專利名稱：一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，尤其涉及一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核 表達方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡稱SOD; EC 1.15.1.1)系一類金屬抗 氧化酶，廣泛存在于生物體中，它能夠催化超氧陰離子(02_)發(fā)生歧化反應，從而 清除自由基，在生物體防御氧化損傷的過程中發(fā)揮著重要作用(Fridovich I. 1995. Superoxide radical and superoxide dismutases. ^www及ev 5z'oc/ze附64: 97-112.)。根據(jù)酶 分子中所含金屬輔基的不同，SOD主要可分為Cu/Zn-SOD (多存在于真核生物)、 Mn-SOD (多存在于原核細胞和真核細胞線粒體)和Fe-SOD (存在于原核細胞和高等 植物葉綠體)等類型。SOD作為自由基清除劑，已被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和日用 化妝品等各個領域(方允中，李文杰。自由基與酶?？茖W出版社，1989)。在醫(yī)藥 上，SOD可用于治療氧中毒、糖尿病、輕度燒傷及多種炎癥等，在臨床上都有較好 的效果。在食品工業(yè)上，由于SOD無毒，無副作用，可作為食品添加劑用于飲料、 口香糖及保健食品的生產(chǎn)。此外，在化妝品中添加SOD，可起到防止皮膚衰老和治 療皮膚疾病的作用。
現(xiàn)在市售的SOD多數(shù)為從哺乳動物牛、豬等動物肝臟中提取，隨著瘋牛病、 口蹄疫、禽流感、豬流感等流行，安全性問題日漸凸顯。另外，傳統(tǒng)的提取方法還 存在原料有限、分離純化困難、產(chǎn)量低等缺陷。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建工程 菌株以實現(xiàn)SOD的高效、廉價化生產(chǎn)和制備無疑成為SOD規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。 相對于酵母、昆蟲細胞等眾多外源表達系統(tǒng)，大腸桿菌由于具有生長速度快、培養(yǎng)基廉價、技術(shù)方案簡單可行、載體及受體菌株多元化等優(yōu)勢而成為理想的基因工程 受體菌。
真核生物一般具有Cu/Zn-型和Mn-型兩類SOD，其中多數(shù)的Cu/Zn-SOD都需 要專一的分子伴侶CCS來傳遞金屬輔基012+并催化分子間二硫鍵的形成而實現(xiàn)酶 的轉(zhuǎn)錄后激活。研究表明釀酒酵母CCS基因Z"7缺失突變株的Cu/Zn-SOD表達量 不變，但不具備清除氧自由基的活性(Culotta VC, Klomp LWJ, Strain J, Casareno RLB, Krems B, Gitlin JD. 1997. The copper chaperone for superoxide dismutase. J Biol Chem 272: 23469-23472)。真核生物Cu/Zn-SOD對專一分子伴侶的普遍依賴性無疑成為此 類活性蛋白在缺乏CCS的原核表達體系中實現(xiàn)高效表達的最大瓶頸。但是據(jù)報道， 在少數(shù)真核生物中仍存在不依賴于專一性分子伴侶CCS的Cu/Zn-SOD激活途徑。 如人源的Cu/Zn-SOD (hSOD)在在缺失分子伴侶的情況下仍具有一定活性(Carroll MC, Girouard JB, Ulloa JL, Subramaniam JR, Wong PC, Valentine JS, Culotta VC. 2004. Mechanisms for activating Cu and Zn-containing superoxide dismutase in the absence of the CCS Cu chaperone. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 5964-5969);秀麗廣桿線蟲 Cae"or/wM!他e/ega w的SOD (CeSOD)激活則完全不需要伴侶(Jensen LT, Culotta VC. 2005. Activation of CuZn superoxide dismutases from CaewoWwrWto does not require the copper chaperone CCS. J Biol Chem 280: 41373-41379)。通過三者序列 比對推測，釀酒酵母SOD對CCS的完全依賴性可能與其C末端存在的兩個脯氨酸 有關(guān)。將hSOD (Carroll2004)和CeSOD (Jensen W"/ ， 2005)中相應位點的氨基 酸突變?yōu)楦彼岷?，這兩種酶在CCS缺失條件下亦失活。這一現(xiàn)象為我們改造真核 生物Cu/Zn-SOD，克服其對專一分子伴侶的依賴性，實現(xiàn)此類SOD在五.Co"體系 中的規(guī)模化生產(chǎn)提供了思路，但迄今這一技術(shù)路線未見在真菌中成功實施的案例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核
5表達方法，它通過基因融合及定點突變技術(shù)，克服真核Cu/Zn-SOD對分子伴侶的普 遍依賴性，實現(xiàn)真核Cu/Zn-SOD在缺乏伴侶的原核表達體系中的的簡單化和規(guī)?；a(chǎn)。
為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，它包括以下步驟
(1) SWbW基因的克隆
①朋5bW保守區(qū)序列的克隆通過Clustal比對GenBank數(shù)據(jù)庫中多種絲狀真 菌的Cu/Zn-SOD氨基酸序列(http:〃www.ncbi.nlm.nih/gov/genbank/index.htlm)，針對 保守區(qū)域設計簡并引物；以球孢白僵菌Bb2860基因組為模板，擴增得到56SoW的 部分片段(282 bp)。②^^oW全長基因克隆及結(jié)構(gòu)分析以①所得的保守序列為 基礎設計引物，利用DNA Walking SpeedUp Premix Kit-II試劑盒(Seegene， Seoul, Korea)擴增獲得保守區(qū)段的側(cè)翼序列。對所得的序列進行拼接，并分析BbSodl基 因的結(jié)構(gòu)(內(nèi)含子-外顯子排列)，獲得該基因的編碼區(qū)序列。③56&J/cDNA編碼 區(qū)序列的克隆根據(jù)加5W/編碼區(qū)的5'端和3'端序列設計引物；TRIZOL法提取 Bb2860的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄，以此為模板擴增得到的ORF序列。
(2) 釀酒酵母Z^7基因的克隆
①釀酒酵母Y187基因組提取挑取Y187單克隆于2 ml YPD培養(yǎng)液(2%胰蛋 白胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物)中28°C培養(yǎng)過夜，利用真菌基因組提取試劑盒 (Bioflux fungal genomic DNA extraction kit, Bioer， China)提取基因組。②Z^j7基因 的克隆根據(jù)丄"7基因編碼區(qū)序歹!j(GenBank Accession number: AY558398)設計引 物，擴增得到750bp的Z^7基因序列。
(3) 原核表達載體pET-BbSodl、 pET-BbSodl-Lys7及pET-BbSodl-Mut的構(gòu)建 ①構(gòu)建pET-BbSodl:編碼區(qū)序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶7WM和州"Jin消化
后插入原核表達載體pET-29b+中，構(gòu)建原核表達載體pET-BbSodl。②構(gòu)建 pET-BbSodl- Lys7:應用基因重疊延伸技術(shù)(splicing-by-overlap extension, SOE),融 合基因與Z"7基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶AWd和///"dn消化后插入原核表達載體pET-29b+中，構(gòu)建融合基因的原核表達載體pET-BbSodl-Lys7。③構(gòu)建 pET-BbSodl-Mut:利用定點突變技術(shù)，將^^o^編碼蛋白C末端的兩個兩個脯氨 酸分別突變?yōu)榻z氨酸和亮氨酸(P143S與P145L)，突變后的基因加SoW-MW經(jīng)限制 性內(nèi)切酶和///"dll消化后插入原核表達載體pET-29b+中，構(gòu)建原核表達載體 pET-BbSodl-Mut。
(4) 重組質(zhì)粒的擴增及蛋白表達
將重組質(zhì)粒pET-BbSodl 、 pET-BbSodl- Lys7及pET-BbSodl-Mut經(jīng)CaCl2化學 轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌C&cfenW^ co//) DH5a菌株中，經(jīng)菌落PCR鑒定、酶 切鑒定及測序確認后，提取陽性克隆質(zhì)粒，然后將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)入K co"BL21 (DE3)菌 株中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時加入Isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG)、 Cu2^Q Zi^+進行誘導，獲得超表達的可溶性目的蛋白。
(5) 蛋白純化
誘導表達目的蛋白的工程菌細胞培養(yǎng)物，經(jīng)超聲波破碎和離心后，獲得可溶蛋 白的粗提物，再通過N嚴親和層析進行純化，收集電泳純的活性洗脫液，脫鹽后于 -2(TC下長期保存。
步驟一，(1)-①所述的擴增565bW保守區(qū)的簡并引物序列為
正向引物5'-GACAAYACCAACGGCTGCAC-3'
反向弓I物5'-GGYACYGAYGAYCTYGG-3' 步驟二， (l)-(D所述的擴增56SoW編碼區(qū)的引物序列為
正向引物5'-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'
反向引物5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3' 步驟三，(3)-③所述的用于定點突變56SoW的引物為
正向引物5'陽GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'
反向引物
5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACCGCAGGC04GGCG4(^TCCAGCG-3'
步驟四，(4)所述的誘導目的蛋白表達加入的012+和Zi^+離子濃度分別為2.5 mM 禾口 0.5 mM。
由于采用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明巧妙地利用基因融合及定點突變技術(shù)，實 現(xiàn)了 SZ^oJ7在技術(shù)體系成熟的原核表達體系中的高效表達。尤其所表達的BbSodl 定點突變體BbSodl-Mut，工程菌株粗提物的SOD酶活相當于帶分子伴侶的融合酶 BbSodl-Lys7的2.8倍和無分子伴侶BbSodl的21.2倍；純化BbSodl-Mut的SOD 酶活相當于BbSodl-Lys7S的5.3倍。本發(fā)明有效克服了真核生物Cu/Zn-SOD對專 一性分子伴侶CCS的普遍依賴性，為解決工業(yè)上從動植物中提取SOD的原料限制 問題提供了基于原核工程菌株的新技術(shù)，具有重要的工業(yè)應用前景。


圖1是本發(fā)明中重組球孢白僵菌BbSodl、 BbSodl-Lys7和BbSodl-Mut蛋白的
可溶性分析及純化圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法依次包括以 下步驟
1.5MoW基因的克隆
(1) SMoW保守區(qū)序列的克隆
①球孢子白僵菌fSeam;en'a 6a^a憩)2860菌株總DNA的提取接種孢子懸浮 液于SDAY(4y。葡萄糖，1%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.5%瓊脂粉)平板上，在25'C 下培養(yǎng)3天后，通過液氮研磨法提取總DNA。②簡并引物設計通過Clustal比對 GenBank數(shù)據(jù)庫中6種己報道的絲狀真菌Cu/Zn-SOD氨基酸序列(登錄號分別為 AF305546、 DQ493760、 AJ344050、 DQ530599、 AY176061及M58687)，針對保守
8區(qū)域設計簡并引物。簡并引物序列為
正向引物(序列表中第l個序列)5'-GACAAYACCAACGGCTGCAC-3' 反向引物(序列表中第2個序列)5'-GGYACYGAYGAYCTYGG-3' ③保守片段的擴增以2860菌株基因組為模板，擴增得565bW的部分片段(282bp)。 PCR采用50nl體系，包括50ng真菌DNA、 0.2pM引物、0.2mMdNTP、 2.5 mM MgC12、 lxtog聚合酶緩沖液和2.5Uto^聚合酶?；靹蚝笙?4。C變性5min，此后經(jīng) 35個循環(huán)94。C變性30 s、6(TC退火30 s和72'C延伸30 s;循環(huán)后72'C再延伸7 min。 擴增得到接近300bp的片段，割膠回收，與pGEMT-easy載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化及鑒定 后送樣測序，確定得到的序列為朋SoW的部分序列(朋SoWpartial)如下(序列表中 第3個序列)
g3C3ac3cc33cggctgcacctcggctggccctc3Cttc肌cccgcacggc肌g3cccacggcgctccctctg3cgccgtcc gccacgttggtgatctcggcaacattaagacggacgcccagggcaacgccaagggctccgttcaggacagccacgtcaagct gattggccctcacagcgttgttggcgtacgtgcatccctggtaattcgagtctcgttgcctttgctaacatgtgtttagcgtaccgtc gttgtccacgctggcaccgacgacctcggc
(2) 3&foW全長基因克隆及結(jié)構(gòu)分析
以(l)所得的保守序列為基礎設計引物，利用DNA Walking SpeedUpTM Premix Kit-II試劑盒(Seegene, Seoul, Korea)擴增獲得保守區(qū)段的側(cè)翼序列。對所得的序 列進行拼接，并分析^^o^基因的結(jié)構(gòu)(內(nèi)含子-外顯子排列)，獲得該基因的編碼 區(qū)序列。
上游側(cè)翼序列Walking用引物序列
Sod-upRl (序列表中第4個序列)；TACGCCAACAACGCTGTGAGG Sod-upR2 (序列表中第5個序列)；GAGCGCCGTGGGTCTTGC 下游側(cè)翼序列Walking用引物
Sod-dnFl (序列表中第6個序列)CAACCCGCACGGCAAGAC Sod-dnF2 (序列表中第7個序列)CCTCACAGCGTTGTTGGCGT所獲S65bW基因全序列如下(序列表中第8個序列)
gcttggttcgtagcgctttttttattgcaaagcttggcccctccaacggagccgtagcttttccaggaccggccagcgtctggctga
gcgttttcgtcgggcag3ag3aaagccgcccacg3ccagacagctttatteagctcccctcttcccctccccctcc3Ctgcatcat
C3cctcctcc3cttcg3atcatcaccatcccaactc3a犯gcaaa3caa3c3aaatcaatcaaa
ATGGTCAAAGCAGgtaagaatcgatcgagaataccatcaccgcatcgcgatatacctgtccccagatgatgctagtg
gc犯aactgctagggtggc3cccggg3catttateggtcgtggcggctgcgtgtg幼cgcgctggtttgcgctggtttttagccc
gcccggttgcatcatggctcattcgataccttgatggactgggccgcgctgcacctttgatcaagggccttgatggcaccgcatct
gcattgtctcagcagct加actcattattacccaaaaaaggaaaaaaaaaactgccaacaagctccgagctaacctctgccgtt
ccgtctggttctagTCTGTGTCCTTCGTGGCGACGCCAGGGTTGCCGGTACTGTCACCT
CTGATTGGCCCTCACAGCGTTGTTGGCgtacgtgcatccctggtaattcgagtctcettgcctttgctaac atgtgtttagCGTACCGTCGTTGTCCACGCTGGCACCGACGACCTCGGCAAGGGCGG
agacttacatctggcaacagacattgcgtgaatactaaccgtttatcagGTGTCATTGGCGTTGCCAACTAG
gatgcgcaactccgaaaaaacgaaaatctggtatgacaactgattgatacaaaattatgtagctcaaaatacgggtccggatccg gacttggagctttgtagcttgatgttaggtagagataatttcatccaacgaagaatcacgtcatcactgcttcgcttgatagtatcatc tgtgctgcagtcgtttacttttttccgtctcggcgcacttagacgctcaattttacatatagc (3) ^Sw/7cDNA編碼區(qū)序列的克隆
①球孢子白僵菌總RNA的提取接種球孢白僵菌孢子懸浮液于SDAY平板上， 在25。C條件下培養(yǎng)3天后，稱取100mg菌絲于研缽中，液氮研磨至粉末，而后加 入1 ml TRIzol Reagent,再研磨，而后采用酚-氯仿法抽提總RNA。②mRNA的逆 轉(zhuǎn)錄取2 )xl高純水和1 |xl 0.66 mg/ml Oligo (dt)引物[5'-gactcgagtcgacatcga(t)17-3'] 與白僵菌RNA樣品2 nl混勻，用于反轉(zhuǎn)錄。反應體系在70'C下保溫5 min后，將PCR管轉(zhuǎn)入冰浴50min以上，再加入dNTP、 RNase抑制劑、RTenzyme及緩沖液， 混勻后25。C下5 min、 42。C下60 min、 70。C下15 min進行處理，獲得cDNA模板用 于擴增。③56SoW編碼區(qū)的擴增據(jù)B6&W/編碼區(qū)的5'端和3'端序列設計引物， 擴增5Z^oW編碼區(qū)，PCR擴增體系及循環(huán)條件同(l)-③。
正向引物(序列表中第9個序列) 5'-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'
反向引物(序列表中第IO個序列) 5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3'
上下游引物的5'端分別加上酶切位點M/d和/Z/"^111。擴增獲得450 bp左右的目的 片段，割膠回收后連接到pGEM-T并轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及酶切鑒定后的陽性克隆作測序 鑒定。
2.釀酒酵母^vs7基因的克隆
(1) 釀酒酵母Y187基因組提取
挑取Yl87單克隆于2 ml YPD培養(yǎng)液(2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物) 中培養(yǎng)過夜(28°C， 150r/m)，利用真菌基因組提取試劑盒(Bioflux fungal genomic DNA extraction kit, Bioer, China)提取基因組。
(2) Z^7基因的克隆
根據(jù)Z^7基因編碼區(qū)序列(GenBank Accession number: AY558398)設計引物， 擴增Z"7基因序列，PCR擴增體系及循環(huán)條件同(1)③，延伸時間為45sec。上下游 引物序列
正向引物(序列表中第9個序列)
5'-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'
反向引物(序列表中第10個序列)
5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3'
11擴增獲得750 bp左右的目的片段，割膠回收后連接到pGEM-T并轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR 及酶切鑒定后的陽性克隆送Invitrogen上海公司測序。
3. 原核表達載體pET-BbSodl、 pET-BbSodl-Lys7及pET-BbSodl-Mut的構(gòu)建
①pET-BbSodl構(gòu)建朋SoW編碼區(qū)序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶iV&I和ffiw/111消化 后插入原核表達載體pET-29b+中，構(gòu)建原核表達載體pET-BbSodl。②pET-BbSodl-Lys7構(gòu)建應用基因重疊延伸技術(shù)(splicing-by-overlap extension, SOE)，融合5WbW 基因與Zj^7基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶AWd和7//wcffll消化后插入原核表達載體 pET-29b+中，構(gòu)建融合基因的原核表達載體pET-BbSodl-Lys7。③pET-BbSodl-Mut 構(gòu)建利用定點突變技術(shù)，將BbSodl蛋白C末端的兩個兩個脯氨酸分別突變?yōu)榻z 氨酸和亮氨酸(即P143S和P145L)，突變后的基因BbSodl-Mut經(jīng)限制性內(nèi)切酶A^d 和消化后插入原核表達載體pET-29b+中，構(gòu)建原核表達載體 pET-BbSodl-Mut。上下游引物序列
正向引物(序列表中第ll個序列)
5'-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'
反向引物(序列表中第12個序列)
5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACCGCAGGCG4GGCa404 TCCAGCG-3'
4. 重組質(zhì)粒的擴增及目的蛋白表達
將重組質(zhì)粒pET-BbSodl、 pET-BbSodl-Lys7及pET-BbSodl-Mut經(jīng)CaCb化學 轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌co// DH5cc，經(jīng)過菌落PCR鑒定及酶切鑒定及測序后， 提取陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化五.co//BL21 (DE3)，于37。C、 150 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù) 生長期(OD6oo=0.8)，而后加入0.5 mM IPTG、 2.5 mM 012+和0.5 mM Zn2+在20°C 和150 r/min條件下誘導培養(yǎng)過夜。5. 重組蛋白的可溶性分析
通過離心收集步驟4中誘導后的菌液，進行細胞超聲破碎，運行程序為為超聲 時間15 s、間隙時間15 s及全程時間20 min。 4°C下10000 g離心收集上清后，用 不連續(xù)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳緩沖液系統(tǒng)進行分析。 取20 nL破碎上清液，加入5.0 5x上樣緩沖液[60 mM Tris-HCl， pH 6.8; 25% (w/v) 甘油；2% (w/v) SDS, 14.4 mM P-巰基乙醇和0.1%溴酚藍]。不連續(xù)凝膠中濃縮膠和 分離膠濃度分別為5%和12.5%。各泳道的上樣量為15pL，在HoeferminiVE垂直 電泳系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)上進行電泳。樣品在濃縮膠中的電流保持 12 mA，在分離膠中的電流保持18 mA。電泳結(jié)束后。凝膠在染色液(1.20 g考馬 撕亮藍R250、 250 mL乙醇、80 mL乙酸和670 mL dd-H20)中染色過夜，然后在脫 色液(250mL乙醇、80mL乙酸和670mLdd-H2O)中脫色，直至背景無色。
圖1中SDS-PAGE結(jié)果顯示，三種重組蛋白菌在受體菌中均以可溶性形式大量 表達。圖1中M代表蛋白分子量標記。泳道1~3分別為大腸桿菌BL21工程菌株培 養(yǎng)液粗提物中可溶性的BbSodl 、 BbSodl-Mut和BbSodl-Lys7圖譜(箭頭)，泳道4~6 分別為純化后的BbSodl、 BbSodl-Mut及BbSodl-Lys7圖譜。
6. 蛋白純化
由于重組蛋白帶有6xHis標簽，可采用N嚴親和層析進行純化。
(1) 取誘導后菌液50 ml， 4'C下5000 r/min離心10 min收集菌體，沉淀懸浮于 25 ml Binding Buffer (50 mM Tris陽HCl, pH 7.8, 500 mM NaCl禾卩5 mM咪唑)中，冰 浴下超聲波破碎菌體，4'C下12000 r/min離心25 min,取上清4'C保存?zhèn)溆谩?br> (2) 采用AKTApurifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)純化系統(tǒng)對目的蛋白進 行純化。上樣前，使用10倍柱體積的Binding Buffer以5 ml/min的流速平衡鎳柱； 流速為1 ml/min上樣，再次以Binding Buffer以5 ml/min的流速平衡鎳柱5-10個體積；梯度洗脫，依次以10%、 20%、 30%和100%的Elution Buffer洗脫5個柱體積， 流速為5 ml/min，進行OD280蛋白吸收峰收集洗脫液。收集洗脫峰通過SDS-PAGE 分析檢測純度。
(3) SDS-PAGE鑒定獲得的純化部分用Sephadex G-25脫鹽。
7.粗酶液及純化蛋白的酶活及蛋白濃度測定
(1)酶活測定。通過測定樣品對鄰苯三酚自氧化速度的抑制率來反應樣品中 SOD的含量。酶活性單位的定義每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量 定義為一個酶活單位。由此，每毫升酶液的SOD酶活單位數(shù)(U/ml)S計算為
式中，^為鄰苯三酚自氧化速率(OD325的變化速率控制在0.060/min)， ^為SOD抑制 鄰苯三酚后的自氧化速率，iV樣品稀釋倍數(shù)，F(xiàn)o反應液總體積(0.9 ml)， ^加入的待 測樣品體積。
(2 )蛋白濃度測定。用Folin-酚法測定SOD酶液中的總蛋白濃度(mg/ml)。 (3)絕對SOD酶活的換算。根據(jù)(1)和(2)的測定結(jié)果，將目的蛋白的SOD 酶活換算為每毫克蛋白的酶活單位數(shù)(U/mg蛋白)，列于下表
表l球孢白僵菌BbSodl、 BbSodl-Mut和BbSodl-Lys7在大腸桿菌BL21菌株中重 組表達的的粗提物與純化品的SOD酶活比較
被表達蛋白
對照(無目的基因的空質(zhì)粒表達) BbSodl (不作任何改變的原態(tài)酶) BbSodl-Mut (P143S與P145L定點突變酶) BbSodl-Lys7 (帶分子伴侶Lys7的融合酶)
平均(土SD) SOD酶活+， U/mg蛋白 ~~粗提物酶活 純化品酶活~" 191.98±2.89c
178.66土7,20c O.OO土O.OO 3788.05土41.79a23090.94±227.22 a 1331.25±16.24 b 4374.43±72.85 b
*同一列中相同字母的均值得表示差異不顯著(LSD,戶X).05)
14序列表
<110>浙江大學
<120> —種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法
<130>
<160> 12
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gac肪yacc3 acggctgcac 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
ggyacygayg ayctygg 17<210> 3
<211> 282
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana
<400> 3
gac幼cacca acggctgcac ctcggctggc cctc3cttc3 acccgcacgg caagacccac
ggcgctccct ctgacgccgt ccgccacgtt ggtgatctcg gcaacattaa gacggacgcc 120
cagggcaacg ccaagggctc cgttcaggac agccacgtca agctgattgg ccctcacagc 180
gttgttggcg tacgtgcatc cctggtaatt cgagtctcgt tgcctttgct aacatgtgtt 240
tagcgtaccg tcgttgtcca cgctggcacc gacgacctcg gc 282
<210> 4
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<400> 4
tacgccaaca acgctgtgag g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列g(shù)agcgccgtg ggtcttgc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<400> 6
caacccgcac ggcaagac 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 7
cctcacagcg ttgttggcgt 20
<210> 8 <211> 1380 <212> DNA
17<213> Beauveria bassiana <400> 8
gcttggttcg tagcgctttt tttattgcaa agcttggccc ctccaacgga gccgtagctt 60
ttccaggacc ggccagcgtc tggctgagcg ttttcgtcgg gcagaagaaa agccgcccac 120
gaccagacag ctttattaag ctcccctctt cccctccccc tccactgcat catcacctcc 180
tccacttcga atcatcacca tcccaactca aaagcaaaac aaacaaaatc aatcaaaatg 240
gtcaaagcag gtaagaatcg atcgagaata ccatcaccgc atcgcgatat acctgtcccc 300
agatgatgct agtggcagaa ctgctagggt ggcacccggg acatttatag gtcgtggcgg 360
ctgcgtgtga acgcgctggt ttgcgctggt ttttagcccg cccggttgca tcatggctca 420
ttcgatacct tgatggactg ggccgcgctg cacctttgat caagggcctt gatggcaccg 480
catctgcatt gtctcagcag ctgtttactc attattaccc aaaaaaggaa aaaaaaaact 540
gccaacaagc tccgagctaa cctctgccgt tccgtctggt tctagtctgt gtccttcgtg 600
gcgacgccag ggttgccggt actgtcacct ttgagcaaga gtccgagtcg gctgccacca 660
ccatcacctg ggacatctcg ggcaacgacc cc肌cgcgga gcgcggcttc cacatccaca ，
cctttggtga c犯caccaac ggctgcacct cggctggccc tcacttcaac ccgcacggca 780
agacccacgg cgctccctct gacgccgtcc gccacgttgg tgatctcggc aacattaaga 840
cggacgccca gggc犯cgcc aagggctccg ttcaggacag ccacgtc犯g ctgattggcc ■
ctcacagcgt tgttggcgta cgtgcatccc tggtaattcg agtctcgttg cctttgctaa 960
catgtgttta gcgtaccgtc gttgtccacg ctggcaccga cgacctcggc aagggcggca 1020
acgaagagtc cctcaagact ggcaacgctg gacctcgccc ggcctgcggt aagacttaca 1080
tctggcaaca gacattgcgt gaatactaac cgtttatcag gtgtcattgg cgttgccaac 1140
taggatgcgc aactccgaaa aaacgaaaat ctggtatgac aactgattga tacaaaatta 1200
18tgtagctcaa aatacgggtc cggatccgga cttggagctt tgtagcttga tgttaggtag 1260 agataatttc atccaacgaa gaatcacgtc atcactgctt cgcttgatag tatcatctgt 1320 gctgcagtcg tttacttttt tccgtctcgg cgcacttaga cgctcaattt tacatatagc 1380
<210> 9
<211> 32
<212> DNA <213>人工序列
<400> 9
ggaattccat atggtcaaag cagtctgtgt cc 32
<210> 10
<211> 30
<212> DNA <213>人工序列
<400> 10
ccc肌gcttg ttggcaacgc caatgscacc :30
<210> 11 <211> 32 <212> DNA<213>人工序列 <400> 11
ggaattccat atggtcaaag cagtctgtgt cc 32
<210> 12
<211> 52
<212> DNA <213>人工序列
<400> 12
cccaagcttg ttggcaacgc c肌tg3cacc gcaggcgagg cgagatccag eg 5權(quán)利要求
1.一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法，其特征在于它包括對BbSod1基因的克隆，在獲得BbSod1基因的基礎上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-BbSod1-Mut，然后對重組質(zhì)粒進行擴增及蛋白表達；所述BbSod1基因的克隆包括對BbSod1保守區(qū)序列的克隆，在BbSod1保守區(qū)序列的基礎上獲得BbSod1編碼區(qū)序列，然后在BbSod1編碼區(qū)序列的基礎上再獲得BbSod1 cDNA編碼區(qū)序列；所述原核表達載體pET-BbSod1-Mut的構(gòu)建是將BbSod1編碼蛋白C末端的兩個脯氨酸分別突變?yōu)榻z氨酸和亮氨酸(P143S與P145L)，突變后的基因BbSod1-Mut經(jīng)限制性酶酶切后插入原核表達載體中得到。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述原核表達方法還包括釀酒酵母￡"7基因的克隆，所述釀酒酵母基因的克隆包括釀酒酵母Y187基因組的提取和Z"7基因的克隆。
3. 如權(quán)利要求2所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于在構(gòu)建所述重組質(zhì)粒pET-BbSodl-Mut的同時，還構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-BbSodl和pET-BbSodl- Lys7。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述56SoW保守區(qū)序列克隆的簡并引物序列為正向引物5'-GACAAYACCAACGGCTGCAC-3'， 反向引物5'-GGYACYGAYGAYCTYGG-3'。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述5Mo^/保守區(qū)序列以球孢白僵菌Bb2860 (5eawven力&a^a"a (Balsamo) Vuellemin)基因組為模板擴增得到。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述萬WoW編碼區(qū)的引物序列為正向引物5'誦GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3'， 反向引物5'陽CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3、
7. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述重組質(zhì)粒pET-BbSodl -Mut的基因BbSodl-Mut經(jīng)限制性內(nèi)切酶和T7/m/in消化后插入到原核表達載體。
8. 如權(quán)利要求6所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述用于定點突變56&K//的引物為正向引物5'-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC隱3'，反向引物5'-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACCGCAGGCG-4GGCa4ft4 TCCAGCG-3'。
9. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述所述蛋白表達的誘導條件為20'C和150 r/min振蕩誘導過夜。
10. 如權(quán)利要求1所述的一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法， 其特征在于所述所述誘導目的蛋白表達時加入的IPTG、 012+和Zi^+離子濃度分別 為0.5mM、 2.5 mM禾卩0.5 mM。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侶的原核表達方法，它包括以下步驟BbSod1基因的克?。会劸平湍窵ys7基因的克?。辉吮磉_載體pET-BbSod1、pET-BbSod1-Lys7及pET-BbSod1-Mut的構(gòu)建；重組質(zhì)粒的擴增及蛋白表達及蛋白純化。本發(fā)明巧妙地利用基因融合及定點突變技術(shù)，實現(xiàn)了BbSod1在技術(shù)體系成熟的原核表達體系中的高效表達。尤其所表達的BbSod1定點突變體BbSod1-Mut，工程菌株粗提物的SOD酶活相當于帶分子伴侶的融合酶BbSod1-Lys7的2.8倍和無分子伴侶BbSod1的21.2倍；純化BbSod1-Mut的SOD酶活相當于BbSod1-Lys7S的5.3倍。本發(fā)明有效克服了真核生物Cu/Zn-SOD對專一性分子伴侶CCS的普遍依賴性，為解決工業(yè)上從動植物中提取SOD的原料限制問題提供了基于原核工程菌株的新技術(shù)，具有重要的工業(yè)應用前景。
文檔編號C12N15/74GK101603048SQ20091010061
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者馮明光, 謝雪欽 申請人:浙江大學