專利名稱：一種鴿圓環(huán)病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴿圓環(huán)病毒的檢測試劑盒及其檢測 方法。
背景技術(shù)：
圓環(huán)病毒(eircovims)屬于圓環(huán)病毒科，該科于1995年成立，包括了豬、禽及植物 的圓環(huán)病毒，是已知的最小動植物病毒。圓環(huán)病毒不僅引起畜禽感染及死亡，而且使感染畜 禽的免疫組織細胞受損，導致機體免疫抑制，易并發(fā)或繼發(fā)其他病原感染，使病情加重，造 成更大的經(jīng)濟損失。其中比較重要的病毒包括豬圓環(huán)病毒(Poricine circovirus, PCV),
(Chicken anemia virus, CAV)等。鴿圓環(huán)病毒(Pigeon circovrius, PiCV)感染于1993年首次報道于美國，此后， 加拿大、澳大利亞、英國、德國、比利時、意大利以及法國均有報道。鴿圓環(huán)病毒是一種免疫 抑制性病原，鴿子感染后可以使鴿子出現(xiàn)昏睡、嗜眠、厭食、體重減輕、呼吸窘迫等癥狀。如 今，鴿圓環(huán)病毒還沒有受到廣泛的關(guān)注，研究還不夠深入，發(fā)明人建立了鴿圓環(huán)病毒的PCR 檢測方法，同時研制出可快速檢測鴿圓環(huán)病毒的試劑盒，為鴿圓環(huán)病毒的檢測和進一步研 究提供方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鴿圓環(huán)病毒的檢測引物。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述鴿圓環(huán)病毒的檢測試劑盒，以快速、準確 的檢測出鴿圓環(huán)病毒，及時隔離受病鴿，避免傳染。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供應用上述鴿圓環(huán)病毒的檢測試劑盒進行鴿圓 環(huán)病毒檢測的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種用于檢測鴿圓環(huán)病毒的引物對，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷 酸序列。一種鴿圓環(huán)病毒檢測試劑盒，包含上述的引物對。一種鴿圓環(huán)病毒檢測試劑盒，包括(1)鴿圓環(huán)病毒陽性對照和陰性對照各600 μ L ；(2)鴿圓環(huán)病毒特異性引物對上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示；下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3) DNA提取試劑采用Geneaid公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)；(4)PCR反應試劑由上游引物Pl 15 μ L(IOmM)，下游引物P2 15 μ L(IOmM), 2 X PCRMaster Mix 200 μ L, ddH20(超純水)100 μ L 組成；
(5)電泳檢測試劑由50 X TAE電泳緩沖液20mL, GoldView 100 μ L組成。采用上述試劑盒的檢測方法，包括如下步驟(1) DNA的提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)，根據(jù)說明書提取病毒的 DNA ；(2) PCR 擴增25 μ L 體系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；PCR 反應條件95 V 3min ；然后 94 °C 30s, 60 V 30s, 72 V 30s, 40 個循環(huán)； 72 °C 5min ；4°C 保存。(4)瓊脂糖凝膠電泳將0. 4g瓊脂糖和20mL TAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產(chǎn)物取8 μ L點于已凝固的 瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(5)判斷結(jié)果如果擴增出一條338bp特異性片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán)病毒陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán)病毒陰性。有益效果由于本發(fā)明采用的引物來自鴿圓環(huán)病毒不同基因中高度保守的區(qū)域， 采用該引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有鴿圓環(huán)病毒，靈敏度達0. 04 μ L的 模板DNA ；本研究針對鴿圓環(huán)病毒不同基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計引物，建立一種PCR檢 測鴿圓環(huán)病毒的方法。通過實驗證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準 確檢測鴿圓環(huán)病毒的方法，填補了國內(nèi)空白。


圖1為鴿圓環(huán)病毒的PCR檢測結(jié)果。其中，1為標準分子量DL2000 ；2 4為PCR產(chǎn)物。圖2為不同的退火溫度。其中，1為標準分子量DL5000 ；2 7溫度分別為54°C、 56°C、58°C、60°C、62°C、64°C。圖3為特異性鑒定。其中，1為標準分子量DL2000 ;2為PiCV (鴿圓環(huán)病毒)；3為 FADV (鴿腺病毒)；4為PIHV (鴿皰疹病毒)，5為PPV (鴿痘病毒)；6為陰性對照。圖4 為敏感性試驗。其中，l*Marker DL5000;2 為 1 1;3 為 1 2，4 為 1 4，5 為 1 8;6 為 1 16;7 為 1 32;8 為 1 64 ;9 為 1 128;10 為 1 256;11 為 1 512， 上述2 11的比例為陽性DNA進行倍比稀釋的體積比。圖5為部分臨床病料檢測(5為陰性)。其中，1為標準分子量DL2000;2 9為 PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 試劑盒的制備。
1、病料。從南京浦口、南京江寧、安徽亳州、山東德州、安徽蕪湖、河北廊坊六個鴿場采取病 鴿的44份血清；鴿皰疹病毒(PIHV)、鴿腺病毒(FADV)，鴿痘病毒(PPV)由金陵科技學院預 防獸醫(yī)學教研室保存。2、試劑。DNAiUXi^^lJ^ (Viral nucleic acid extraction kit II) ；2xTaq Master Mix, 南京博爾迪生物科技有限公司生產(chǎn)；Goldview核酸染料，賽百盛公司生產(chǎn)；瓊脂糖，北京拜 爾迪生物科技有限公司；IxTBE ；Marker，上?？婆d生物技術(shù)有限公司3、引物的設(shè)計和合成。根據(jù)已發(fā)表的鴿圓環(huán)病毒的基因序列，利用primer premier 5. O設(shè)計引物，由南 京英俊公司合成。預期大小約為338bp。上游引物Pl(PiCVl-a) 5' -TCTCCCAAGTCCACCTGCCCT-3‘下游引物P2(PiCV2-s) 5' -CGAAGGACACGCCTCTCCCG-3‘4、試劑盒中其他成分的制造。4. IDNA提取試劑購自Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)。4. 2超純水(ddH20)的制備。購自Takara 公司，ImL/ 管。4. 32 X PCP master Mix 的制備。購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 450 X TAE電泳緩沖液的制備。0. 5mol/L乙銨四乙酸二鈉((EDTA)溶液(ρΗ8· 0)配制EDTA18. 61g滅菌雙蒸水 80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8. O滅菌雙蒸水 加至lOOmL。50 X T AE電泳緩沖液配制三羥甲基氨基甲烷(Tris) 242g冰乙酸57. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL滅菌雙蒸水加至lOOOmL。使用時滅菌雙蒸水稀釋50倍。4. 5Glodview核酸染料的制備。購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，ImL/管。4. 6上樣緩沖液的制備。購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 7引物的制備。弓丨物由上海英俊合成，20D/管。實施例2 檢測方法。
主要儀器如下PCR 擴增儀(Mastercycler、Eppendorf)冷凍離心機(2-16P，Sigma)紫外凝膠成像儀(BioSpectrumImaging Systems, UVP)電泳槽(JY-SP-C，北京君一)具體方法如下1、DNA提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)，根據(jù)說明書提取病毒的DNA，具體為(Ia)取200uL樣品到1. 5mL的EP管，如果樣品不足200uL，可加PBS Buffer至 200uLo(lb)加入400uL的VB Lysis Buffer到樣品中，旋渦混旋，室溫放置lOmin。(Ic)加入400uL的AD Buffer到樣品中，旋渦混旋。(Id)將VB Column安置于2mL的Collection Tube上。將步驟(Ic)得到的上清 液轉(zhuǎn)移600uL至VB Column中，13000rmp離心lmin，棄濾液。(Ie)將操作Id剩下的上清夜轉(zhuǎn)移至VB Column中，13000rmp離心lmin，棄濾液。(If)加入 400uL 的 Wl Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 離心 30s,棄濾液。(Ig)加入 600uL 的 Wash Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 離心 30s,棄濾液，再 以 13000rmp 離心 3min。(Ih)將干燥的VB Column安置于新的1. 5mL的EP管，在中央處加50uL的無RNA 酶水，室溫放置3min。13000rmp離心lmin洗脫DNA，收集濾液，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴增25 μ L 體系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；使用PCR儀對DNA進行擴增，設(shè)定反應程序為95°C 3min ；94°C 30s,60 °C 30s， 72°C 30s，40 個循環(huán)；72°C 5min ；4°C保存。3、瓊脂糖凝膠電泳準確稱取0. 4g瓊脂糖，加入20mL TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. 0μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產(chǎn)物取8μ L點于已 凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳lh。4、判斷結(jié)果紫外燈下觀察結(jié)果。如果擴增出一條338bp特異性片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán) 病毒陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán)病毒陰性。用上述方法對三個陽性鴿圓環(huán)病毒的DNA進行檢測，結(jié)果如圖1，擴增出一條 338bp的特異性片段，大小與預期相符。實施例3 =PCR擴增條件的優(yōu)化。對退火溫度進行優(yōu)化，分別在其它條件都一致的情況之下，設(shè)定了 6個不同的退 火溫度，分別是54°C、56°C、58°C、60°C、62°C、64°C。六個不同的退火溫度所得的結(jié)果都很理 想，結(jié)果如圖2，因為在多次的驗證中，60°C具有更強的穩(wěn)定性，所以把60°C作為優(yōu)化的最
終結(jié)果。
實施例4 特異性試驗。用相同的方法提取鴿皰疹病毒(PIHV)、鴿腺病毒(FADV)、鴿痘病毒(PPV)和陰性 對照的DNA，并和鴿圓環(huán)病毒的DNA —起作為模板，用設(shè)計的引物進行PCR擴增，對優(yōu)化的 PCR條件的特異性進行檢測。結(jié)果如圖3，只有PiCV擴增出一條約338bp的片段。送到測 序公司測序得到了一段長為338的基因序列，與已發(fā)表的PiCV基因序列有89%以上的同源 性。而PIHV、FADV都未擴增出條帶來，這表明該方法所擴增的片段為PiCV的特異性片段。實施例5 敏感性試驗。將鴿圓環(huán)病毒的陽性DNA進行倍比稀釋，共做10管1 2°、1 2\l 22、1 23、 1 24、1 25、1 26、1 27、1 28、1 29，然后用設(shè)計的引物進行擴增，對優(yōu)化的PCR條 件的敏感性進行檢測。結(jié)果如圖4。結(jié)果表明PCR方法可檢測出0.04 μ 1的模板DNA，具有 很高的敏感性。實施例6 臨床病料檢測。使用實施例2的方法對44份臨床病料進行檢測。44份鴿子血清所提的DNA中， 其中有40份檢測為陽性，部分結(jié)果如圖5，感染率很高，同時由于病料來自于六個不同的鴿 場，也說明其發(fā)病率較高，但致死率不高。實施例7 試劑盒穩(wěn)定性試驗。試劑盒保存于-20°C，每隔3個月取出，重新以鴿圓環(huán)病毒陽性DNA為模板進行 PCR檢測，以電泳結(jié)果作為判斷依據(jù)，連續(xù)做該項研究一年時間。經(jīng)過一年的保存和反復凍 融后，用PiCV模板進行檢測，結(jié)果表明，該試劑盒的穩(wěn)定性較好，一年之后仍然具有很高的 檢出率，說明可以長期保存。
權(quán)利要求
一種用于檢測鴿圓環(huán)病毒的引物對，其特征在于如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
2.一種鴿圓環(huán)病毒檢測試劑盒，其特征在于它包含權(quán)利要求1所述的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴿圓環(huán)病毒檢測試劑盒，其特征在于包括(1)鴿圓環(huán)病毒陽性對照和陰性對照各600μ L ；(2)鴿圓環(huán)病毒特異性引物對上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示； 下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3)DNA提取試劑采用Geneaid公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試劑盒；(4)PCR反應試劑由上游引物Pl 15yL，下游引物Ρ2 15μ L,2XPCR Master Mix200 μ L, ddH20 100 μ L 組成；(5)電泳檢測試劑由50X TAE電泳緩沖液20mL, GoldView 100 μ L組成。
4.采用權(quán)利要求2所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)DNA的提取采用Geneaid公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒，根據(jù)說明書提取病 毒的DNA ；(2)PCR 擴增25 μ L 體系:2XPCR Master Mix 12. 5μ L ； ddH20 6. 5 μ L ；上游引物 Pll μ L ；下游引物Ρ2PCR 反應條件:95V 3min ；然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，40 個循環(huán)；72°C 5min ；4°C 保存。(4)瓊脂糖凝膠電泳將0. 4g瓊脂糖和20mL TAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldVieW6. OyL 并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產(chǎn)物取8μ L點于已凝固的瓊脂糖凝膠孔 中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(5)判斷結(jié)果如果擴增出一條338bp特異性片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán)病毒陽性； 如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織鴿圓環(huán)病毒陰性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測鴿圓環(huán)病毒的引物對如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了包含上述引物對的試劑盒及利用該試劑盒檢測鴿圓環(huán)病毒的方法。由于本發(fā)明采用的引物來自鴿圓環(huán)病毒不同基因中高度保守的區(qū)域，采用該引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有鴿圓環(huán)病毒，靈敏度達0.04μL的模板DNA；本研究針對鴿圓環(huán)病毒不同基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計引物，建立一種PCR檢測鴿圓環(huán)病毒的方法。通過實驗證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測鴿圓環(huán)病毒的方法，填補了國內(nèi)空白。
文檔編號C12N15/11GK101880730SQ20101013750
公開日2010年11月10日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者劉霞, 史文靜, 張大淦, 張志成, 戴鼎震, 方光遠, 邱金燕, 陳鐘鳴 申請人:金陵科技學院