專利名稱：：一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法
技術領域：
：本發(fā)明屬微生物工程領域，尤其是一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法。
背景技術：
：果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質的酶的總稱，是含有多種組分的復合酶。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中，但從植物中提取受到資源、技術水平的諸多限制而一直未能真正實現產業(yè)化，因此微生物來源的果膠酶成為研究熱點。國內外對酸性果膠酶的研究已經具有一定基礎，但是對堿性果膠酶尤其是果膠裂解酶(pectatelyase)的研究報道較少。堿性果膠酶是指最適作用pH在堿性范圍內的果膠酶，是果膠酶研究領域中的新興內容，主要應用于紡織工業(yè)中用作對環(huán)境友好的生物催化劑，用柔和的酶生物精練代替?zhèn)鹘y的堿高溫蒸煮技術，實現綠色清潔生產，既可減少堿排放污染，又可降低加熱能耗和漂洗用水量，同時提高紡織物的加工和使用性能。因而隨著生物技術的不斷快速發(fā)展，堿性果膠酶在紡織工業(yè)中的應用潛力也越來越受到大家的關注。從1972年Horikoshi，K.發(fā)表第一篇關于芽孢桿菌生產堿性果膠酶的論文開始，日本等國開始致力于堿性果膠酶的研究。印度MukeshK即oor于2001年報道了Bacillussp.MG-cp-2堿性聚半乳糖醛酸酶的生產、純化和酶學性質，確定該菌株發(fā)酵活力為47u/mL，培養(yǎng)基優(yōu)化后活力提升為98u/mL，室溫時在pH7.012.0范圍內穩(wěn)定，可有效應用于苧麻和菽麻纖維脫膠；德國學者2004年測定了果膠酶菌種BacilluslicheniformisDSM13的基因組序列。美國、荷蘭、英國、西班牙等國的學者也分別對堿性果膠酶的菌種資源、發(fā)酵、純化方法、酶學性質、分泌調控及分子生物學等內容進行了報道，研究對象除了上述芽孢桿菌之外，還包括一些植物病原菌，如菊歐文氏菌、洋蔥伯克霍爾德菌等。為了獲得高產、優(yōu)質的堿性果膠酶產品，自1990年以來，國外學者把研究重點從篩選產堿性果膠酶菌種方面逐步轉向產酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是隨著1999年丹麥NovoNordisk(諾和諾德)堿性果膠酶Biopr印(是一種基因改良的芽孢桿菌經發(fā)酵制成的酶制劑，其最適PH值為7.59.5，適用溫度為55t:左右)和堿性果膠裂解酶ScourzymeL(最佳pH值為7.59.5，對溫度的選用則根據pH值而定，如pH值在88.5時，溫度掌握在55t:6(rC)的產品問世，人們將注意力越來越多地轉向了酶基因及其克隆技術的研究。西班牙、法國、荷蘭、日本學者分別將Bacillussp.(2000年)、Erwiniachrysanthemi3937、Thermotogamaritima(海棲熱袍菌，2003年)、Bacillussubtilis(2002年)四種菌株的堿性果膠酶基因克隆到大腸桿菌中成功進行了表達。國內對果膠酶的研究始于20世紀60年代，1990年初開始對堿性果膠酶進行研究，大量文獻對果膠酶菌種的篩選、傳統誘變育種、生產工藝和酶的工業(yè)應用等方面做了報道，但關于堿性果膠酶的發(fā)酵、酶制劑制備和分子生物學遺傳育種方面的研究內容較少。菌種主要是芽孢桿菌，如吉氏芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌No.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢桿菌WSH03-09、RK9等，此外還有嗜鹽嗜堿菌Alkalibacteriumsp.F26等。2006年我國學者甄東曉等將Clostridiumstercorarium(耐熱梭狀芽孢桿菌)的耐熱果膠裂解酶基因pel9A克隆到表達載體pET28a然后轉化大腸桿菌進行表達；同年，諸葛斌等利用溫控載體構建了堿性果膠酶工程菌。越來越多的研究單位在基因工程菌應用于工業(yè)生產的總體趨勢下進行了堿性果膠酶分子生物學操作的有效嘗試，大多分子生物學操作或以大腸桿菌表達體系為主要內容，或以枯草芽孢桿菌表達體系為研究對象，但大多載體和宿主的選擇在以生產為目的時均顯示了某種不足，例如溫控載體和穿梭質粒的使用會因表達中需要溫度、誘導劑等條件而增加生產成本。我國堿性果膠酶研究總體起步較晚，在國外酶制劑公司80%的工業(yè)用酶都是由基因工程菌發(fā)酵生產獲得，本發(fā)明在成功構建一株堿性果膠酶基因工程菌后，力求尋找到產酶量較高的發(fā)酵培養(yǎng)方法，以拓寬民族工業(yè)酶制劑的競爭和發(fā)展空間。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種收率高、方法簡單、經濟實用的堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，該方法可有效提高堿性果膠酶基因工程菌的產酶能力以及工業(yè)酶的市場競爭力。本發(fā)明采取的技術方案是—種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，步驟如下(1)采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，得到初步優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)通過響應面方法對優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基再進一步優(yōu)化，得到目標菌種優(yōu)化培養(yǎng)基；(3)采用優(yōu)化后培養(yǎng)基，對目標菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到優(yōu)化培養(yǎng)條件。而且，所述單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化的步驟為(1)不同碳源及濃度對產酶的影響，確定最佳碳源以及最佳添加量；(2)不同氮源及濃度對產酶的影響，確定最佳氮源以及最佳添加量；(3)不同金屬離子和無機鹽及其濃度對產酶的影響，確定最佳金屬離子和無機鹽的種類以及最佳添加量。而且，所述響應面方法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的步驟為(1)根據Plackett-Burman法設計實驗步驟及運用minitab軟件進行數據分析；(2)確定因素水平根據Plackett-Burman實驗結果設計的爬坡實驗，篩選出對產酶有重要影響的因素；(3)采用中心組合設計實驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成根據Box-Benhnken的中心組合設計原理和爬坡實驗所得結果設計響應面分析實驗，對重要因素進行優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。而且，所述目標菌種優(yōu)化培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的步驟為在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定最佳目標菌種的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。4而且，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件包括菌種種齡、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度和搖瓶轉速。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是1、本發(fā)明以基因工程菌株為培養(yǎng)對象，以單因素實驗和響應面方法進行培養(yǎng)基發(fā)酵試驗，運用計算機軟件對實驗數據進行分析，對其進行全面優(yōu)化，并在此基礎上進一步對發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，摸索到一套最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，使工程菌發(fā)酵所產生的酶活達到758.7825U/ml，比原始野生型菌株產堿性果膠酶活性提高了50倍，比LB培養(yǎng)基發(fā)酵基因工程菌產堿性果膠酶的活力提高了3倍，對提高工業(yè)酶的市場競爭力有著非常重要的意義。2、本發(fā)明以堿性果膠酶基因工程菌WB600/pWB-pelG2521為例對枯草芽孢桿菌產堿性果膠酶的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，建立了堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵工藝，得到最佳的發(fā)酵條件，該發(fā)酵條件適用于工業(yè)化的生產和應用，具有很大的理論和應用價值。圖1為本發(fā)明基因工程菌WB60圖2和圖3分別為本發(fā)明&=圖4和圖5分別為本發(fā)明X2=圖6和圖7分別為本發(fā)明&=)/pWB-pelG2521的電鏡圖；0時Yl=f(&，X2)的立體分析圖和等高線圖；0時Yl=f(&，X3)的立體分析圖和等高線圖；0時Yl=f(X2，X3)的立體分析圖和等高線圖。具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍?！?、實驗說明1、實驗菌種為基因工程菌株WB600/pWB-pelG2521，該菌株為枯草芽孢桿菌(帶有六個蛋白酶缺陷型)，該菌種及構建方法已經申請專利，專利號申請為200910068617.6，申請日為2009年4月24日。該生產菌株在瓊脂斜面上37t:恒溫培養(yǎng)24h，菌體在斜面上已完全長好，從外觀上看呈乳白色，在電鏡下菌體形狀多為短桿狀，4t:保藏待用。2、實驗菌株WB600/pWB-pelG2521斜面培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%，pH值為6.87.0，瓊脂粉1.5%。3、實驗菌株WB600/pWB-pelG2521種子培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCll%，pH值為6.57.O，滅菌條件為12rC，20min。4、實驗原料的預處理麩皮取508麩皮+約500ml水，攪拌煮沸l(wèi)h，定容至500ml，4000r/min離心5min。取上清得10%的麩皮水提液使用時按100g/L計算。豆餅粉市售豆餅粉經40目篩處理，取50g豆餅粉+約450ml水+0.02g中性蛋白酶，45。C水浴處理45min，定容至500mL，4000r/min離心5min，取上清，得到10%的豆餅粉水提液使用時按100g/L計算。玉米粉市售玉米粉經40目篩處理，取50g玉米粉+約450mL水+38iiLa-中溫淀粉酶，65。C水浴處理lh，定容至500mL，4000r/min離心5min，取上清，得到10%的玉米粉水提液，使用時按100g/L計算。5薯干粉取50g薯干粉+約450mL水+40iiLa-中溫淀粉酶，65。C水浴處理lh，定容至500mL，4000r/min離心5min，取上清，得到10%的薯干粉水提液使用時按100g/L計算。5、堿性果膠酶活力的測定酶活力單位定義lmL酶液在45°C，pH為9.0條件下，每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產生1Pmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。測定方法如下酶液制備果膠酶菌種經發(fā)酵培養(yǎng)結束后，8000轉離心5分鐘，取上清液。用緩沖液稀釋不同倍數，和原液平行測定；酶活測定方法反應體系中包括粗酶稀釋液20iiL，0.2X聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2mol/L)緩沖液(pH9.0，含有0.44mmol/L的CaCl2)2mL，反應條件為45。C溫育15min，用3mL0.03mol/L的磷酸終止反應，在235nm處測定其吸光度值。酶空白將2mL上述緩沖體系配制的底物保溫2min后，依次加入3mL0.03mol/L的磷酸和20L與實驗樣相同稀釋倍數的滅活的酶液，混勻。其他操作與實驗樣相同。OD235xlO、稀釋倍數x反應混合液體積計算酶活力(U/mL)一--1()3xtx4600xbx粗酶液體積式中4600(Lmo"cm—0-不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數t(min)-酶促反應時間(在酶反應的線性范圍內)b(cm)-比色杯厚度經簡化酶活力(U/mL)=3.6232X稀釋倍數X0D235二、一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，方法的步驟如下1、單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌(WB600/pWB-pelG2521)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化。(1)不同碳源及濃度對產酶的影響根據所查閱的大量文獻及實驗室的條件，分別以相同含碳量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、玉米粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、薯干粉、麩皮以及玉米漿為碳源進行發(fā)酵實驗，并與LB培養(yǎng)基進行比較，根據實驗結果和原料成本綜合考慮，以麩皮作為碳源，且添加量為30g/L時酶活最高。(2)不同氮源及濃度對產酶的影響根據所查閱的大量文獻及實驗室的條件，以麩皮(30g/L)為碳源，分別以蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、玉米粉、(NH山S(VK叫、酵母粉、尿素以及棉籽餅粉為氮源進行產酶實驗，根據實驗結果和成本綜合考慮，以豆餅粉作為氮源，且添加量為40g/L時產酶最高。(3)不同金屬離子和無機鹽及濃度對產酶的影響某些金屬離子會對細菌的生長及代謝起到一定的影響作用，因此以麩皮(30g/L)為碳源，豆餅粉(40g/L)為氮源分別對Na+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、K+等進行了考察。通過單因素優(yōu)化，確定了發(fā)酵產酶培養(yǎng)基為麩皮30g/L、豆餅粉40g/L、NaCl5g/L、磷酸鹽0.05mol/L、FeS040.005mol/L。62、響應面方法(RSM)對優(yōu)化培養(yǎng)基(1)Plackett-Burman設計法是部分析因法，試驗選用N=12的設計安排，對麩皮(X》、豆餅粉(X》、磷酸鹽(X4)、NaCl(X5)、FeS04*7H20(X7)五個因素進行考察，每個因素分別取兩個水平，低水平為單因素實驗的結果，高水平取低水平的1.25倍，設計添加兩個空項X3、X6，一個中心點，響應值為酶活(Y)，實驗設計及實驗結果見表l、2。表lPlackett-Burman實驗設計及結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)確定因素水平由Plackett-Burman實驗可知，在堿性果膠酶的發(fā)酵過程中，豆餅粉、磷酸鹽和NaCl這三個因素對產酶有較重要的影響，且均為負效應，應減小，根據Plackett-Burman實驗結果設計的爬坡實驗，結果如表3。表3爬坡實驗設計及結果實驗號豆餅粉磷酸鹽(mmol/dL)NaCl酶活(u/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)采用中心組合設計實驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成根據Box-Benhnken的中心組合設計原理和爬坡實驗所得結果3因素各取3水平，設計了3因素3水平共15個試驗點的響應面分析實驗及結果與分析(如表4、5)。表4中心組合設計因素水平的選取<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>經過回歸和方差等分析結果說明一次項對l有顯著影響，P=0.277說明交叉乘積項影響不顯著。R2=95.56X，表示可信度很高，失擬項的F值也很小，說明該方程對實驗擬和很好，實驗誤差小。由實驗結果得到回歸方程A=-7519.67+153.0928承X一178277.3*X2+705.4752*X3-1.688891氺X^X「114.0125氺X^X2-6.641625氺X^X3-2008160氺X^X2+1992.2*X2*X3-65.306*X3*X3軟件所得出的立體分析圖和等高線圖，很直觀地顯示了豆餅粉、磷酸鹽和NaCl的添加量對產酶的影響，并表現出l有最優(yōu)值，經嶺脊分析，豆餅粉添加35.3345g/L，磷酸鹽添加0.04552mol/L，NaCl添加4.2988g/L時，酶活有最大值，最大值為758.7825U/mL。最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麩皮30g/L、豆餅粉35.3345g/L，磷酸鹽0.04552mol/L，NaCl4.2988g/L，FeS040.005mol/L。3、發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化方法采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌(WB600/pWB-pelG2521)發(fā)酵實驗中的種齡、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度和搖瓶轉速等發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結果表明種齡為12h，初始pH為7.0，接種量為4%，發(fā)酵溫度為37°C，搖瓶轉速為200r/min時，酶活可達780U/mL。10權利要求一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，其特征在于步驟如下(1)采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，得到初步優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)通過響應面方法對優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基再進一步優(yōu)化，得到目標菌種優(yōu)化培養(yǎng)基；(3)采用優(yōu)化后培養(yǎng)基，對目標菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到優(yōu)化培養(yǎng)條件。2.根據權利要求1所述的一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，其特征在于所述單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化的步驟為(1)不同碳源及濃度對產酶的影響，確定最佳碳源以及最佳添加量；(2)不同氮源及濃度對產酶的影響，確定最佳氮源以及最佳添加量；(3)不同金屬離子和無機鹽及其濃度對產酶的影響，確定最佳金屬離子和無機鹽的種類以及最佳添加量。3.根據權利要求1所述的一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，其特征在于所述響應面方法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的步驟為(1)根據Plackett-Burman法設計實驗步驟及運用minitab軟件進行數據分析；(2)確定因素水平根據Plackett-Burman實驗結果設計的爬坡實驗，篩選出對產酶有重要影響的因素；(3)采用中心組合設計實驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成根據Box-Benhnken的中心組合設計原理和爬坡實驗所得結果設計響應面分析實驗，對重要因素進行優(yōu)化，最終確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。4.根據權利要求1所述的一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，其特征在于所述目標菌種優(yōu)化培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的步驟為在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定最佳目標菌種的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。5.根據權利要求1或4所述的一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件包括菌種種齡、初始PH、接種量、發(fā)酵溫度和搖瓶轉速。全文摘要本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶基因工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化方法，步驟如下(1)采用單因素實驗對堿性果膠酶基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，得到初步優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)響應面方法對目標菌種培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到目標菌種培養(yǎng)基；(3)采用后優(yōu)化培養(yǎng)基，對目標菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，得到優(yōu)化培養(yǎng)條件。本發(fā)明摸索到一套最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，使工程菌發(fā)酵所產生的酶活達到758.7825U/ml，比原始野生型菌株產堿性果膠酶活性提高了50倍，比LB培養(yǎng)基發(fā)酵基因工程菌產堿性果膠的酶活力提高了3倍，對提高工業(yè)酶的市場競爭力有著非常重要的意義。文檔編號C12R1/125GK101781641SQ20091007073公開日2010年7月21日申請日期2009年10月9日優(yōu)先權日2009年10月9日發(fā)明者劉逸寒,周浩,王春霞,王珊,肖靜,蔣彥潔,路福平,郝育杰申請人:天津科技大學