專利名稱：一種從基因文庫釣取未知基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用部分重疊PCR的方法從基因文庫釣取未知基因的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)方法利用核酸雜交從文庫中釣取基因，這種方法的缺點(diǎn)是需要用同位素標(biāo) 記的探針、需要篩選基因庫，不僅有放射性而且工作量極大、假陽性率高的缺點(diǎn)。近年來， 雖然已有從文庫中釣取未知基因的相關(guān)方法，例如Conner等(Isolation of Drosophila Activin and Follistatin cDNAs using novel MACHamplification protocols,2002， Gene)利用一對完全重疊引物，對來自文庫DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)Dpn I消化后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這 種方法的缺點(diǎn)是PCR為線性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物不可見，轉(zhuǎn)化效率低，操作性差；Celniker等
(Rapid and efficient cDNAlibrary screening by self_ligation of inverse PCR products, 2005， Nucleic AcidsResearch)利用一對沒有任何重疊、磷酸化的反向引物，進(jìn) 行擴(kuò)增，然后連接環(huán)化，從cDNA文庫中釣取基因，這種方法的缺點(diǎn)是效率低，而且費(fèi)時(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用部分重疊引物擴(kuò)增，使擴(kuò)增產(chǎn)物可見，操作性強(qiáng)，
轉(zhuǎn)化效率高，同時(shí)利用Dpnl酶切，和細(xì)胞降解甲基化模板。用此方法從基因文庫中釣取基
因具有效率高，簡單、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。用這種方法做成試劑盒，將大大方便使用者，實(shí)現(xiàn)從基因
文庫中快速釣取未知基因。 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案 本發(fā)明提供一種利用部分重疊PCR的方法從基因文庫釣取基因的方法。其步驟包 括 (1)模板甲基化用甲基化酶對文庫DNA甲基化， (2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)未知基因的部分序列設(shè)計(jì)一對部分重疊的引物，引物長度為 25-30個(gè)堿基，引物包括5'端重疊部分和3'端非重疊部分，引物長度為25-30個(gè)堿基，引 物重疊部分堿基為15-18個(gè)，非重疊部分堿基至少10個(gè)， (3)PCR擴(kuò)增以甲基化文庫DNA為模板，加入上述部分重疊引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
(4)Dpnl消化在步驟(3)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中，加入Dpnl限制性內(nèi)切酶，消化甲基 化模板， (5)轉(zhuǎn)化DMT細(xì)胞用Dpnl消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DMT細(xì)胞，
(6)篩選得到包含目的基因的質(zhì)粒DNA。 所述根據(jù)未知基因的已知部分序列是指來自同一物種或相關(guān)物種的已知基因。
所述甲基化酶為dam甲基轉(zhuǎn)移酶。所述步驟(4)中，加入DpnI限制性內(nèi)切酶，消化甲基化模板的條件為37°C 60min。
所述步驟(5)中，消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化匿T細(xì)胞后，可進(jìn)一步消化清除甲基化模板。
與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明提供的一種利用部分重疊PCR方法從基因文庫釣取基因
3的方法，具有快速、高效的特點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的說明 圖1 :使用本發(fā)明方法釣取未知基因的示意圖， 其中A:文庫DNA; B:甲基化的文庫DNA; C :篩選得到的包含目的基因的質(zhì)粒DNA。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中所用的材料及來源分別為人腦細(xì)胞cDNA文庫(Invitrogen公司)，人 肝細(xì)胞cDNA文庫(Invitrogen公司)，dam甲基轉(zhuǎn)移酶、Dpnl限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，引 物合成(北京英俊生物技術(shù)有限公司)。TransStartFastPfu DNA Polymerase、DMT化學(xué)感 受態(tài)細(xì)胞、EasyPure PCR Purification Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。
實(shí)施例1 :從人腦細(xì)胞cDNA文庫中擴(kuò)增hRrp46p基因
1.模板的甲基化 首先用CpG甲基轉(zhuǎn)移酶對人腦細(xì)胞eDNA文庫進(jìn)行甲基化 cDNA文庫(1 g/ yl) 1 dam甲基轉(zhuǎn)移酶(8u/ iU) 0. 4 lOXNEBuffer 2 1 ii 1 SAM(32mM) 0. 05 ii 1 dd H20 力口至10 ii 1 37"C反應(yīng)1小時(shí)。 2.引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已知部分序列設(shè)計(jì)重疊引物 hRrp46—F :5， _tcaccgtggtgctgcaggttgtcagcgatg_3， hRrp46-R :5， _cctgcagcaccacggtgatggaggtgcg_3， 3. hRrp46p基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系 甲基化處理的cDNA文庫 1 ii 1 hRrp46-F (10 ii M) 1 ii 1 hRrp46-F (10 ii M) 1 ii 1 5XTransStart FastPfu DNA Polymerase Buffer 10u 1 d證s(10mM) 1 ii 1 TransStart FastPfu DNA Polymerase (2. 5皿it/1) lul dd H20 力口至50 ii 1PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘；94。C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒，共25個(gè) 循環(huán)；72°C 10分鐘；PCR結(jié)束后，取5iU于1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.甲基化的cDNA文庫的降解
在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0. 5 ill Dpnl (20U/ yl)，于37"處理60min，以消化甲基化的 cDNA文庫。
5.轉(zhuǎn)化 取2-5 ill消化產(chǎn)物于50 ii 1 DMT感受態(tài)細(xì)胞中(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入
連接產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴30分鐘。然后42t:準(zhǔn)確熱激45秒，立即置于冰上2min。加
250 ill平衡至室溫的S0C，225轉(zhuǎn)，37"培養(yǎng)1小時(shí)。4000rpm離心lmin，棄掉部分上清，保
留100-150 iU，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜。 6.篩選 挑選克隆，測序驗(yàn)證。 實(shí)施例2 :從人肝細(xì)胞cDNA文庫中擴(kuò)增hRrp41p基因
14莫禾反的甲基4t 用dam甲基轉(zhuǎn)移酶對人肝細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行甲基化
cDNA文庫(1 g/ yl) 1
dam甲基轉(zhuǎn)移酶(8u/ iU) 0. 4 lOXNEBuffer 2 1 ii 1 SAM(32mM) 0. 05 ii 1 dd H20 力口至10 ii 1 37t:反應(yīng)l小時(shí)。
2、引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已知部分序列設(shè)計(jì)重疊引物 hRrp41—F :5， —cacacagctgcacccacgctcccagattgat—3， hRrp41-R :5， -cgtgggtgcagctgtgtgaggatggctgct-3， 3、hRrp41p基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系 甲基化處理的cDNA文庫 1 ii 1 hRrp41-F (10 ii M) 1 ii 1 hRrp41-F (10 ii M) 1 ii 1 5XTransStart FastPfu DNA Polymerase Buffer 10u 1 d證s(10mM) TransStart FastPfu DNA Polymerase (2. 5皿it/u 1) lul ddH20 力口至50 ii 1PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5分鐘；94。C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒，共25個(gè) 循環(huán)；72°C 10分鐘；PCR結(jié)束后，取5iU于1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4.甲基化的cDNA文庫的降解在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0. 5 ill Dpnl (20U/ yl)，于37"處理60min，以消化甲基化的 cDNA文庫。
5.轉(zhuǎn)化 取2-5 ill消化產(chǎn)物于50 ii 1 DMT感受態(tài)細(xì)胞中(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入 連接產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴30分鐘。然后42t:準(zhǔn)確熱激45秒，立即置于冰上2min。加250 ill平衡至室溫的S0C，225轉(zhuǎn)，37t:培養(yǎng)1小時(shí)。4000rpm離心lmin，棄掉部分上清，保
留100-150 iU，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜。 6.篩選 挑選克隆，測序驗(yàn)證。 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
權(quán)利要求
一種從基因文庫釣取未知基因的方法，其步驟包括(1)模板甲基化用甲基化酶對文庫DNA甲基化，(2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)未知基因的部分序列設(shè)計(jì)一對部分重疊的引物，引物長度為25-30個(gè)堿基，引物包括5′端重疊部分和3′端非重疊部分，引物長度為25-30個(gè)堿基，引物重疊部分堿基為15-18個(gè)，非重疊部分堿基至少10個(gè)，(3)PCR擴(kuò)增以甲基化文庫DNA為模板，加入上述部分重疊引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(4)DpnI消化在步驟(3)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中，加入DpnI限制性內(nèi)切酶，消化甲基化模板，(5)轉(zhuǎn)化DMT細(xì)胞用DpnI消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DMT細(xì)胞，(6)測序得到包含目的基因的質(zhì)粒DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從基因文庫釣取未知基因的方法，其特征在于，所述甲基化 酶為酶dam甲基轉(zhuǎn)移酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從基因文庫釣取未知基因的方法，其特征在于，所述步驟(4) 中，加入DpnI限制性內(nèi)切酶，消化甲基化模板的條件為37°C 60min。
全文摘要
本發(fā)明采用部分重疊引物設(shè)計(jì)，以甲基化cDNA文庫為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用DpnI酶切，及DMT感受態(tài)細(xì)胞降解甲基cDNA文庫，篩選包含未知基因的克隆。將該方法應(yīng)用于試劑盒中，將大大方便使用者快速從基因文庫中釣取基因，具有效率高，簡單、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/10GK101792758SQ201010137540
公開日2010年8月4日 申請日期2010年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者張琛, 李愛玲, 耿亮, 辛文 申請人:北京全式金生物技術(shù)有限公司