專利名稱：甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列。
背景技術(shù)：
高等植物組織中存在著多種轉(zhuǎn)化酶的同工酶形式。根據(jù)最適pH可以分為兩大類酸性轉(zhuǎn)化酶和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶。中性/堿性轉(zhuǎn)化酶(Alkaline/Neutral Invertase)是一種胞質(zhì)酶，最適PH值在7. 0-8. O左右。該酶只以蔗糖為底物，能不可逆的把蔗糖分解為葡萄糖和果糖，用于能量代謝。在酸性轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合酶活性較低的植物組織中，中性/堿性轉(zhuǎn)化酶能分解蔗糖，為三羧酸循環(huán)提供底物，因此它也被視為“維持酶”。目前，已經(jīng)在小麥、玉米、水稻、木薯、小果等植物中克隆得到該類酶的基因。由于其特殊的PH活性條件，酶活性極不穩(wěn)定，在提取過程中容易喪失活力，導(dǎo)致純化該類酶難度很大。己經(jīng)純化出來的中性或堿性轉(zhuǎn)化酶主要以兩種形式存在八聚體和四聚體。中性或堿性轉(zhuǎn)化酶N-端無信號肽、無糖基化，C-端富含半胱氨酸，且與酸性轉(zhuǎn)化酶的同源性很低。研究發(fā)現(xiàn)重金屬離子對中性/堿性轉(zhuǎn)化酶沒有抑制作用，而對酸性轉(zhuǎn)化酶有抑制作用。因此，認(rèn)為中性/堿性轉(zhuǎn)化酶與酸性轉(zhuǎn)化酶之間催化位點有明顯差異。研究發(fā)現(xiàn)，在胡蘿卜不同發(fā)育期的各種組織都能檢測到中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的 表達(dá)，快速生長組織的表達(dá)量最高，表明中性/堿性轉(zhuǎn)化酶可能與植物生長相關(guān)。喬永旭等認(rèn)為甜瓜果實在成熟期之前，果實中轉(zhuǎn)化酶活性逐漸降低。但是，只有當(dāng)中性轉(zhuǎn)化酶活性降低到一定程度之后，蔗糖才開始積累。劉永忠等認(rèn)為檸檬細(xì)胞中的中性轉(zhuǎn)化酶活性，隨著果實成熟而下降，在成熟時保持極低水平，說明在果實成熟前，檸檬細(xì)胞中糖分的利用與中性轉(zhuǎn)化酶活性有極大的關(guān)系。Qiet等(2007)運用圖位克隆法在擬南芥突變體中克隆到I個中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因，其在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著多種作用，參與滲透脅迫誘導(dǎo)的抑制側(cè)根的發(fā)育，抑制作用是通過控制細(xì)胞內(nèi)己糖濃度實現(xiàn)的。Jia等研究發(fā)現(xiàn)，水稻短根突變體Oscyt-invl的蔗糖含量增加時，己糖含量降低；外施葡萄糖能夠恢復(fù)短根突變體Oscyt-invl根的生長,表明OsCyt_invl對水稻根系細(xì)胞發(fā)育和生殖發(fā)育有著重要的作用。目前，對酸性轉(zhuǎn)化酶的研究較多，而中性/堿性轉(zhuǎn)化酶研究較少，僅在少數(shù)幾種植物中克隆到中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因全長序列，但到目前為止，還沒有人在甘蔗上克隆到該基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為研究甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的功能，應(yīng)用甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因進(jìn)行作物遺傳改良，提供一種甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列，是在對所有植物中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因全長序列進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，比對同一家族的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因cDNA序列，并設(shè)計擴(kuò)增中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因核心片段的引物，從甘蔗幼嫩葉片提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用RT-PCR法擴(kuò)增中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因核心片段；在核心片段序列5'端設(shè)計三個特異引物，在核心片段序列3'端設(shè)計兩個特異引物，通過RACE PCR技術(shù)分別擴(kuò)增到中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因核心區(qū)的5'端和3'端序列，三個序列經(jīng)過拼接，獲得甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因全長cDNA序列，總長2289bp，經(jīng)VectorNTI軟件分析，該基因的ORF為1812bp，編碼603個氨基酸，起始密碼子(ATG)位于287bp處，終止密碼子(TAG)在2098bp之后還有一段191bp的帶有真核生物典型的polyA尾巴的非編碼序列。本發(fā)明所獲得的甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因核心區(qū)序列，是用以下核苷酸序列為引物擴(kuò)增獲得
權(quán)利要求
1.甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，其特征在于具有序列表中SEQIDNO. I所示的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第287位核苷酸到2098位核苷酸，編碼603個氨基酸殘基組成的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，其特征在于所述的蛋白具有序列表中SEQID NO. 2所不的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì),或者是將SEQID NO. 2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQID NO. 2所示的氨基酸殘基序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，其特征在于所述的甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的全長cDNA序列，是用以下核苷酸序列為引物擴(kuò)增獲得 a、用于擴(kuò)增甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因核心區(qū)引物對 NIZJF2:(5' -gatcaggtgtttattcgggact-31 ); NIZJR2:(5' -gtcgtagtactccggccatttgtc-3'); b、用于擴(kuò)增甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因3'端的引物對NIXYFl (51 -gcactcttctattcagccctcttg-31 )；NIXYF3 (5' -ccctaaaaacacgccttggtcg-3')； C、擴(kuò)增甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因5'端的引物 NISYFl :(5' -cctcatcaccatcaagcggaat-3')； NISYF2 (5/ -GGCAGTCCATTGTCTTCTCCC-3')；NISYF3 (5' -gaagtcccgaataaacacctgatc-3')。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘蔗中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列，是在對所有植物中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因全長序列進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，以同一家族的中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因序列的保守區(qū)設(shè)計引物，從甘蔗幼嫩葉片提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到中性/堿性轉(zhuǎn)化酶基因的全長cDNA序列，經(jīng)VectorNTI軟件分析，得到序列的ORF為1812bp，編碼603個氨基酸。本發(fā)明不僅為研究中性/堿性轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)機(jī)制，進(jìn)一步探討蔗糖的積累機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究中性/堿性轉(zhuǎn)化酶的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/52GK102888414SQ20121033830
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者王愛勤, 牛俊奇, 何龍飛, 楊麗濤, 李楊瑞 申請人:廣西大學(xué)