專利名稱：一株羰基還原酶重組菌高效制備(s)-苯基乙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
從近平滑假絲酵母基因組中釣取新型羰基還原酶基因scr II，通過基因工程手段
構(gòu)建重組菌株，用于高效制備(s)-苯基乙二醇的方法及其應(yīng)用，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化
技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光學(xué)純的苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，也是制備具 有光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體，開展苯基乙二醇拆分方法的研究極具 意義。 手性化合物的制備方法包括化學(xué)拆分法，色譜拆分法，液體膜拆分法或手性固體 膜拆分的膜拆分法和生物法。其中生物法具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一，立體選擇性、區(qū)域 選擇性和化學(xué)選擇性較高，能完成化學(xué)合成法難以進(jìn)行的反應(yīng)。
在生物制備(S)-苯基乙二醇的反應(yīng)中，僅少數(shù)真菌或酶能催化底物2-羰基苯 乙酮，產(chǎn)生不同空間構(gòu)型的苯基乙二醇。Bakers' yeast和Geotrichum sp.能將低濃度 的2-羰基苯乙酮分別還原為(R)-和(S)-苯基乙二醇。來源于近平滑假絲酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M203011的(R)-和(S)-羰基還原酶能催化2-羥基苯乙酮產(chǎn)生 苯基乙二醇的不同對(duì)映體。但多數(shù)已報(bào)道的不對(duì)稱還原反應(yīng)中，酶催化的底物濃度和終產(chǎn) 物的光學(xué)純度都較低。通過構(gòu)建基因工程菌來增加目標(biāo)蛋白的表達(dá)量以促進(jìn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，但 是效果不顯著。呂騰飛等采用過量表達(dá)(S)-羰基還原酶SCR的重組菌制備(S)-苯基乙二 醇，底物2-羰基苯乙酮的濃度只有3g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度也僅為91%。
近平滑假絲酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M203011可催化制備(S)-苯 基乙二醇，在此基礎(chǔ)上，利用全基因組分析方法從中釣取一種新型(s)-羰基還原酶基 因scrr II，構(gòu)建了目標(biāo)基因的重組菌，實(shí)現(xiàn)了高底物濃度下高效低成本不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備
(s)-苯基乙二醇。 本發(fā)明的目的在于根據(jù)近平滑假絲酵母基因組序列分析方法，克隆出一種新型 (S)-羰基還原酶基因scrr II，利用構(gòu)建的重組菌CCTCC NO :M 209289催化2-羥基苯乙
酮，高效制備具有光學(xué)活性的(s)-苯基乙二醇的方法，產(chǎn)物(s)-苯基乙二醇的光學(xué)純度和
產(chǎn)率分別為100% e. e.和98. 1%。 本發(fā)明的技術(shù)方案一株制備(S)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為大腸桿 菌(Escherichia coli)BL21/pETSCR II，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M 209290。 苯基乙二醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)為<
發(fā)明內(nèi)容
所述重組菌株CCTCC NO :M 209290的構(gòu)建方法，將羰基還原酶基因scrll插入載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒pETSCR II，重組質(zhì)粒pETSCR II轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含100 g/mL卡那霉素的LB平板篩選，獲得重組菌株E. coli BL21/pETSCR II，即CCTCC NO :M 209290 ;步驟為
①(S)-羰基還原酶基因scr II的獲取 用于釣取scr II基因的菌種為近平滑假絲酵母(C. par即silosis)CCTCC NO :M203011 ; 羰基還原酶基因scr II的克隆以近平滑假絲酵母(Candida par即silosis)CCTCC NO :M2030H基因組為模板，以含有BamHI酶切位點(diǎn)的 SCR II_F :5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3'，和含有Xhol酶切位點(diǎn)的 SCR II_R :5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3'為引物，PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得scr II基因，基因全長(zhǎng)840bp ;基因scr II的GenBank編號(hào)為:GQ411433 ;
PCR體系為ddH20 35. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCRII—F和SCRILR各1 ii L ; PCR反應(yīng)條件94 °C 4min ;94 °C lmin、56 °C lmin、72 °C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C lOmin ; ②重組質(zhì)粒pETSCR II的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol對(duì)目的基因scr II和表達(dá)載體pET28a分別進(jìn)行雙酶切，處理后的DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有羰基還原酶基因scr II的重組質(zhì)粒pETSCRII ; ③重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌取重組質(zhì)粒pETSCR II 2iiL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布到含有100i！ g/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培養(yǎng)過夜，獲得陽(yáng)性克隆E. coli BL21/pETSCR II。 利用重組菌CCTCC NO :M209290不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的方法
(1)重組菌株CCTCC NO :M 209290的培養(yǎng) LB液體培養(yǎng)基，以g/100mL計(jì)胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%， NaCl 1%，pH7. 0 ;需要時(shí)使用前加入卡那霉素100 g/mL，固體培養(yǎng)基再添加1. 5%瓊脂粉；
培養(yǎng)條件挑取重組菌CCTCC NO :M 209290的單菌落接種于3mL含100 y g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37t:，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含100 ii g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。0. 6，在培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)O. lmmol/L，于3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)6h;10， OOOrpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細(xì)胞；
(2)以重組菌全細(xì)胞為催化劑，以2-羥基苯乙酮為底物，進(jìn)行不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)在lmL 0. lmol/L pH4. 5 6. 0的醋酸緩沖液，或者lmL 0. lmol/L p朋.5 7. 5的磷酸緩沖液，或者lmL 0. lmol/L pH8. 0 9. 0的Tris-HCl緩沖中進(jìn)行反應(yīng)，底物2-羰基苯乙酮濃度為5g/L，反應(yīng)溫度為25 35°C ; 采用重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化重組菌全細(xì)胞濃度為0. lg/mL，反應(yīng)48h，反應(yīng)前不需要加入輔酶，產(chǎn)物為(S)-苯基乙二醇； 或采用重組菌破碎后的上清液經(jīng)純化后的重組蛋白SCRII生物轉(zhuǎn)化重組蛋白 SCRII濃度為1 2ii g/mL，反應(yīng)8h，反應(yīng)前加5mmol/L輔酶NADPH，產(chǎn)物為(S)-苯基乙二 醇； 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心除去固體物質(zhì)，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃 取，有機(jī)相用于分析。產(chǎn)物通過手性固定相高效液相色譜(Agillent HPllOO)進(jìn)行分析，條 件為Chiralcel OB-H柱(4. 6mmX 25cm ;Daicel Chemical Ind. ， Ltd. ， Japan)，流動(dòng)相為正 己烷/異丙醇(9/1，VN)，流速0. 5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。產(chǎn)物的光學(xué)純度通過對(duì)映過
量值來衡量。 產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇對(duì)映過量值的計(jì)算 對(duì)映過量值(e. e. % ) = [ (CS_CK) / (CK+CS) ] X 100 % 產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇產(chǎn)率的計(jì)算產(chǎn)率(％ ) = CS/C。X 100% 式中CK為反應(yīng)后(R)-苯基乙二醇的濃度，Cs為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的濃度，C。為
反應(yīng)前底物(R)-苯基乙二醇的濃度。 以重組菌細(xì)胞為催化劑，不對(duì)稱生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，產(chǎn)物均為(S)-苯基乙二醇。 所述重組蛋白SCRII的純化MCAC-0緩沖液20mmol/L Tris/HCl， pH8. 0 ;MCAC-20 :在MCAC-0緩沖液中加入20mmol/L的咪唑，pH8. 0 ;MCAC-200 :在MCAC-0緩沖液中加入200mmol/L的咪唑，pH8. 0 ; 菌體收集將收集的重組菌全細(xì)胞用MCAC-0緩沖液重懸，超聲破碎工作時(shí)間2s， 間歇時(shí)間6s，共20min ;破碎液16， OOOrpm離心40min ;棄沉淀，取上清進(jìn)行后續(xù)的蛋白純化 工作； 蛋白純化先將上清掛Pharmacia公司的Ni柱兩遍，用MCAC-20緩沖液洗脫雜蛋 白，用MCAC-200緩沖液洗脫目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hi trap柱蛋白脫鹽，利用 Pharmacia公司的AKTA蛋白純化系統(tǒng)將蛋白溶液換為無鹽的緩沖液；接著用Pharmacia 公司的Resource Q陰離子交換柱，1 X lcm，進(jìn)行蛋白純化；最后用Pharmacia公司的 Superdex 200， HiLoad 26/60，進(jìn)行蛋白純化；經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度達(dá)到95%以 上。 本發(fā)明的有益效果 成功從近平滑假絲酵母基因組中克隆出一種新型(S)-羰基還原酶基因scr II， 該基因全長(zhǎng)840bp， Genbank序列號(hào)為GQ411433。 將scr 1I插入表達(dá)載體pET28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)，構(gòu)建帶有目 的基因的重組菌株E. coli BL21(DE3)/pETSCR II。 通過生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的優(yōu)化，在pH5. 5的醋酸緩沖液中，利用0. lg/mL重組細(xì)胞 對(duì)5g/L的底物2-羥基苯乙酮催化轉(zhuǎn)化48h，最終產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100% e. e.，產(chǎn)率為98. 1%。 在pH5. 5的醋酸緩沖液中，利用約2ii g的重組純蛋白對(duì)6g/L底物2_羥基苯乙酮
催化轉(zhuǎn)化8h，最終產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100% e. e，產(chǎn)率為98.9%。 這些工作不僅為制 高光學(xué)純度的(S)-苯基乙二醇提供了一種優(yōu)良的催化劑，同時(shí)也為工業(yè)上采用生物法合成(s)-苯基乙二醇提供了有效途徑。生物材料樣品保藏
大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pETSCRII，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào):CCTCC NO :M 209290，保藏日期2009年11月29日。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例lscrll基因的獲得 以scr基因(DQ675534)為出發(fā)序列，在近平滑假絲酵母基因組中(htWZ麗w.Sanger, ac. uk/cgi_bin/blast/submitblast/c par抑silosis)發(fā)現(xiàn)一段同源序歹ljscr II，利用引物SCR ILF和SCR n—R，以近平滑假絲酵母基因組為模板，采用PCR的方法來擴(kuò)增scr II基因。 SCRII—F:5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCGAATCTTATTGC-3' (BamH I) SCR II_R:5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATC GAC-3' (Xho I)PCR體系為ddH20 35. 5 ii L， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，
2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCRII—F和SCR
ILR各1 ii L ;PCR反應(yīng)條件94 °C 4min ;94 °C lmin、56 °C lmin、72 °C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C 10min。 PCR反應(yīng)獲得scr II基因，GenBank編號(hào)為GQ411433。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒pETSCRII的獲得 利用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI對(duì)目的基因scr II和載體pET28a分別進(jìn)行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有scr II基因的重組質(zhì)粒pETSCR II。利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid R即id Isolation Kit (購(gòu)買于北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pETSCR II。 實(shí)施例3重組菌株E. coli BL21/pETSCRII的獲得 重組質(zhì)粒pETSCR II轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含有100 ii g/mL卡那霉素的LB平板篩選，獲得重組菌株E. coli BL21/pETSCRII 。該重組大腸桿菌送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO :M209290。 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌在每管的100 ii L E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10iiL連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰浴30min。轉(zhuǎn)入42。C水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。每管中加入700iiL LB液體培養(yǎng)基，37t: 100rpm搖床溫育培養(yǎng)lh。培養(yǎng)后菌液3， OOOrpm離心2min，棄上清600 y L，剩余菌液混勻后涂布含100 y g/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培養(yǎng)過夜。 LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl l%，pH 7.0。使用前加入卡那霉素(100 ii g/mL)，固體培養(yǎng)基添加1. 5%瓊脂粉。 挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有3mL的含有100 y g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)12h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)從培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒。經(jīng)下列酶切體系驗(yàn)證10XBuffer H2 ii L，質(zhì)粒DNA 5 ii L， BamH I 0. 5 ii L， Xhol 0. 5 ii L， ddH20將體系補(bǔ)足20 ii L。酶切結(jié)果為陽(yáng)性的菌體即為重組菌E. coli BL21/pETSCRII。
實(shí)施例4重組菌的培養(yǎng)
7
挑取實(shí)施例3中E. coli BL21/pETSCR II的單菌落接種于3mL含100 y g/mL卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C ， 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含 100 ii g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37t:，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 6后，加入 0. lmmol/L異丙基-B-D-硫代半乳糖苷，于3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)6h ;10，000rpm離心lOmin收集菌 體，用生理鹽水洗滌菌體兩次，收集重組菌全細(xì)胞。
實(shí)施例5 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH5. 0)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為83. 1% e. e.，產(chǎn)率為68.4%。
實(shí)施例6 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100% e. e.，產(chǎn)率為98. 1%。
實(shí)施例7 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH6. 0)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為95. 3% e. e.，產(chǎn)率為79. 7%。
實(shí)施例8 取O. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH6. 5)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為88. 7% e. e.，產(chǎn)率為68. 2%。
實(shí)施例9取O. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為71. 5% e. e.，產(chǎn)率為57. 6% 。
實(shí)施例10 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液 (pH8.0)中，加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng) 結(jié)束后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為51. 9% e. e.，產(chǎn)率 為39. 1%。
實(shí)施例11 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在25t:恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為84.5% e. e.，產(chǎn)率為68.6%。
實(shí)施例12 取0. lg/mL實(shí)施例4中的重組菌全細(xì)胞，在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH5. 5)中， 加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，混勻后在35t:恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后混合 物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為94. 3% e. e.，產(chǎn)率為73. 7%。
實(shí)施例13目標(biāo)蛋白的表達(dá)
用實(shí)施例4中的菌液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，凝膠定量軟件(Quantity One)分析蛋白表達(dá)；將收集的重組菌溶解于20mmol/L， pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中，超聲破碎20min，工作時(shí)間2s，間歇時(shí)間6s。將破碎后的菌體于16， OOOrpm離心40min，分別取上清和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
實(shí)施例14目標(biāo)蛋白的純化 用實(shí)施例12中所獲得的菌體上清在AKTA蛋白純化系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白純化。第一步將上清掛Ni柱(His-Tr即Kit, Pharmacia)兩次，用MCAC-50的緩沖液洗脫雜蛋白，用MCAC-200的緩沖液洗脫含有目的蛋白的溶液；第二步用Hitr即(Pharmacia)柱蛋白脫鹽，緩沖液A :20mmol/L Tris/HCl， 500,1/L NaCl，pH8.0。緩沖液B :20mmol/L Tris/HCl，pH8. 0。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)，將蛋白溶液由A緩沖液換為B緩沖液；第三步用Resource Q陰離子交換柱(IX lcm， Pharmacia)進(jìn)行蛋白純化。緩沖液A:20mmol/L Tris/HCl，pH8. 0。緩沖液B :20mmol/L Tris/HCl， lmol/LNaCl，pH8. 0。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)，收集含有目的蛋白的溶液；第四步用Superdex 200(HiLoad 26/60， Pharmacia)進(jìn)行蛋白純化。緩沖液20mmol/LTris/HCl，150mmol/L NaCl，pH8.0。利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala， Sweden)，最終收集目的蛋白。 經(jīng)過以上四個(gè)步驟的純化工作，蛋白液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，純度可達(dá)
95%以上。 實(shí)施例15 用實(shí)施例13中所獲得的1 y g純蛋白進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH 5. 5)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，5mmol/LNADPH，混勻后在3(TC恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物為(R)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為96. 8 % e. e.，產(chǎn)率為90. 2 % 。
實(shí)施例16 用實(shí)施例13中所獲得的2 ii g純蛋白進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。在lmL 0. lmol/L醋酸緩沖液(pH 5.5)中，分別加入5g/L底物2-羥基苯乙酮，5mmol/L NADPH，混勻后在30。C恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后混合物離心，取上清液萃取，產(chǎn)物為(R)-苯基乙二醇的光學(xué)純度為100% e. e.，產(chǎn)率為98. 9%。
權(quán)利要求
一株制備(S)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21/pETSCRII，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM 209290。
2. 權(quán)利要求1所述重組菌株CCTCC NO :M 209290的構(gòu)建方法，其特征是將羰基還原酶基因scr II插入載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒pETSCR II，重組質(zhì)粒pETSCRII轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含100 y g/mL卡那霉素的LB平板篩選，獲得重組菌株E. coli BL21/pETSCRII，即CCTCCN0 :M 209290 ;步驟為:① (S)-羰基還原酶基因scr II的獲取用于釣取scr II基因的菌種為近平滑假絲酵母(C.par即silosis)CCTCC NO :M203011 ;羰基還原酶基因scr II的克隆以近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)CCTCCNO :M203011基因組為模板，以含有BamHI酶切位點(diǎn)的SCR II_F:5' -ATCGGATCCATGGGCGAAATCG AATCTTATTGC-3'，和含有Xhol酶切位點(diǎn)的SCR II_R :5' -TGACTCTCGAGTGGACAAGTGTAACCACCATCGAC-3'為引物，PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得scr II基因，基因全長(zhǎng)840bp ;基因scr II的GenBank編號(hào)為GQ411433 ;PCR體系為ddH20 35. 5 iiL， 10 X Reaction Buffer 5 ii L， 25mmol/L Mg2+3 ii L，(2. 5,1/L dNTP 4 ii L， Taq DNA Polymerase 0. 5 ii L， 25pmo1/ ii L的引物SCR II—F和SCRILR各1 ii L ;PCR反應(yīng)條件94。C 4min ;94。C lmin、56。C lmin、72。C lmin，30個(gè)循環(huán)；72。C 10min ;② 重組質(zhì)粒pETSCR II的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol對(duì)目的基因scr II和表達(dá)載體pET28a分別進(jìn)行雙酶切，處理后的DNA片斷通過粘性末端連接，獲得帶有羰基還原酶基因scr II的重組質(zhì)粒pETSCR II ;③ 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌取重組質(zhì)粒pETSCR II 2iiL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布到含有100iig/mL卡那霉素的LB平板上，37t:倒置培養(yǎng)過夜，獲得陽(yáng)性克隆E. coli BL21/pETSCR II。
3. 利用構(gòu)建的重組菌CCTCC NO :M209290不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是(1) 重組菌株CCTCC NO :M 209290的培養(yǎng)LB液體培養(yǎng)基，以g/100mL計(jì)胰蛋白胨1 %，酵母提取物0. 5%， NaCl 1 %， pH7. 0 ;需要時(shí)使用前加入卡那霉素100 ii g/mL，固體培養(yǎng)基再添加1. 5%瓊脂粉；培養(yǎng)條件挑取重組菌CCTCC NO :M 209290的單菌落接種于3mL含100 y g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37t:，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取lmL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50mL含100ii g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37t:，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6。。 0. 6，在培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)物0. lmmol/L異丙基-P -D-硫代半乳糖苷，于3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)6h ; 10， OOOrpm離心10min，收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細(xì)胞；(2) 以2-羥基苯乙酮為底物，進(jìn)行不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)在lmL 0. lmol/LpH4. 5 6. 0的醋酸緩沖液，或者lmL 0. lmol/L p朋.5 7. 5的磷酸緩沖液，或者lmL 0. lmol/L pH8. 0 (9. 0的Tris-HCl緩沖中進(jìn)行反應(yīng)，底物濃度2-羰基苯乙酮為5g/L，反應(yīng)溫度為25_35°C ;采用重組菌全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化重組菌全細(xì)胞濃度為0. lg/mL，反應(yīng)48h，反應(yīng)前不需要加入輔酶，產(chǎn)物為(S)-苯基乙二醇；或采用重組菌破碎后的上清液經(jīng)純化后的重組蛋白SCRII生物轉(zhuǎn)化重組蛋白SCRII濃度為1 2 ii g/mL，反應(yīng)8h，反應(yīng)前加5mmol/L輔酶NADPH，產(chǎn)物為(S)-苯基乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的方法，其特征是重組蛋白SCRII的純化菌體收集將收集的重組菌全細(xì)胞用MCAC-0緩沖液重懸，超聲破碎工作時(shí)間2s，間歇時(shí)間6s，共20min ;破碎液16， OOOrpm離心40min ;棄沉淀，取上清進(jìn)行后續(xù)的蛋白純化工作；蛋白純化先將上清掛Pharmac ia公司的Ni柱兩遍，用MCAC-20緩沖液洗脫雜蛋白，用MCAC-200緩沖液洗脫目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitr即柱蛋白脫鹽，利用Pharmacia公司的AKTA蛋白純化系統(tǒng)將蛋白溶液換為無鹽的緩沖液；接著用Pharmacia公司的Resource Q陰離子交換柱，1 X lcm，進(jìn)行蛋白純化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200， HiLoad 26/60，進(jìn)行蛋白純化；經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度達(dá)到95%以上。
全文摘要
一株羰基還原酶重組菌高效制備(S)-苯基乙二醇的方法，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種新型的近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)羰基還原酶基因scr II，Genbank序列號(hào)為GQ411433，將scrII插入載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒pETSCR II，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過含100μg/mL卡那霉素的LB平板篩選，獲得重組菌株E.coliBL21/pETSCRII，保藏編號(hào)CCTCC NOM209290。該重組菌細(xì)胞不對(duì)稱還原5g/L 2-羰基苯乙酮，催化獲得(S)-苯基乙二醇，產(chǎn)物的光學(xué)純度為100％，產(chǎn)率達(dá)98.1％。本發(fā)明為高效制備(S)-苯基乙二醇提供了新型功能基因和有效途徑。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101717745SQ20091026314
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者張榮珍, 徐巖, 耿亞維 申請(qǐng)人:江南大學(xué)