專利名稱：一種來源于矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶及其提取方法，特別是提供一種來源于矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法。
背景技術：
凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va, Ca2+及磷脂膠粒構成的復合體。因子χ被激活為Xa是此過程的關鍵步驟。因子Va無酶活性，但可使Xa的活性增強350倍，加速凝血酶的生成。磷脂膠粒與酶(Xa)和底物(凝血酶原)之間借Ca2+作為橋相連。因凝血酶原肽鏈的N未端含有10個 γ羧基谷氨酸殘基。相鄰的羧基可與Ca2+形成復合體。另一方面，Ca2+又可與磷脂中磷酸基結合，這樣使Xa和Va與凝血酶原接觸在一起，于是Xa將凝血酶原水解為凝血酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活酶。本發(fā)明為解決上述技術問題，采取以下技術方案一種凝血酶原激活酶，是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行SP離子交換層析、纖維素DEAE-S印hroseFast Flow離子交換層析和 Sephadex-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白。本發(fā)明所述來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活酶具有以下特點凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂膠粒構成的復合體。因子X被激活為Xa是此過程的關鍵步驟。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法，包括以下步驟(1)將矛頭蝮蛇蛇毒溶于pH6. 0、0. 05mol/L的PBS緩沖液中，得到濃度為 100-120g/L的矛頭蝮蛇蛇毒液；(2)對步驟(1)獲得的矛頭蝮蛇蛇毒液進行離子交換層析，固相填充物為SP,洗脫液分別為 ρΗ6· 0、0· 05mol/L 的 PBS 緩沖液和含 0. 25mol/LNaCl 的 ρΗ6· 0、0· 05mol/L 的 PBS 緩沖液，直線洗脫；(3)收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進行紫外分光廣度檢測，得到吸收圖譜，收集含有凝血酶原激活酶的部分；(4)濃縮除鹽，用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl ；(5)再次離子交換層析，步驟(4)的濃縮液進行離子交換層析，固相填充物為纖維素固相填充物為DEAE-S印harose Fast Flow，洗脫液為含0-0. 2mol/L NaCl的pH7_8、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫；(6)將步驟(5)獲得的洗脫液各峰進行SDS-PAGE凝膠電泳和活性測定，收集含有凝血酶原激活酶部分；(7)再次濃縮除鹽，用pH7.5、0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除 NaCl ；
(8)將步驟(7)濃縮液進行凝膠過濾層析，固相填充物為S印hadeX-G75，洗脫液為 PH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，收集洗脫液，從中收集含有凝血酶原激活酶部分，得到矛頭蝮蛇凝血酶原激活物原液。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(1)為獲得更好的實施效果，可先用離心的方法去除矛頭蝮蛇蛇毒液中的雜質，離心條件可根據(jù)實際情況進行選擇，如在 4500rpm 下離心 15min。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(2)中的中SP離子交換層析柱在使用前，先用ρΗ6· 0、0· 05mol/L的PBS緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用PH6. 0、 0. 05mol/L的PBS緩沖液過柱洗脫，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫，流速為3. Oml/min ；本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(3)中的收集方法可為依據(jù)280nm 下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集；具有凝血酶原激活酶部分的檢測方法為=SDS-PAGE電泳和凝血活性檢測。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(4)濃縮除鹽可選用截止值10000 分子量膜切向流超濾，通過用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(5)中纖維素DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析柱在使用前，先用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時， 流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl 的pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；所述步驟 (5)中的Tris-HCl緩沖液優(yōu)選為ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液·。本發(fā)明所述凝血酶原激活物提取方法中，步驟(8)中S印hadeX-G75層析柱使用前，先用PH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min,層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/ min，用與步驟(3)相同的方法收集洗脫液中含有凝血酶原激活酶的部分。本發(fā)明提供了一種從矛頭蝮蛇毒液中提取到的凝血酶原激活酶。所述凝血酶原激活酶具有以下特點(1)凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂膠粒構成的復合體；(2)該激活物的提取方法以常規(guī)的層析技術為主，通過變換層析條件和調節(jié)技術參數(shù)實現(xiàn)精確分離的目的，且可以在常溫下進行操作，并具有條件簡單容易放大，成本低(選擇的層析膠可以反復利用)，收率高和產(chǎn)品純度高的優(yōu)點?；谏鲜鎏攸c，可以利用本發(fā)明的凝血酶原激活酶為活性成分制備治療外科出血、內(nèi)科出血、婦產(chǎn)科出血、五官科出血、兒科出血和組織活檢后出血等臨床出血及出血性疾病的藥物，將在生物制藥領域發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1本實施例所述凝血酶原激活物的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號080709)，用IOOml預冷的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液于4_8°C的層析柜中攪拌溶解 30min,4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將SP層析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液平衡5-6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液過柱洗脫，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫，流速為3. Oml/min ； 依據(jù)280nm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析和凝血活性測定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脫液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度，濃縮樣品50ml ；上樣至纖維素纖DEAE-S印harose Fast Flow 離子交換層析柱在使用前，先用pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，濃縮樣品40ml，然后上樣S印hadeX-G75層析柱，每次上樣 10ml，先用 ρΗ7· 5、0· 01mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 5-6 小時，流速為 3. Oml/min, B 析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為 3. Oml/min。收集樣品165ml，收獲蛋白58mg，HPLC分析純度為97.7%，SDS-PAGE為一條帶。實施例2本實施例所述凝血酶原激活物的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號080709)，用100ml預冷的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液于4_8°C的層析柜中攪拌溶解 30min,4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將SP層析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液平衡5-6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液過柱洗脫，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫，流速為3. Oml/min ； 依據(jù)280nm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析和凝血活性測定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脫液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度，濃縮樣品50ml ；上樣至纖維素纖DEAE-S印harose Fast Flow 離子交換層析柱在使用前，先用PH7. 5,0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后PH7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的 ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、 0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，濃縮樣品40ml，然后上樣S印hadeX-G75層析柱， 每次上樣10ml，先用ρΗ7· 5、0· 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/ min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫， 流速為3. Oml/min。收集樣品202ml，收獲蛋白65mg，HPLC分析純度為98. 6%, SDS-PAGE為一條帶。
實施例3本實施例所述凝血酶原激活物的提取方法為取IOg矛頭蝮蛇蛇毒干粉(批號080709)，用IOOml預冷的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液于4_8°C的層析柜中攪拌溶解 30min,4500rpm離心15min，取上清液。層析前先將SP層析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液平衡5-6小時，流速為3ml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液過柱洗脫，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫，流速為3. Oml/min ； 依據(jù)280nm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集，經(jīng)電泳分析和凝血活性測定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脫液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超濾，通過用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋、超濾濃縮，再稀釋再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強度，濃縮樣品50ml ；上樣至纖維素纖DEAE-S印harose Fast Flow 離子交換層析柱在使用前，先用pH8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后pH8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH8、 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液直線梯度洗脫，流速為3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl緩沖液濃縮除鹽，濃縮樣品40ml，然后上樣S印hadeX-G75層析柱，每次上樣 10ml，先用 ρΗ7· 5、0· 01mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液平衡 5-6 小時，流速為 3. Oml/min, B 析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為 3. Oml/min。收集樣品182ml，收獲蛋白55mg, HPLC分析純度為98%, SDS-PAGE為一條帶。
權利要求
1.一種來源于矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法，其特征在于所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物，是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行SP離子交換層析、纖維素DEAE-Si5Phrose Fast Flow離子交換層析和S印hadeX-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白；所述第一次SP離子交換層析分別用pH6.0、0. 05mol/L的PBS緩沖液和含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫；所述纖維素 DEAE-Sephrose FastFlow 離子交換層析用 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7_8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫；所述 Sephadex-G75凝膠過濾層析用pH7. 5,0. Olmol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫。
2.按照權利要求1所述來源于矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法其特征在于所述凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂膠粒構成的復合體；因子X被激活為Xa是此過程的關鍵步驟。
3.按照權利要求1所述來源于矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法其特征在于所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備的步驟為(1)蛇毒預處理；(2)將預處理蛇毒進行離子交換層析，固相填充物為SP，分別用pH6.0,0. 05mol/L的 PBS緩沖液和含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫；(3)收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進行紫外分光廣度檢測，得到吸收圖譜， 收集含有凝血酶原激活酶的部分；(4)將上述洗脫液進行超濾濃縮去除NaCl；(5)再次離子交換層析，步驟4)的濃縮液進行離子交換層析，固相填充物為 DEAE-Sephrose Fast Flow，用 ρΗ7_8、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液和等量的含 0. 2mol/ LNaCl的pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫；(6)收集洗脫液，在280nm的波長下對洗脫液進行紫外分光廣度檢測，得到吸收圖譜， 收集含有凝血酶原激活酶的部分；(7)超濾濃縮去除NaCl；(8)將步驟(7)濃縮液進行凝膠過濾層析，固相填充物為S印hadeX-G75，洗脫液為 pH7. 5、0. Olmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液。
4.按照權利要求3所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(1)蛇毒預處理的方法是將蛇毒用適量預冷的PH6. 0、0. 05mol/L的PBS緩沖液溶解；步驟(1)還包括用離心的方法去除矛頭蝮蛇蛇毒液中的雜質的步驟。
5.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于步驟(2) 中SP離子交換層析柱在使用前，先用pH6. 0、0. 05mol/L的PBS緩沖液平衡5_6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后分別用ρΗ6· 0、0· 05mol/L的PBS緩沖液和含0. 25mol/LNaCl的ρΗ6· 0、 0. 05mol/L的PBS緩沖液進行直線洗脫，流速為3. Oml/min。
6.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(3)中的收集方法為依據(jù)280nm下紫外分光廣度檢測圖譜手動收集；具有凝血酶原激活酶活性部分的檢測方法為將等體積并預熱至37°C的收集液和質控血漿混合在37°C下水浴，能使血漿在20秒內(nèi)凝固的收集部分為具有凝血酶原激活酶活性的，再進行SDS-PAGE凝膠電泳確認。
7.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(4)中的濃縮方法為用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl。
8.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(5)中纖維素DEAE-S印hrose Fast Flow層析柱在使用前，先用pH7_8、0. 05mol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡5-6小時，流速為3. Oml/min ；層析時，待矛頭蝮蛇毒液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液，然后進行直線梯度洗脫，流速為3. Oml/ min，用與步驟3)相同的方法收集洗脫液中含有凝血酶原激活酶的部分。
9.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(7)中的濃縮方法為用pH7. 5、0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液超濾濃縮并去除NaCl。
10.按照權利要求1所述矛頭蝮蛇毒凝血酶原激活物的制備步驟，其特征在于所述步驟(8)中S印hadex-G75層析柱使用前，先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液平衡5_6 小時，流速為3. Oml/min，層析時，待上清液完全移動到膠面以下后，在膠面上方加與平衡液相同的緩沖液洗脫，流速為3. Oml/min，用與步驟(3)相同的方法收集洗脫液中含有凝血酶原激活酶的部分。
全文摘要
一種來源于矛頭蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活物提取方法，該酶是將矛頭蝮蛇蛇毒依次進行SP離子交換層析、透析、纖維素DEAE-Sephrose Fast Flow離子交換層析和Sephadex-G75凝膠過濾層析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白。以本發(fā)明的凝血凝血酶原激活酶為活性成分制備治療外科出血、內(nèi)科出血、婦產(chǎn)科出血、五官科出血、兒科出血和組織活檢后出血等臨床出血及出血性疾病的藥物，將在生物制藥領域發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N9/48GK102242098SQ20101016673
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權日2010年5月10日
發(fā)明者崔亮亮, 曹麗麗, 李秀娜, 王宏英, 石皎, 薛百忠, 薛雁 申請人:遼寧諾康醫(yī)藥有限公司