按照上述方法測得巴曲酶的表達(dá)量(酶活性)為30secs(圖4中B，箭頭示條帶)。
3)發(fā)酵獲得巴曲酶的純化及其活性鑒定將上述發(fā)酵至濃度為OD600＝360發(fā)酵液的發(fā)酵上清液加入2M硫酸銨預(yù)處理后，先經(jīng)過預(yù)先用10mM PBS(pH6.0)和2M硫酸銨平衡過的裝有疏水層析介質(zhì)(STREAMLINETMPhenyl，Amersham Biosciences，貨號17-5121-02)的層析柱，用含2M硫酸銨的50mM PBS(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖5所示，圖5中“-”標(biāo)記為活性峰；將收集液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9中泳道1所所示；將上述收集峰，再經(jīng)過用10mM PBS(pH6.0)平衡過的裝有陽離子交換介質(zhì)(SPSepharoseTMFast Flow，Amersham Pharmacia Biotech AB，貨號17-0729-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM PBS(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖6所示，圖6中“-”標(biāo)記為活性峰；將收集液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9中泳道2所示；將上述陽離子交換介質(zhì)收集峰，再經(jīng)過用10mM Tris-HCl(pH7.4)平衡過的裝有肝素瓊脂糖凝膠FF(Heparin Sepharose FF，北京卓冠科技有限公司，貨號CS-A13-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH 6.0)梯度洗脫，收集活性峰，分析圖譜如圖7所示，圖7中“-”標(biāo)記為活性峰；將收集液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9中泳道3所示；將上述肝素瓊脂糖凝膠FF收集峰，再進(jìn)行一步用凝膠過濾層析(SephacrylS-100，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0612-01)，然后用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脫收集活性峰得到純化的巴曲酶溶液，分析圖譜如圖8所示，圖8中“-”標(biāo)記為活性峰，結(jié)果表明該利用BG0生產(chǎn)巴曲酶的產(chǎn)量為10mg/L發(fā)酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu。
用檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發(fā)酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間與相同條件下人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品相比較。一個巴曲酶單位(BU)相當(dāng)于0.17 NIH凝血酶單位(NIHUnit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內(nèi)凝結(jié)1ml人標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。
結(jié)果表明，以人標(biāo)準(zhǔn)血漿為底物，巴曲酶活性為每毫升發(fā)酵液14巴曲酶單位(14BU/ml)，上述純化后的巴曲酶的比活性為1400BU/mg。
用牛纖維蛋白原進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發(fā)酵上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間與相同條件下人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品凝結(jié)時間相比較。一個巴曲酶單位相當(dāng)于0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內(nèi)凝結(jié)1ml人標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結(jié)果表明，以牛纖維蛋白原為底物巴曲酶的比活性為1800BU/mg(表1)將純化的巴曲酶溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9中泳道4所示。
將純化的重組巴曲酶經(jīng)去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖9中泳道5所示。
上述圖9中泳道M為蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為STREAMLINETMPhenyl活性峰；泳道2為SP SepharoseTMFF活性峰；泳道3為Heparin Sepharose FF活性峰；泳道4為SephacrylS-100活性峰(純化的巴曲酶蛋白)；泳道5為去糖基化的巴曲酶蛋白。
甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)的外源蛋白時，只要蛋白分子一級結(jié)構(gòu)中有N-糖基化的可能位點(diǎn)，一般都會有N-型糖基化現(xiàn)象。巴曲酶氨基酸序列資料計算出該蛋白的分子量為25.5KD，上述純化出的巴曲酶，SDS-PAGE電泳(圖9)得出的表觀分子量在30-33KD之間，巴曲酶蛋白的分子量質(zhì)譜圖如圖10所示，表明BG0生產(chǎn)巴曲酶的平均分子量為30.55KD。如圖9所示，巴曲酶經(jīng)去糖基化酶PNGase F水解后蛋白的分子量約25.5KD，說明本發(fā)明BG0生產(chǎn)的巴曲酶具有糖基化現(xiàn)象。
對BG0生產(chǎn)巴曲酶蛋白測序，前五個氨基酸的序列為VIDGG，表明分泌表達(dá)的巴曲酶蛋白與預(yù)期的結(jié)果相一致。
3、巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(20-25g，每個處理10只)，分別尾靜脈注射上述純化后的畢赤酵母表達(dá)的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIHUnits/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或按照5ml/kg體重的劑量注射10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘后，距尾尖2-3mm處橫切，固定后浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結(jié)果表明注射上述純化后的畢赤酵母表達(dá)的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或?qū)φ仗幚硇∈蟪鲅獣r間分別約為55秒、60秒、90秒；結(jié)果如圖13中的1、2、3所示，結(jié)果表明，巴曲酶蛋白縮短了小鼠的出血時間，促進(jìn)止血，其止血效果與天然的巴曲酶蛋白相當(dāng)。圖13中，1∶5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)；2天然巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)；3酵母表達(dá)的巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)。
實施例2、含IL-2信號肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成及其表達(dá)巴曲酶的效果檢測。
1、含IL-2信號肽基因的巴曲酶基因(IBG0)的合成、測序以及表達(dá)載體的構(gòu)建利用剪接重疊延伸PCR(SOE-PCR)將巴曲酶基因BG0為模板(序列表中序列2)與IL-2信號肽基因(自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)進(jìn)行連接，具體方法為以IL-2信號肽基因(自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸序列)為模板，用IL25引物5′-CTGGATCCACGATGTATAGGATGCAACTGCTG-3′和IL23引物5′-AGCGCTGTTGGTGACCAG-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系IL-2信號肽基因(7.5uM)0.1μL，IL25引物(15uM)和IL23引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到70bp的片段；以pPIC9-BG0為模板，以ILB引物5′-CTGGTCACCAACAGCGCTGTCATTGGAGGTGATGAATG-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序如上所述；結(jié)果得到800bp的片段。以上述IL25引物和IL23引物以及ILB引物和3′AOX1引物擴(kuò)增得到的兩個片段為模板，以IL25引物和3′AOX1引物為引物進(jìn)行PCR，將IL-2信號肽基因與重組巴曲酶基因進(jìn)行連接，得到帶有IL-2信號肽的重組巴曲酶基因(IBGO)，經(jīng)測序表明，該片段具有序列表中序列4的核苷酸序列，編碼序列表中序列3的氨基酸殘基序列。序列表中序列4的第1-60位核苷酸編碼IL-2信號肽序列，即序列表中序列3的第1-20位氨基酸殘基序列，將IBGO經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，再1％瓊脂糖凝膠回收符合800bp的DNA片段，插入到pcDNA3.1載體的多克隆位點(diǎn)BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，然后，用T7引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′和BGH引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′測序引物分別從BG基因的5′-端和3′-端進(jìn)行測序鑒定，將經(jīng)測序表明含有IBGO的重組載體命名為pcDNA3.1-IBGO。
2、含IL-2信號肽的巴曲酶基因(IBG0)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)用LiofectamineTM2000的方法轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，將質(zhì)粒pcDNA3.1-IBG0和LiofectamineTM2000在無血清DMEM培養(yǎng)基[每升1袋DMEM培養(yǎng)粉(4500mg葡萄糖，4.0mM L-谷氨酰胺，110mg丙酮酸鈉)，2.0g碳酸氫鈉，青霉素和鏈霉素各100mg]中進(jìn)行混合，并在室溫中孵育20分鐘；將混合物加入到已經(jīng)鋪好細(xì)胞的24孔板中，輕柔混勻，并置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成含10％DF(Defined FBS，特級胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；換用含750mg/L G418的含10％DF的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行加壓篩選，每2天換液一次，加壓篩選14天。有限稀釋法挑取單克隆。待加壓后正常生長的細(xì)胞鋪滿24孔板時，其密度約106/孔，將其進(jìn)行消化懸浮后分別用生長培養(yǎng)基分別稀釋至10、20個細(xì)胞/ml，200μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)。10天后，即可見單細(xì)胞克隆生長，逐孔進(jìn)行目的蛋白的檢測。共篩選了96個可表達(dá)巴曲酶的克隆，表達(dá)量從90mins到180mins不等。
將上述表達(dá)量為90mins的單細(xì)胞克隆在無蛋白、無血清DMEM培養(yǎng)基[每升1袋DMEM培養(yǎng)粉(4500mg葡萄糖，4.0mM L-谷氨酰胺，110mg丙酮酸鈉)，2.0g碳酸氫鈉，青霉素和鏈霉素各100mg]中擴(kuò)大培養(yǎng)至1010細(xì)胞/L培養(yǎng)基，將培養(yǎng)上清液稀釋1倍，按照實施例1的方法經(jīng)過用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡過的肝素瓊脂糖凝膠FF(HeparinSepharose FF，北京卓冠科技有限公司，貨號CS-A13-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脫，收集活性峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖12中泳道1所示；將上述肝素瓊脂糖凝膠FF收集峰，再經(jīng)過用10mM Tris-HCl(pH8.4)平衡過的裝有陰離子交換介質(zhì)(Q SepharoseTMFast Flow，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0510-01)的層析柱，用含0-0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(pH8.4)梯度洗脫，收集活性峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖12中泳道2所示；
將上述陰離子交換介質(zhì)收集峰，再進(jìn)行一步用凝膠過濾層析(SephacrylS-100，Pharmacia LKB Biotech AB，貨號17-0612-01)，然后用含0.15M NaCl的10mMTris-HCl(pH7.4)洗脫，收集活性峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳(即純化的巴曲酶溶液)，結(jié)果如圖12中泳道3所示。用檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的培養(yǎng)液上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間。用牛纖維蛋白原進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的培養(yǎng)液上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間與相同條件下人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品凝0結(jié)時間相比較。一個巴曲酶單位相當(dāng)于0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內(nèi)凝結(jié)1ml標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結(jié)果表明該利用CHO生產(chǎn)巴曲酶的產(chǎn)量為0.1mg/L培養(yǎng)液，即1010細(xì)胞/L培養(yǎng)液，其比活力檢測結(jié)果如表1所示，表明CHO生產(chǎn)巴曲酶仍具有很高的比活力。
將純化的CHO表達(dá)的重組巴曲酶經(jīng)去糖基化酶PNGase F(New England BioLabs)水解后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖12中泳道4所示。
上述圖12中泳道M為蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為肝素瓊脂糖凝膠FF活性峰；泳道2為Q SepharoseTMFast Flow活性峰；泳道3為SephacrylS-100活性峰(即純化的巴曲酶蛋白)；泳道4為去糖基化的巴曲酶蛋白。
CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)的外源蛋白時，只要蛋白分子一級結(jié)構(gòu)中有N-糖基化的可能位點(diǎn)，一般都會有N-型糖基化現(xiàn)象。巴曲酶氨基酸序列資料計算出該蛋白的分子量為25.5KD，上述純化出的巴曲酶，SDS-PAGE電泳(圖12)得出的表觀分子量在32-35KD之間。如圖12所示，巴曲酶經(jīng)去糖基化酶PNGase F水解后蛋白的分子量約25.5KD，說明本發(fā)明CHO細(xì)胞生產(chǎn)的巴曲酶具有糖基化現(xiàn)象。
3、CHO(pcDNA3.1-IBG0)表達(dá)的巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(體重20-25g，每個實驗處理組10只)，分別尾靜脈注射上述純化后的CHO表達(dá)的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/LPBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘后，距尾尖2-3mm處橫切，固定后浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結(jié)果表明注射上述純化后的CHO表達(dá)的巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.4μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)小鼠出血時間分別約為51秒、90秒；結(jié)果如圖13中1、4所示，結(jié)果表明，CHO表達(dá)的巴曲酶蛋白縮短了小鼠的出血時間，促進(jìn)止血，其止血效果與酵母表達(dá)的巴曲酶蛋白以及天然的巴曲酶蛋白相當(dāng)。圖13中，1注射5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，4注射上述純化后的CHO表達(dá)的巴曲酶蛋白。
實施例3、對BG0基因表達(dá)的巴曲酶蛋白的糖基化研究1、巴曲酶糖基化位點(diǎn)突變基因(BGm1，BGm2)的獲得以及表達(dá)載體的構(gòu)建(圖2)采用定點(diǎn)突變技術(shù)對BG0基因分別進(jìn)行突變將Asn(自序列1的氨基端第146位)突變?yōu)镚ln(糖基化的motif是Asn-X-Thr)，即將自序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突變?yōu)镃AA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M13引物5′-TTGGAACAGGTTAATGTTAGCACAG-3′(突變密碼子)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(各2.5mM)和M13引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10*KODbuffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃30s，72℃1min，25循環(huán)；結(jié)果得到470bp的片段。用M15引物5′-CTGTGCTAACCTGTTCCAAAATACTGTCTGTCGTGAGG-3′(突變密碼子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，M15引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O35μL。PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到340bp的片段。將上述得到的兩個片段回收后，作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR的程序為PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到800bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段具有將序列表中序列2的5′端第448-450位核苷酸(AAC)突變?yōu)镃AA的核苷酸序列(即序列9)，將其命名為BGm1。
將BGml片段用XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成含有BGml的pPIC9重組載體，將該重組載體命名為pPIC9-BGml。
將Asn(自序列1的氨基端第225位)突變?yōu)镚ln，即將自序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突變?yōu)镃AA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M23引物5′-GGAATTCTTATGGACAAGTAGCAGTCTTGTTTCCAGCAATG-3′(突變密碼子)為引物進(jìn)行PCR，PCR的程序為PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和M23引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL。PCR反應(yīng)程序94℃30s，53℃30s，72℃1min，25循環(huán)；結(jié)果得到730bp的片段，經(jīng)測序表明，該片段具有將序列表中序列2的5′端第685-687位核苷酸(AAC)突變?yōu)镃AA的核苷酸序列(即序列10)，將其命名為BGm2。
將上述PCR獲得的BGm2片段經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成含有BGm2的pPIC9重組載體，將鑒定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm2。
將pPIC9-BGm1和pPIC9-BGm2用Bgl II線性化，按照實施例1步驟2所述的方法，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115/His-宿主菌，分別得到含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重組菌，在30℃，MD平板培養(yǎng)2-3天，PCR鑒定(以PCR 5′AOX1引物和3′AOX1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25ul體系，少量重組GS115菌落為模板，5′AOX1引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，rTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×rTaq buffer 2μL，ddH2O 15μL。PCR反應(yīng)程序94℃30s，55℃30s，72℃1min，25循環(huán)。)；鑒定陽性克隆，將PCR鑒定表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2的重組菌按照實施例的方法用1BMG培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵表達(dá)突變?nèi)コ艘粋€糖基化位點(diǎn)的巴曲酶，發(fā)酵96小時，OD600＝360，將發(fā)酵上清液純化，進(jìn)行活性檢測，檢測方法同實施例1的步驟2。
結(jié)果表明含有pPIC9-BGm1或pPIC9-BGm2重組菌發(fā)酵得到的巴曲酶的表達(dá)量分別達(dá)到10mg/L發(fā)酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu，比活性分別為500BU/mg，170BU/mg(表1)；BG0在酵母GS115表達(dá)的巴曲酶分子量為30.55KD，總糖含量16.5％，比活約為1400BU/mg；從腹蛇屬蛇毒液中提取的天然巴曲酶的分子量為34.9 KD，總糖含量27％，比活約為1350BU/mg，這表明不同生物的糖基化巴曲酶對其比活的影響不大。
說明突變?nèi)コ我庖粋€BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白中糖基化位點(diǎn)，巴曲酶的酶活力大大降低；說明BG0表達(dá)的巴曲酶蛋白中的這二個糖基化位點(diǎn)的存在及其糖基化對維持酶的活力是極其重要的。
實施例4、氨基酸突變對活性的影響1、Ala(自序列1的氨基端第59位)突變?yōu)锳rg的巴曲酶及其編碼基因的獲得將Ala(自序列1的氨基端第59位)突變?yōu)锳rg，即將自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突變?yōu)镃GA；具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M33引物5′-TCGGACAGATCCGGCGTGCTTAC-3′(突變密碼子)為引物進(jìn)行PCR，PCR的程序為PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL，a-Factor引物和M33引物各0.5μL，dNTP 2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO42μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到210bp的片段；用M35引物5′-GCACGCCGGATCTGTCCGAAACTACGATGAGGTCGTTAG-3′(突變密碼子)和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR的程序為PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL(5U/μL)，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃1min，25循環(huán)；結(jié)果得到690bp的片段。將上述PCR獲得的兩個片段回收后作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序如上所述；結(jié)果得到800bp的片段，經(jīng)過測序檢測，檢測表明該片段具有將自序列表中序列2的5′端第187-189位核苷酸(GCC)突變?yōu)镃GA的核苷酸序列(即序列表中序列6)，將片段命名為BGm3。BGm3編碼具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列。
將BGm3經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶識別位點(diǎn)中，構(gòu)建成含有BGm3的pPIC9重組載體，將鑒定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm3。
2、Thr(自序列1的氨基端第128位)突變?yōu)锳rg的巴曲酶及其編碼基因的獲得將Thr(自序列1的氨基端第128位)突變?yōu)锳rg，即將自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突變?yōu)镃GA，具體方法為以pPIC9-BG0為模板，用a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和M43引物5′-TCGTGTGATTGCTCCCCATCC-3′(突變密碼子)為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和M43(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃30s，53℃30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到420bp的片段，用M45引物5′-ATGGGGAGCAATCACACGATCTGAAGACACTTACCCAG-3′(突變密碼子)和3′AOX 1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL，M45和3′AOX1引物各0.5μL，dNTP 2μL，KOD DNA Polymerase 0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO42μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到380bp的片段。將上述PCR獲得的兩個片段回收后作為模板，以a-Factor引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1引物5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′為引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系pPIC9-BG0質(zhì)粒0.1μL(0.04ug)，a-Factor引物(15uM)和3′AOX1引物(15uM)各0.5μL，dNTP(各2.5mM)2μL，KOD DNA Polymerase(5U/μL)0.1μL，10×KOD buffer 2μL，MgSO4(25mM)2μL，ddH2O 35μL；PCR反應(yīng)程序94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 1min，25循環(huán)；結(jié)果得到800bp的片段，經(jīng)過測序檢測，檢測表明該片段具有將自序列表中序列2的5′端第394-396位核苷酸(ACT)突變?yōu)镃GA的核苷酸序列(即序列表中序列8)，將片段命名為BGm4。BGm4編碼具有序列表中序列7的氨基酸殘基序列。
將BGm4經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切，插入到pPIC9載體的XhoI和EcoRI酶識別位點(diǎn)中，構(gòu)建成含有BGm4的pPIC9重組載體，將鑒定正確的重組載體命名為pPIC9-BGm4。
3、BGm3和BGm4在畢赤酵母中的表達(dá)按照實施例1所述的方法，將pPIC9-BGm3或pPIC9-BGm4轉(zhuǎn)化GS115/His-，然后進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行發(fā)酵至OD600＝360，并按照實施例1所述方法檢測活性并純化。用檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發(fā)酵上清液加入到300μl含檸檬酸鈉的人標(biāo)準(zhǔn)血漿中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間與相同條件下人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品凝結(jié)時間相比較。一個巴曲酶單位相當(dāng)于0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內(nèi)凝結(jié)1ml標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。用牛纖維蛋白原進(jìn)行巴曲酶活性檢測，具體方法為37℃下，將100μl的發(fā)酵上清液加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(Tris-HCl pH7.4，含0.15M NaCl)中，混勻后，觀察凝結(jié)所需的時間與相同條件下人凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品凝結(jié)時間相比較。一個巴曲酶單位相當(dāng)于0.17 NIH凝血酶單位(NIH Unit，1 NIH凝血酶單位定義為在28±1.0℃條件下，15±0.5秒內(nèi)凝結(jié)1ml人標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原溶液的凝血酶量)。結(jié)果表明其中的BGm4基因表達(dá)的將自序列1的氨基端第128位T突變成R巴曲酶的表達(dá)量為達(dá)到10mg/L發(fā)酵液(OD600＝360)，即10mg/1013cfu，比活性為1050BU/mg；另一株的BGm3表達(dá)的將自序列1的氨基端第59位A突變成R巴曲酶的表達(dá)量為10mg/L發(fā)酵液(OD600＝360)，比活性為1330BU/mg。用牛纖維蛋白原為底物檢測其活性和表達(dá)量37℃下，將100μl加入到300μl 0.4％牛纖維蛋白原(pH7.4，含0.9％NaCl)中，混勻后，記錄凝結(jié)時間，結(jié)果表明BGm3表達(dá)的將自序列1的氨基端第59位A突變成R的巴曲酶改變了巴曲酶蛋白的底物特異性，對牛纖維蛋白原的活性高于BG0表達(dá)的巴曲酶，對人血漿的活性低于BG0表達(dá)的巴曲酶(表1)。
表1.巴曲酶突變體與BG0表達(dá)的巴曲酶比活力對比

4、BGm3和BGm4表達(dá)的巴曲酶蛋白的小鼠出血時間檢測試驗鼠為雄性小鼠(20-25g，n＝10)，分別尾靜脈注射上述純化后的畢赤酵母表達(dá)的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)，60分鐘后，距尾尖2-3mm處橫切，固定后浸入37℃生理鹽水中1.5cm，記錄出血時間。結(jié)果表明注射上述純化后的畢赤酵母表達(dá)的BGm3巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)或BGm4巴曲酶蛋白(2NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)或5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4) (對照)小鼠出血時間分別約為53秒、57秒、90秒；具體結(jié)果如圖13中1、5、6所示。圖13中，1注射5ml/kg體重10mmol/L PBS(pH 7.4)(對照)；5.酵母表達(dá)的BG3巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，11.2μg蛋白/kg體重)；6.酵母表達(dá)的BG4巴曲酶蛋白(2 NIH Units/kg，8.8μg蛋白/kg體重)。
序列表<160>10<210>1<211>231<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn20 25 30Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg35 40 45Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val50 55 60Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn65 70 75 80Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val85 90 95Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro100 105 110Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr115 120 125Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu130 135 140Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys145 150 155 160Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly
165 170 175Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu180 185 190Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr195 200 205Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly210 215 220Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro225 230<210>2<211>714<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ctcgagaaaa gagtcattgg aggtgatgaa tgtgacatca acgaacaccc tttccttgcc60ttcatgtact actctccacg ttacttctgt ggtatgactt tgatcaacca ggaatgggtc120ctgaccgctg cacactgtaa cagaagattt atgcgtatcc accttggtaa gcacgccgga180tctgtcgcca actacgatga ggtcgttaga tacccaaagg agaagttcat ttgtcctaat240aagaagaaaa acgtcattac cgacaaggac attatgttga tcagactgga cagacctgtc300aaaaactccg aacacatcgc tcctctctct ttgccttcca accctccaag tgttggttcc360gtttgccgta ttatgggatg gggagcaatc acaacttctg aagacactta cccagatgtc420cctcactgtg ctaacattaa cctgttcaac aatactgtct gtcgtgaggc ttacaacggt480ttgccagcta agaccttgtg tgcaggtgtc ctgcaaggag gtatcgatac atgtggtggt540gactctggtg gaccactgat ctgtaatgga caattccagg gaatcttgtc ttggggaagt600gatccatgtg ccgaaccacg taagcctgcc ttctacacca aggtctttga ttaccttcca660tggattcagt ctatcattgc tggaaacaag actgctactt gtccataaga attc 714<210>3
<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu1 5 10 15Val Thr Asn Ser Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His20 25 30Pro Phe Leu Ala Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met35 40 45Thr Leu Ile Asn Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg50 55 60Arg Phe Met Arg Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn65 70 75 80Tyr Asp Glu Val Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn85 90 95Lys Lys Lys Asn Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu100 105 110Asp Arg Pro Val Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro115 120 125Ser Asn Pro Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly130 135 140Ala Ile Thr Thr Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala145 150 155 160Asn Ile Asn Leu Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly165 170 175Leu Pro Ala Lys Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp180 185 190Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe195 200 205
Gln Gly Ile Leu Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys210 215 220Pro Ala Phe Tyr Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser225 230 235 240Ile Ile Ala Gly Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro245 250<210>4<211>755<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4atgtatagga tgcaactgct gtcttgcatt gctctgtctc tggcctggtc accaactccg60tcattggagg tgatgaatgt gacatcaacg aacacccttt ccttgccttc atgtactact120ctccacgtta cttctgtggt atgactttga tcaaccagga atgggtcctg accgctgcac180actgtaacag aagatttatg cgtatccacc ttggtaagca cgccggatct gtcgccaact240acgatgaggt cgttagatac ccaaaggaga agttcatttg tcctaataag aagaaaaacg300tcattaccga caaggacatt atgttgatca gactggacag acctgtcaaa aactccgaac360acatcgctcc tctctctttg ccttccaacc ctccaagtgt tggttccgtt tgccgtatta420tgggatgggg agcaatcaca acttctgaag acacttaccc agatgtccct cactgtgcta480acattaacct gttcaacaat actgtctgtc gtgaggctta caacggtttg ccagctaaga540ccttgtgtgc aggtgtcctg caaggaggta tcgatacatg tggtggtgac tctggtggac600cactgatctg taatggacaa ttccagggaa tcttgtcttg gggaagtgat ccatgtgccg660aaccacgtaa gcctgccttc tacaccaagg tctttgatta ccttccatgg attcagtcta720tcattgctgg aaacaagact gctacttgtc cataa 755<210>5<211>231<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn20 25 30Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg35 40 45Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Arg Asn Tyr Asp Glu Val50 55 60Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn65 70 75 80Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val85 90 95Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro100 105 110Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Thr115 120 125Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu130 135 140Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys145 150 155 160Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly165 170 175Asp Ser Gly Gly Pro LeuIle Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu180 185 190Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr195 200 205Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly210 215 220Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro
225 230<210>6<211>714<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6ctcgagaaaa gagtcattgg aggtgatgaa tgtgacatca acgaacaccc tttccttgcc60ttcatgtact actctccacg ttacttctgt ggtatgactt tgatcaacca ggaatgggtc120ctgaccgctg cacactgtaa cagaagattt atgcgtatcc accttggtaa gcacgccgga180tctgtccgaa actacgatga ggtcgttaga tacccaaagg agaagttcat ttgtcctaat240aagaagaaaa acgtcattac cgacaaggac attatgttga tcagactgga cagacctgtc300aaaaactccg aacacatcgc tcctctctct ttgccttcca accctccaag tgttggttcc360gtttgccgta ttatgggatg gggagcaatc acaacttctg aagacactta cccagatgtc420cctcactgtg ctaacattaa cctgttcaac aatactgtct gtcgtgaggc ttacaacggt480ttgccagcta agaccttgtg tgcaggtgtc ctgcaaggag gtatcgatac atgtggtggt540gactctggtg gaccactgat ctgtaatgga caattccagg gaatcttgtc ttggggaagt600gatccatgtg ccgaaccacg taagcctgcc ttctacacca aggtctttga ttaccttcca660tggattcagt ctatcattgc tggaaacaag actgctactt gtccataaga attc 714<210>7<211>231<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>7
Val Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Phe Met Tyr Tyr Ser Pro Arg Tyr Phe Cys Gly Met Thr Leu Ile Asn20 25 30Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asn Arg Arg Phe Met Arg35 40 45Ile His Leu Gly Lys His Ala Gly Ser Val Ala Asn Tyr Asp Glu Val50 55 60Val Arg Tyr Pro Lys Glu Lys Phe Ile Cys Pro Asn Lys Lys Lys Asn65 70 75 80Val Ile Thr Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Arg Pro Val85 90 95Lys Asn Ser Glu His Ile Ala Pro Leu Ser Leu Pro Ser Asn Pro Pro100 105 110Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Ala Ile Thr Arg115 120 125Ser Glu Asp Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Ala Asn Ile Asn Leu130 135 140Phe Asn Asn Thr Val Cys Arg Glu Ala Tyr Asn Gly Leu Pro Ala Lys145 150 155 160Thr Leu Cys Ala Gly Val Leu Gln Gly Gly Ile Asp Thr Cys Gly Gly165 170 175Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly Gln Phe Gln Gly Ile Leu180 185 190Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Ala Glu Pro Arg Lys Pro Ala Phe Tyr195 200 205Thr Lys Val Phe Asp Tyr Leu Pro Trp Ile Gln Ser Ile Ile Ala Gly210 215 220Asn Lys Thr Ala Thr Cys Pro225 230<210>8<211>714<212>DNA
<213>人工序列<220>
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1.一種制備巴曲酶的專用基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經(jīng)替換1-3個堿基，編碼相同功能蛋白的核苷酸序列；3)在1)所述序列的5′端連接IL-2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)、2)或3)所述序列的DNA序列雜交的核苷酸序列；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述IL-2信號肽基因的核苷酸序列為自GENBANK號為NM_000586的5′端第295-354位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述編碼基因具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列43)序列表中序列6；4)序列表中序列8。
4.一種制備巴曲酶的方法，是將權(quán)利要求1-3任一所述的編碼基因通過真核表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌或哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)，獲得巴曲酶蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述酵母菌為畢赤酵母，優(yōu)選為畢赤酵母GS115/His-。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述哺乳動物細(xì)胞系為CHO細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于當(dāng)所述編碼基因?qū)虢湍妇袝r，所述真核表達(dá)載體為pPIC9；當(dāng)所述編碼基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞系中時，所述真核表達(dá)載體為pcDNA3.1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將表達(dá)獲得的巴曲酶蛋白進(jìn)行純化。
9.權(quán)利要求4-8任一所述的方法制備的巴曲酶蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的巴曲酶蛋白，其特征在于所述巴曲酶蛋白的氨基酸殘基序列是1)序列表中序列1；2)序列1的氨基端第59位Ala突變?yōu)锳rg的氨基酸序列；3)序列1的氨基端第128位Thr突變?yōu)锳rg的氨基酸序列；4)序列1的氨基端連接IL-2信號肽的氨基酸序列；所述IL-2信號肽的氨基酸序列為自GENBANK號為NP_000577的氨基端第1-20位氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巴曲酶及其制備方法與專用編碼基因。該巴曲酶的編碼基因，具有下述的核苷酸序列之一1)序列表中序列2；2)序列表中序列2經(jīng)突變1－3個核苷酸；3)在1)所述序列的5′端連接IL－2信號肽基因序列得到的核苷酸序列。該制備巴曲酶的方法，是將權(quán)利要求1－3任一所述的編碼基因通過真核表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌或哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)，獲得巴曲酶蛋白。本發(fā)明的方法，成功地表達(dá)出了生物活性高的巴曲酶蛋白，純化后酵母菌產(chǎn)量達(dá)到每毫升發(fā)酵液10μg/ml或14巴曲酶單位(14BU/ml)，比活性為1400BU/mg。這一產(chǎn)量超過了其它已發(fā)表和報道的表達(dá)水平，適合規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C12N1/19GK1986813SQ20061016534
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者李招發(fā), 于學(xué)玲, 黃金路, 方宏清, 陳惠鵬 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所