專利名稱：：一種制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是提供了一種制備單克隆抗體的交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基及制備方法。
背景技術(shù)：
：單克隆抗體以其高度的特異性和靈敏度，在免疫學檢測、目的蛋白的親和純化和腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前在單克隆抗體制備過程中，對陽性雜交瘤細胞孔應(yīng)用1640完全培養(yǎng)基并采用有限稀釋法進行克隆，此條件下克隆細胞生長緩慢。為促進單個細胞的快速增殖，通常在克隆前首先制備JH常BALB/c的腹腔巨噬細胞懸液，然后以2X10'2Xl()5細胞/孔加到待克隆板中。該過程需要在細胞克隆前制備，不同操作者制備的腹腔巨噬細胞數(shù)量差異較大，并且受動物個體差異影響，不利于克隆過程的標準化，同時還增加了污染的幾率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，克服了常規(guī)雜交瘤細胞克隆過程中制備腹腔巨噬細胞的繁瑣過程。本發(fā)明還提供了一種制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基的制備方法，適用于單克隆抗體的生產(chǎn)。本發(fā)明制備的單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，主要由以下原料按體積份數(shù)比組成1640完全培養(yǎng)基71份，傳代細胞上清1份；所述的傳代細胞上清為細胞對數(shù)生長前期的培養(yǎng)液，通過離心獲得無細胞上清液。傳代細胞選自BHK-21、CRFK、Hela傳代細胞系中的一種。本發(fā)明培養(yǎng)基的制備工藝包括以下步驟1)1640無血清培養(yǎng)基的配制將RPMI1640、H印es、NaHCO:i用去離子水溶解，調(diào)pH值至7.0后定容到1000毫升，0.22um濾膜過濾除菌，無菌分裝；2)雙抗的配制配制含青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位的雙抗溶液；3)1640完全培養(yǎng)基的配制取79毫升步驟1的1640無血清培養(yǎng)基，加入胎牛血清20毫升、雙抗溶液l毫升；4)傳代細胞培養(yǎng)基的配制取89毫升步驟1的1640無血清培養(yǎng)基，加入胎牛血清10毫升、雙抗溶液l毫升；5)傳代細胞的培養(yǎng)及上清的收集傳代細胞上清為細胞對數(shù)生長前期的培養(yǎng)液，通過離心獲得無細胞上清液，傳代細胞選自BHK-21、CRFK、Hela傳代細胞系中的一種；6)制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基將步驟3制備的1640完全培養(yǎng)基與歩驟5的傳代細胞上清按體積比(71):l混合，并將混合培養(yǎng)基的pH值調(diào)到7.2，即獲得本發(fā)明的制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，分別命名為朋K-1640、CRFK-1640、Hela-1640。試驗例應(yīng)用本發(fā)明所制備的培養(yǎng)基分別對SP2/0細胞和抗狂犬病病毒單克隆抗體分泌細胞進行克隆，并與常規(guī)克隆方法進行比較。操作步驟如下1.BALB/c腹腔巨噬細胞懸液的制備摘除健康BALB/c小鼠一側(cè)眼球，待血液將流盡的瀕死期拉頸處死，浸泡于75%的無水乙醇溶液中15min，然后在超凈工作臺中按常規(guī)方法制備用完全1640培養(yǎng)基稀釋的腹腔巨噬細胞懸液，并以2X107ml的密度加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔100u1。2.本發(fā)明的培養(yǎng)基加到細胞培養(yǎng)板將BHK21、CRFK、Hela等細胞的無細胞培養(yǎng)上清與完全1640培養(yǎng)基(按體積比)1:3混合所制備的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，以每孔100u1的量加到96孔培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)基設(shè)32個重復(fù)孔。3.將處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞和抗狂犬病病毒單克隆抗體分泌細胞分別用1640完全培養(yǎng)基和不同的雜交瘤細胞克隆培養(yǎng)物稀釋到10個/ml，然后分別加入到含相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，每孔lOOwl,置37°C5%C02條件下培養(yǎng)。分別于第6天和第9天時每孔更換100ii1相同培養(yǎng)基，到第12天時檢測克隆大小和分泌抗狂犬病病毒單克隆抗體的克隆細胞孔上清的效價。以相同培養(yǎng)條件下有克隆細胞生長孔細胞集落直徑(平均數(shù)士標準差)和抗體效價(0D)作為判斷依據(jù)。表1.本發(fā)明與現(xiàn)有培養(yǎng)基的比較__<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>CRFK-16401483±585.51508±623.21.13±0.16Hela-16401527±513.41462±483.90.98±0.25完全164Q987±330.71028±455.60.86±0.18如表1所見，當克隆細胞生長到第12天時，無論是SP2/0還是分泌單克隆抗體的細胞，用3種不同的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基所形成的細胞集落直徑不僅大于常規(guī)培養(yǎng)基所形成的集落直徑，而且上清中所分泌的抗體效價也高于常規(guī)培養(yǎng)基所分泌的效價。進一歩比較還發(fā)現(xiàn)，3種雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基中以含BHK21-1640培養(yǎng)基在細胞集落直徑和抗體效價方面均優(yōu)于CRFK-1640和Hela-1640培養(yǎng)基。本發(fā)明的積極效果在于提供了一種可簡化雜交瘤細胞克隆過程的培養(yǎng)基及其配置方法，通過SP2/0細胞和分泌抗狂犬病病毒的雜交瘤細胞的克隆試驗表明，本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基可完全代替現(xiàn)有培養(yǎng)基。當用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆，不僅省去了常規(guī)雜交瘤細胞克隆過程中制備腹腔巨噬細胞的繁瑣過程，而且使克隆生長速度及所分泌的抗體效價也得到明顯提高。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于極大地消除了因小鼠個體和人為因素對克隆過程所產(chǎn)生的影響，有利于克隆過程的標準化，而且操作簡便，因此具有潛在的商業(yè)化前景。具體實施例方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例1雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基的制備工藝，包括以下步驟1)1640無血清培養(yǎng)基的配制將RPMI1640(干粉)(GIBC0公司生產(chǎn))IO.4克、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(冊PES，上海生工，分析純)3.574克、NaHC03(北京化工廠，分析純)2克用去離子水900毫升，調(diào)pH值至7.0后定容到1000毫升，0.22um濾膜過濾除菌，無菌分裝待用；2)IOO倍濃縮雙抗的配制將青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位依次溶于100ml去離子水中，用0.22um濾膜過濾除菌，制成雙抗溶液，分裝小瓶后置-2(TC保存待用；3)1640完全培養(yǎng)基的配制取79毫升歩驟1制備的1640無血清培養(yǎng)基，加入胎牛血清(GIBCO公司生產(chǎn))20毫升、雙抗l毫升待用；4)傳代細胞培養(yǎng)基的配制取89毫升歩驟1制備的1640無血清培養(yǎng)基，依次加入胎牛血清10毫升、雙抗l毫升待用；5)單層細胞消化液(IOX貯存液)配置取牛胰蛋白酶2.5克、氯化鈉40克、氯化鉀2.0克、葡萄糖5.0克、NaHCO:,2.9克、EDTA1.0克，依次溶于450毫升三餾水中，待胰酶完全溶解后，加入1%酚紅，并加三餾水至500毫升，0.22Wn濾膜過濾后除菌，-20"保存待用；6)傳代細胞的培養(yǎng)及上清的收集(1)朋K-21細胞的培養(yǎng)和上清的收集從液氮罐中取出BHK-21細胞冷凍管，立即投入37°C水浴中快速解凍，輕搖冷存管使其在l分鐘內(nèi)全部融化。200g/min離心5分鐘，在超凈工作臺內(nèi)無菌吸棄上清，用適量傳代細胞培養(yǎng)液懸浮后，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置37。C恒^i肯，才i^中i肯^。約48hr后，當細胞分裂增殖己布滿培養(yǎng)瓶底部時，倒出培養(yǎng)瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)液，每次用1倍的單層細胞消化液2ml浸洗細胞2次，最后加入0.5ml單層細胞消化液平鋪培養(yǎng)瓶底部，靜置2-5分鐘后觀察。當細胞間隙變大，此時輕輕拍動瓶身使細胞脫落，然后加入傳代細胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細胞密度到5X10Vml，分瓶培養(yǎng)。24h后無菌收集細胞上清，800g離心10min，同時在原培養(yǎng)瓶中加入相同體積的新鮮傳代細胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)12h的上清，同上離心后，將二次收集的上清合并，將胎牛血清濃度調(diào)整為20%，-20匸凍存?zhèn)溆谩?2)CRFK細胞的培養(yǎng)及上清的收集從液氮中取出CRFK細胞冷凍管，立即放入37°C水浴中快速解凍，然后200g/min離心5分鐘，無菌吸棄上清，用傳代細胞培養(yǎng)基稀釋后接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在37。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞分裂增殖已布滿培養(yǎng)瓶底部時，倒出培養(yǎng)瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)液，用單層細胞消化液分散，然后用新鮮傳代細胞培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5X107ral后分瓶培養(yǎng)。24h后無菌收集細胞上清，800g離心l(kin,同時在原培養(yǎng)瓶中加入相同體積的新鮮傳代細胞培養(yǎng)基，再次收集培養(yǎng)12h的上清，同上離心后，將二次收集的上清合并，將血清濃度調(diào)整為20%，-20'(3凍存?zhèn)溆谩?3)Hela的培養(yǎng)及上清的收集從液氮罐中取出Hela細胞冷凍管，立即放入37"C水浴中快速解凍，輕搖冷凍管使其在l分鐘內(nèi)全部融化。200g/min離心5分鐘，在超凈工作臺內(nèi)無菌吸棄上清，用適量傳代細胞培養(yǎng)液懸浮后，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置37t:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約48hr后，當細胞分裂增殖已布滿培養(yǎng)瓶底部時，倒出培養(yǎng)瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)液，每次用3mll倍的單層細胞消化液浸洗細胞3次，最后加入O.5ml單層細胞消化液平鋪培養(yǎng)瓶底部，靜置2-5分鐘后觀察。當細胞間隙變大，此時輕輕拍動瓶身使細胞脫落后，用傳代細胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度至5X107ml后分瓶培養(yǎng)。24h后無菌收集細胞上清，800g離心lOmin,同時在原培養(yǎng)瓶中加入相同體積的新鮮傳代細胞培養(yǎng)基，再次收集培養(yǎng)12h的上清，同上離心后，將二次收集的上清合并，將血清濃度調(diào)整為20%，-201:凍存?zhèn)溆谩?)制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基將1640完全培養(yǎng)基與歩驟6制備的傳代細胞上清按體積比(71):l的比例混合，并將混合培養(yǎng)基的pH值調(diào)到7.2，即獲得本發(fā)明的制備單克隆抗體的不同雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基。分別根據(jù)所加入上清的來源命名為BHK-1640、CRFK-1640、Hela-1640。實施例2含不同比例傳代細胞上清的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基的比較1.同試驗例步驟1制備BALB/c腹腔巨噬細胞懸液并加到96孔板中。2.不同比例的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基的配置并加到96孔板中將按實施例步驟7所配置的培養(yǎng)基，以每孔100u1的量加到96孔培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)基設(shè)32個重復(fù)孔。3.應(yīng)用實施例歩驟7所配置的培養(yǎng)基，將處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞稀釋到10個/ml，然后分別加入到含相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，每孔100ul，置37'C5呢C02條件下培養(yǎng)。分別于第6天和第9天時每孔更換100yl相同培養(yǎng)基，到第12天時比較不同培養(yǎng)基條件下所形成的細胞集落直徑。如表2所見，不同培養(yǎng)基克隆的SP2/0細胞，生長到第12天時，傳代細胞上清和1640完全培養(yǎng)基的混合比例為1:(17)時，所形成的細胞集落直徑均明顯大于常規(guī)培養(yǎng)基所形成的集落直徑。進一步比較還發(fā)現(xiàn)，當傳代細胞上清和1640完全培養(yǎng)基按1:(35)混合時，細胞所形成的集落直徑大于其他比例時的集落直徑。當混合比例相同時，含朋K21細胞上清的雜交瘤細胞克隆培養(yǎng)基所形成的集落直徑最大。_表2.不同培養(yǎng)基條件下SP2/0細胞所形成的集落直徑_爐表某_細胞上淸':;；1640完全培養(yǎng)基的混合比例及細胞集落直徑(,±SD,n=16)___1:11:21:31:41:51:61:7BHK-16401124±381.21132±447.81742±499.81539±424.41334±419.61257±509.11127±379.2CRFK-1640,,1105±412.31243±453.21483±585.51324±468.21221±515.81146±367.71022±413.5He1a16401096±385.3U53±453.11527±513.41307±435.91277±466.21162±421.11034±377.6常鵬養(yǎng)987機權(quán)利要求1、一種制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，主要由以下原料按體積份數(shù)比組成的1640完全培養(yǎng)基7～1份，傳代細胞上清1份；所述的傳代細胞上清為細胞對數(shù)生長前期的無細胞上清液，傳代細胞選自BHK-21、CRFK、Hela傳代細胞系中的一種。2、權(quán)利要求l所述培養(yǎng)基的制備工藝，包括以下歩驟1)1640無血清培養(yǎng)基的配制將RPMI1640、H印es、NaHCO.,用去離子水溶解，調(diào)pH值至7.0，除菌后分裝；2)雙抗的配制制成含青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位的雙抗溶液；3)1640完全培養(yǎng)基的配制取79毫升步驟1的1640無血清培養(yǎng)基，加入胎牛血清20毫升、雙抗溶液l毫升；4)傳代細胞培養(yǎng)基的配制取89毫升步驟1的1640無血清培養(yǎng)基，加入胎牛血清10毫升、雙抗溶液l毫升；5)傳代細胞上清的收集傳代細胞上清為細胞對數(shù)生長前期的培養(yǎng)液，通過離心獲得無細胞上清液，傳代細胞選自BHK-21、CRFK、Hela傳代細胞系中的一種；6)制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基將步驟3制備1640完全培養(yǎng)基與步驟5的傳代細胞上清按體積比(71):l的比例混合，并將混合培養(yǎng)液的pH值調(diào)到7.2，即獲得培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明提供了一種制備單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基及其制備方法，按常規(guī)方法配制RPMI1640完全培養(yǎng)基，然后分別與一定比例的BHK-21、CRFK、Hela等細胞的無細胞培養(yǎng)上清混合，完全培養(yǎng)基與每種細胞上清的體積比為(7～1)∶1。本發(fā)明的優(yōu)點在于使用本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞克隆用培養(yǎng)基，可完全省略在常規(guī)雜交瘤細胞克隆過程中以BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞的環(huán)節(jié)，大大簡化了克隆操作，并使被克隆細胞的生長速度明顯提高。文檔編號C12N5/12GK101508976SQ200910066478公開日2009年8月19日申請日期2009年1月16日優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日發(fā)明者關(guān)振宏,張茂林,柳增善,銘段,王心蕊,陳啟軍申請人:吉林大學