專利名稱：一步純化固定化γ-內(nèi)酰胺酶及拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶工程領域，具體說是一種固定化，內(nèi)酰胺水解酶新技術拆分
(±)2-氮雜雙環(huán)-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(7-內(nèi)酰胺)。
背景技術：
(-)Y-內(nèi)酰胺((-)2-氮雜雙環(huán)-[2.2.1]-庚垸-5-烯-3-酮)是合成許多生物活性化
合物的重要中間體，可合成阿巴卡韋等抗艾滋病手性藥物。
通過手性化合物拆分來制備光學純手性化合物的方法，歸納起來(l)根 據(jù)起始原料分為外消旋體拆分法和不對稱合成法；(2)根據(jù)所用手段分為化學 法和生物催化兩種類型。微生物酶法拆分技術由于具有酶促催化反應的特點， 而備受科研工作者的青睞。微生物酶法拆分是利用微生物細胞內(nèi)所含的酶， 或用細胞中分離出的酶作為催化劑，通過化學酶催化反應拆分外消旋體的方 法。酶拆分的獨特作用是由于它們由L-氨基酸組成。其活性中心構(gòu)成了一個 不對稱環(huán)境有利于識別對映體。因而酶是高度手性的催化劑，具有高度的立 體選擇性。微生物種類及其體內(nèi)生物催化反應種類繁多，因此微生物酶法拆 分手性化合物的研究具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?br> 目前，國內(nèi)外許多科研工作者從事利用生物轉(zhuǎn)化法拆分(士)Y-內(nèi)酰胺的研 究，并取得了良好的效果。NakanoHiroto等進行了利用脂肪酶的立體選擇性， 拆分y-內(nèi)酰胺的外消旋體的研究；Taylor Stephen和Talor Steve通過完整細胞轉(zhuǎn)
化實驗，利用內(nèi)酰胺酶對(士)Y-內(nèi)酰胺進行拆分，并取得良好的效果； Mahmoudian M等提出了一種微生物酶法拆分？內(nèi)酰胺外消旋體化合物的方 法；Toogood等克隆了嗜熱的Sulfolobussolfataricus菌株中的Y-酰胺酶基因，分
離得到Y(jié)-內(nèi)酰胺酶，該酶熱穩(wěn)定性強，催化Y-內(nèi)酰胺水解反應有很高的選擇性。
本發(fā)明將帶有硫磺礦硫化葉菌耐熱酰胺水解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，表達了能水解(+)Y-內(nèi)酰胺，拆分(士)Y-內(nèi)酰胺的酶。游離酶的空間結(jié)構(gòu)易 受各種因素如物理因素(溫度、壓力、電磁場)、化學因素(氧化、還原、有 機溶劑、金屬離子、離子強度、pH)和生物因素(酶修飾和酶降解)的影響，酶 生物活力有可能喪失。游離酶即使在最適條件下，也會部分失活，隨著反應時間的延長，反應速率會逐漸下降，反應后不能回收，加大了產(chǎn)物提純難度， 增加生產(chǎn)成本。所以，對于現(xiàn)代工業(yè)來說，游離酶酶并很不理想。 與游離酶相比，固定化酶具有以下的優(yōu)點
(1) 固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開；
(2) 可以在較長時間內(nèi)進行反復分批反應和裝柱連續(xù)反應；
(3) 提高酶的穩(wěn)定性；
(4) 對酶反應過程能夠嚴格控制；
(5) 產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；
(6) 酶的使用效率提高，成本降低。
固定化酶，是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進行反應， 反應后的酶可以回收重復使用，它將游離酶的催化活動完全或基本上限制在 一定空間范圍內(nèi)的過程。酶的固定化方法很多，通常按照用于結(jié)合的化學反 應的類型進行分類，分別為吸附法、交聯(lián)法、共價鍵結(jié)合法和包埋法四大 類。對于蛋白一級結(jié)構(gòu)已知的酶，結(jié)合蛋白一級結(jié)構(gòu)的特點來采取相應固定 化方法。
金屬鰲合親和層析(Metal Chelate Affinity Chromatography, MCAC)或固定 化金屬離子親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,簡稱 IMAC)，是近30年發(fā)展起來的一項分離技術。它是利用金屬離子鰲合配體與 蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基發(fā)生親和 結(jié)合作用的原理進行蛋白質(zhì)分離及純化，其中以咪唑基的結(jié)合作用最強。由 于它具有配基簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，逐漸成為 分離純化蛋白質(zhì)等生物工程產(chǎn)品最有效的技術之一。
本發(fā)明將酶一步純化固定化于金屬鰲合親和層析介質(zhì)上，與傳統(tǒng)酶固定 化相比具有以下潛在的優(yōu)勢
(1) 本發(fā)明一步完成酶的純化與固定化過程。傳統(tǒng)酶的純化、固定化過程， 首先經(jīng)過復雜的蛋白純化過程①硫酸銨分級沉淀法除粗蛋白，②得到的蛋 白進一步透析除鹽，③相對純一點的酶進一步過DEAE-sepharose fast flow及強 陽、陰離子交換柱等等柱子獲得純酶；④然后將純酶固定于載體上。
(2) 蛋白質(zhì)和金屬離子鰲合載體通過過渡金屬離子形成配位鍵，結(jié)合緊密， 在高鹽洗脫液下不被洗脫，只有在競爭性洗脫劑或高鹽ETDA存在下才能被洗脫；并且蛋白質(zhì)能與金屬離子鰲合載體結(jié)合的位點少，在結(jié)合過程中不需要 交聯(lián)劑，實現(xiàn)酶的定向固定，有效減少酶活的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種固定化Y-內(nèi)酰胺水解酶拆分(士)Y-內(nèi)酰胺制備(-)Y-內(nèi)酰胺的技術。
本發(fā)明提供一步純化固定化，內(nèi)酰胺酶及拆分(土)Y-內(nèi)酰胺的方法，其特征 在于，包括以下步驟
(1) Y-內(nèi)酰胺水解酶的固定化其特征是將N端與C端均帶組氨酸標記的Y-內(nèi)酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的，內(nèi)酰胺水解 酶的基因工程菌，用上樣緩沖液懸浮，然后采用超聲破碎，破碎上清液流過
Ni-NTA瓊脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的親和柱，將固定上該酶的親和柱用水保 存，待用。
(2) (±)，內(nèi)酰胺的拆分其特征是將固定上該酶的親和柱置于30 100。C的 水浴中，在該酶最適pH值5 10下，將2 20g，L"的底物(士)Y-內(nèi)酰胺連續(xù)流過的 親和柱，連續(xù)轉(zhuǎn)化。
與傳統(tǒng)酶的純化、固定化過程相比，本發(fā)明簡化了純化過程、降低生產(chǎn) 成本及減少了酶量及酶活損失。
具體實施例方式
(l)蛋白酶的表達將實驗室制備質(zhì)粒導入感受態(tài)細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化后細胞接 入3 5mLLB培養(yǎng)基(5g丄—，母粉，10g丄"NaCl， 10g丄"胰蛋白胨，先用去離 子水溶解，再用4.0M'L"NaOH調(diào)節(jié)PH值7.5)，在250^ 1^11-1， 37。C搖床培養(yǎng) 8 10h得到種子液，然后將2.5mL種子液接到250mLLB培養(yǎng)基中，直到250mL 搖瓶中OD6oo達到0.8左右，加入誘導劑IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，誘導后 2 3h，將250mL培養(yǎng)基在5000revmin"離心10min，收集到含重組Y-內(nèi)酰胺水解 酶的濕菌體。
(2)—步純化固定化重組Y-內(nèi)酰胺水解酶到Ni-螯合柱上先用20mL上樣緩 沖液懸浮由步驟(l)得到的濕菌體，然后用400w的功率超聲波破碎細胞，并 12000revmin"離心破碎液，得到含該酶的破碎上清液。先用20mL上樣緩沖液 平衡Ni-NTA瓊脂糖親和柱，再將破碎上清液倒入該親和柱，上清液利用重力 作用流經(jīng)該柱，而帶有組氨酸標記的重組Y-內(nèi)酰胺水解酶會親和結(jié)合至親和柱上，然后用沖洗緩沖液(先用去離子水溶解50mM.L"NaH2PO4， 300mM丄"NaCl， 20mM丄"咪唑，再用4.0M丄"HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0)洗掉吸附的雜蛋白，即得到
固定化酶柱。
(3) 柱上拆分(士)Y-內(nèi)酰胺制備(-)Y-內(nèi)酰胺先將固定化酶柱連上蠕動泵裝 置，柱體置于水浴中，再把用pH值為6.9 9.0的上樣緩沖液配制的10gl"底物 (士)Y-內(nèi)酰胺預熱至50 70。C，然后流經(jīng)柱體，使它與固定化酶進行生物轉(zhuǎn)化作
用，獲得轉(zhuǎn)化液，從而拆分(士)，內(nèi)酰胺制備(-)Y-內(nèi)酰胺。
(4) 手性HPLC分析產(chǎn)品用lmL乙酸乙酯萃取按步驟(3)獲得的轉(zhuǎn)化液 lmL，萃取后的乙酸乙酯相作為樣品，利用手性^1^法測定(+)丫-內(nèi)酰胺和(-:^-內(nèi)酰胺的含量，計算出e.e值及(-)Y-內(nèi)酰胺的產(chǎn)率。
手性HPLC法采用DAICELCfflRALPAKAS-H柱(Daicel， Japan),流動 相乙腈:異丙醇-80:20(v/v)，流速O^mL.min-1,檢測波長230nm，進樣 量為20uL。手性HPLC法測得產(chǎn)品的e.e值最高達到99.9y。， (-)Y-內(nèi)酰胺的產(chǎn)率 最高為46.5%(()-內(nèi)酰胺理論最高產(chǎn)率為50%)。
實例l
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于30。C水浴保溫，2g丄"底物以 0.22mL'min"流速過柱轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到90%， e.e值到達99.02。/(j。 實例2
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，20g丄"底物以 0.22mlvmin"流速過柱轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到88°/。， e.e值達到99.1。/。。 實例3
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，5g丄"底物以 0.5mL'min"流速過柱轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到91%， e.e值達到99。/。。 實例4
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于60。C水浴保溫，10g丄"底物以 0.22mL'min"流速過柱轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到89%， e.e值達到99.48。/。。 實例5
4.332mg酶固定化于親和柱上，柱子于80。C水浴保溫，10g丄"底物以 0.22ml/min流速過柱轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到80%， e.e值達到99.670/。。
權(quán)利要求
1、一步純化固定化γ-內(nèi)酰胺酶及拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)γ-內(nèi)酰胺水解酶的固定化其特征是將N端與C端均帶組氨酸標記的γ-內(nèi)酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的γ-內(nèi)酰胺水解酶的基因工程菌，用上樣緩沖液懸浮，然后采用超聲破碎，破碎上清液流過Ni-NTA瓊脂糖或Ni-NTA葡聚糖填料的親和柱，將固定上該酶的親和柱用水保存，待用；(2)(±)γ-內(nèi)酰胺的拆分其特征是將固定上該酶的親和柱置于30～100℃的水浴中，在該酶最適pH值5～10下，將2～20g·L-1的底物(±)γ-內(nèi)酰胺連續(xù)流過的親和柱，連續(xù)轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶工程領域，具體說一步純化固定化γ-內(nèi)酰胺酶及拆分(±)γ-內(nèi)酰胺的方法。本發(fā)明是將γ-內(nèi)酰胺水解酶固定在Ni-NTA瓊脂糖親和柱上，并在柱上水解(+)γ-內(nèi)酰胺，從而拆分(±)γ-內(nèi)酰胺。將帶有硫磺礦硫化葉菌耐熱γ-內(nèi)酰胺水解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建能表達N端與C端均帶組氨酸標記的γ-內(nèi)酰胺水解酶的基因工程菌或N端與C端僅一端帶組氨酸標記的γ-內(nèi)酰胺水解酶的基因工程菌。然后將帶組氨酸標記的該酶一步純化固定化在Ni-NTA瓊脂糖親和柱上，并使(±)γ-內(nèi)酰胺底物在pH值5～10，溫度30～100℃條件下，在柱上連續(xù)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可保持在80％以上，產(chǎn)物的光學純度＞99％。
文檔編號C12N11/04GK101544972SQ200910084258
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者星 張, 曹燕萍, 林建東, 王建軍, 鄭國鈞 申請人:北京化工大學