專利名稱：利用血液中的物理變化和化學(xué)變化檢測(cè)血液中的微生物的制作方法
利用血液中的物理變化和化學(xué)變化檢測(cè)血液中的微生物
背景技術(shù)：
這部分旨在提供權(quán)利要求所述發(fā)明的背景或來(lái)龍去脈。此處的描述可包括能實(shí)行 的概念，但并不必然是以前已經(jīng)表達(dá)過(guò)或?qū)嵭羞^(guò)的概念。因此，除非在本文中另做說(shuō)明，則 這部分所描述的內(nèi)容不是本申請(qǐng)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的現(xiàn)有技術(shù)，并且不能因?yàn)樗麄儼?含在這部分中就認(rèn)為他們是現(xiàn)有技術(shù)。美國(guó)專利No. 5422720和No. 5770394說(shuō)明了用于檢測(cè)代謝產(chǎn)物(尤其是CO2) 的現(xiàn)有技術(shù)，所述代謝產(chǎn)物由血培養(yǎng)瓶中存在的微生物的生長(zhǎng)而產(chǎn)生。另外參見(jiàn)美國(guó) 專利No. 6379920(直接比較在標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中和血培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的生物體的光譜特征)和 No. 5427920 (通過(guò)測(cè)量反向散射光的強(qiáng)度檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的存在)。因此，這些文獻(xiàn)描述了用于確定血液中微生物存在的各種方法。微生物的存在通 常是通過(guò)針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物(例如，CO2)產(chǎn)生的內(nèi)部指示劑來(lái)檢測(cè)。在這方面的例證有 光學(xué)監(jiān)測(cè)血培養(yǎng)瓶底部對(duì)CO2敏感的圓盤中的變化(美國(guó)專利No. 5770394)，和測(cè)量培養(yǎng)瓶 頂部空間中CO2增加的產(chǎn)量的壓敏技術(shù)。其他的方法具有幾個(gè)波長(zhǎng)的反向散射光峰值強(qiáng)度 對(duì)于微生物存在的關(guān)聯(lián)變化。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5427920。然而，由于血液成分的可變性和給定實(shí)驗(yàn)的初始條件的變化這兩方面的難度，這 些方法還沒(méi)有被商業(yè)化地采用。更具體而言，所有現(xiàn)有的微生物檢測(cè)方法的靈敏度取決于 所采用的特定測(cè)量技術(shù)和如下因素1.代謝產(chǎn)物CO2或其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速率；2.代謝產(chǎn)物向指示劑染料的輸送(通常，為便于檢測(cè)，染料固定在與培養(yǎng)瓶相結(jié) 合的固體基質(zhì)中)；3.代謝氣體從液體培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶頂部空間的輸送；4.與代謝產(chǎn)物和指示劑染料反應(yīng)有關(guān)的時(shí)間常數(shù)。給定的分光光度-指示劑染料系統(tǒng)的構(gòu)成(constituency)確定了該系統(tǒng)對(duì)于代 謝產(chǎn)物存在的靈敏度，尤其是在最小可檢測(cè)CO2濃度方面的靈敏度。檢測(cè)時(shí)間(TTD)取決 于測(cè)量技術(shù)的靈敏度、達(dá)到最小可檢測(cè)CO2濃度所需的時(shí)間以及輸送時(shí)間常數(shù)和反應(yīng)時(shí)間 常數(shù)。代謝產(chǎn)物CO2的生長(zhǎng)速率取決于生物體的初始濃度(血液中的CFU/mL)和培養(yǎng)條件 (生長(zhǎng)介質(zhì)、溫度等)，除此之外還取決于生物體自身的品系，因此代謝產(chǎn)物CO2的產(chǎn)生速率 取決于生物體的初始濃度(血液中的CFU/mL)和培養(yǎng)條件(生長(zhǎng)介質(zhì)、溫度等)，除此之外 還取決于生物體自身的品系。為了在與每種生物體的特定生長(zhǎng)速率相應(yīng)的培養(yǎng)期或擴(kuò)增期 進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，現(xiàn)有的檢測(cè)系統(tǒng)需要微生物為每毫升IO8個(gè)到每毫升IO9個(gè)之間。普通的分光光度-指示劑染料系統(tǒng)需要向其中添加指示劑染料或其他指示劑，并 且不能產(chǎn)生除了存在或不存在微生物之外的任何臨床信息。因此需要一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)在 不需要附加材料和步驟的情況下提供靈敏又高效的微生物測(cè)量，并且提供與存在的微生物 的特性有關(guān)的更多有意義的信息。
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本發(fā)明提供克服了用于檢測(cè)在體外微生物污染的傳統(tǒng)測(cè)量技術(shù)的缺陷的方法和 裝置。具體而言，本發(fā)明涉及對(duì)于(B)樣本中污染生物體的存在和特性，(A)所述樣本的物 理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化、存在的細(xì)胞和其他微粒的數(shù)量和尺寸的變化以及溶血的紅細(xì)胞 在所述樣本中所占分?jǐn)?shù)的變化。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，通過(guò)涵蓋電磁光譜的紫外線區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)和/或近 紅外區(qū)(UV-Vis-NIR)的分光光度程序來(lái)測(cè)量這些變化。通過(guò)相關(guān)技術(shù)和/或光譜反卷積 技術(shù)，光譜特征與血液的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)。相關(guān)法使測(cè)量到的光譜的一些部分的 特征與血液性質(zhì)的特定變化聯(lián)系起來(lái)?？梢酝ㄟ^(guò)光譜反卷積技術(shù)解釋完整的光譜或者光譜 的一些部分，該光譜反卷積技術(shù)需要對(duì)數(shù)據(jù)的適當(dāng)數(shù)學(xué)描述。所述對(duì)數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)描述可以 是但不必限于理論上的、經(jīng)驗(yàn)上的和統(tǒng)計(jì)學(xué)的描述。通過(guò)在沒(méi)有附加指示劑或染料的情況下讓檢測(cè)實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明克服了現(xiàn)有測(cè)量技術(shù) 的缺點(diǎn)。可以利用血液的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化通過(guò)監(jiān)測(cè)血液的化學(xué)成分(例如，血 紅蛋白的成分)的變化來(lái)直接地(例如，通過(guò)微粒數(shù))或間接地檢測(cè)微生物活動(dòng)的存在。本 發(fā)明的各種實(shí)施方式利用如下事實(shí)血紅蛋白以高濃度存在，血紅蛋白以游離形態(tài)或者以 紅細(xì)胞形態(tài)良好地分布于培養(yǎng)基之中，以及血紅蛋白的光譜隨周圍環(huán)境變化。通過(guò)使血紅 蛋白化學(xué)成分中的微小變化能夠被定量，不同形態(tài)的血紅蛋白之間的明顯的光譜差異提供 較大的檢測(cè)靈敏度。此外，遍及多個(gè)波長(zhǎng)的光譜特征的同步測(cè)量帶來(lái)改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為了實(shí)施本發(fā)明的方法，一種裝置配置優(yōu)選地包括(i)能發(fā)出光譜的 UV-Vis-NIR區(qū)內(nèi)的光照的至少一個(gè)光源，(ii)用于從樣本傳導(dǎo)并收集適當(dāng)數(shù)量波長(zhǎng)的光 的裝置，該裝置例如光纖。適合于這個(gè)目的的兩個(gè)示例性光譜配置為漫反射和漫透射。這 些配置利用血液的吸收性質(zhì)和多重散射性質(zhì)，并且與現(xiàn)有的方法相比，這些配置不需要直 接倚靠血培養(yǎng)容器壁放置光纖探頭。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于評(píng)定血液中微生物存在的方法， 該方法包括(a)向至少一種血樣發(fā)射電磁輻射，(b)測(cè)量從所述血樣再射出的電磁輻射的 基于波長(zhǎng)的光譜，其中所述測(cè)量為對(duì)透射信號(hào)和反射信號(hào)之一或全部進(jìn)行測(cè)量，然后(C) 對(duì)所述光譜反卷積以評(píng)定所述血樣中微生物存在或不存在。在一種實(shí)施方式中，根據(jù)血液 的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)定量解讀所述光譜。在另一種不同的實(shí)施方式中，所述反卷積確定 血液中多種類型的微生物存在或不存在。此外，所述方法可包括通過(guò)所述光譜獲取所述微 生物的識(shí)別特性的步驟。根據(jù)示例性的實(shí)施方式，上述光譜可隨時(shí)間測(cè)量，或者在任意離散時(shí)間點(diǎn)測(cè)量上 述光譜。測(cè)量步驟(b)優(yōu)選地是對(duì)漫透射信號(hào)或漫反射信號(hào)的測(cè)量，但也可是對(duì)角透射信 號(hào)或角反射信號(hào)的測(cè)量。在一種示例性的實(shí)施方式中，所述再射出的電磁輻射包括波長(zhǎng)在 紫外線區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)和/或近紅外線區(qū)內(nèi)的電磁輻射。在又一種示例性的實(shí)施方式中，所述 反卷積步驟定量血液成分的物理性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)另一種示例性的實(shí)施方式，所 述反卷積步驟包括線性模型或非線性模型中的至少一種，并且將所述光譜解析為與微粒相 關(guān)的物理特性。在另一種示例性的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法定量至少一種形態(tài)的血紅蛋 白。在這點(diǎn)上，所述反卷積步驟(i)可包括線性模型和非線性模型中的至少一種，以及(ii) 可將所述光譜解析為所述形態(tài)的血紅蛋白。
根據(jù)另一種示例性的實(shí)施方式，所述評(píng)定的方法包括檢測(cè)微生物存在或不存在。 在一種不同的示例性實(shí)施方式中，所述方法還包括通過(guò)所述光譜獲取微生物的識(shí)別特性。 在這點(diǎn)上，所述識(shí)別特性選自動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)參數(shù)和物理特性?？蛇x地，或者附加地，所述生長(zhǎng) 參數(shù)可包括倍增時(shí)間和呼吸速率，和/或所述物理特性可包括尺寸和形狀。在又一種不同 的示例性實(shí)施方式中，根據(jù)由一種或一種以上微生物代謝產(chǎn)物引起的血液性質(zhì)的變化來(lái)評(píng) 定微生物存在或不存在。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供了配置成評(píng)定微生物存在的裝置，該裝置包括(a)配 置成測(cè)量從血液的樣本射出的多個(gè)波長(zhǎng)的光譜的分光計(jì)，(b)可操作地連接至所述分光計(jì)的 透射元件和/或反射探頭，以及(c)如下計(jì)算機(jī)(i)該計(jì)算機(jī)可操作地連接至所述分光計(jì)， 和(ii)該計(jì)算機(jī)配置成向所述光譜執(zhí)行反卷積，從而評(píng)定所述樣本中微生物存在或不存在。 在一種實(shí)施方式中，所述分光計(jì)包括二極管陣列。在另一種實(shí)施方式中，反射探頭可操作地連 接至所述分光計(jì)，并且如此配置，這樣所述反射探頭不接觸放置所述樣本的容器。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種評(píng)定血液中的至少一種微生物存在的 方法，其包括(a)向封閉容器內(nèi)的至少一種血樣發(fā)射電磁輻射，(b)測(cè)量從所述血樣再射出 的電磁輻射的基于波長(zhǎng)的光譜，其中所述測(cè)量是對(duì)透射信號(hào)和反射信號(hào)之一或者全部進(jìn)行 測(cè)量，(c)對(duì)所述光譜反卷積，(d)確定與所述血樣上方頂部空間中的氧氣和二氧化碳中的 至少之一有關(guān)的分壓值，以及(e)根據(jù)所述分壓值評(píng)定微生物存在或不存在。本發(fā)明的另一方面涉及一種評(píng)定血液中至少一種微生物存在的方法，其包括(a) 向封閉容器內(nèi)的至少一種血樣發(fā)射電磁輻射，(b)測(cè)量從所述血樣再射出的電磁輻射的基 于波長(zhǎng)的光譜以獲得測(cè)量到的光譜值，其中所述測(cè)量是對(duì)透射信號(hào)和反射信號(hào)之一或者全 部進(jìn)行測(cè)量，(c)確定與所述血樣上方頂部空間中的氧氣和二氧化碳中的至少之一有關(guān)的 分壓值以獲得測(cè)量到的分壓值，(d)根據(jù)所述測(cè)量到的光譜值和測(cè)量到的分壓值對(duì)所述光 譜反卷積，以及(e)根據(jù)所述反卷積評(píng)定微生物存在或不存在。下面結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明各種實(shí)施方式的上述的和其他的優(yōu)點(diǎn)和特征，以 及本發(fā)明各種實(shí)施方式的構(gòu)造和操作方法。


參考附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方式，其中圖1示出氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、碳氧血紅蛋白和正鐵血紅蛋白這四種普 通形態(tài)的血紅蛋白的示例性的吸收系數(shù)。圖2根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式描繪了可用于實(shí)施光譜測(cè)量的反射測(cè)量裝置。圖3示出涉及不同形態(tài)的血紅蛋白的透射光譜。圖4提供了圖3所示的透射光譜的對(duì)數(shù)表示。圖5示出涉及不同形態(tài)的血紅蛋白的反射光譜。圖6示出20分鐘倍增時(shí)間內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。圖7示出由于細(xì)菌產(chǎn)生的CO2,氧合血紅蛋白隨已用時(shí)間的轉(zhuǎn)化。圖8示出在圖6和圖7所示的微生物生長(zhǎng)條件下血樣的預(yù)測(cè)的反射光譜。圖9示出在圖6和圖7所示的微生物生長(zhǎng)條件下血樣的完整時(shí)間過(guò)程的模擬反射 光譜。
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圖10是闡明與檢測(cè)微生物有關(guān)的各種示例性步驟的流程圖。圖11示出在第一時(shí)間點(diǎn)血培養(yǎng)瓶中血樣的測(cè)量到的反射光譜和估算的反射光譜 之間的對(duì)比。圖12描繪了在第二時(shí)間點(diǎn)血培養(yǎng)瓶中血樣的測(cè)量到的反射光譜和估算的反射光 譜之間的對(duì)比。圖13示出對(duì)于三種不同血樣的測(cè)量到的反射光譜和預(yù)測(cè)的反射光譜之間的對(duì) 比。圖14示出由于散射元的平均細(xì)胞體積，與兩種不同血樣有關(guān)的反射光譜之間的差異。圖15示出與具有不同的微粒數(shù)密度的兩種不同血樣有關(guān)的反射光譜之間的差異。圖16示出被酵母白色念珠菌(C. albicans)污染的血樣的測(cè)量到的反射光譜和估 算的反射光譜。圖17示出與被白色念珠菌污染的血樣有關(guān)的不同形態(tài)的血紅蛋白的轉(zhuǎn)化。圖18描繪了對(duì)于被白色念珠菌污染的血樣，氧合血紅蛋白相對(duì)脫氧血紅蛋白的 比例隨時(shí)間的轉(zhuǎn)化。圖19示出對(duì)于被細(xì)菌大腸桿菌(E.Coli)污染的血樣，血紅蛋白成分隨時(shí)間的變 化。圖20示出與被細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. perfringens)污染的血樣有關(guān)的反射光譜 隨時(shí)間的演變。圖21示出與被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的血樣有關(guān)的細(xì)胞密度隨時(shí)間的變化。圖22(A)示出與被兩種微生物污染的血樣有關(guān)的單個(gè)波長(zhǎng)反射光譜隨時(shí)間的演變。圖22(B)示出與被兩種微生物污染的血樣有關(guān)的反射光譜隨時(shí)間的演變。圖23示出與被多種微生物污染的血樣有關(guān)的測(cè)量到的反射光譜和估算的反射光 譜之間的差異。圖24是與根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方式實(shí)施的各種實(shí)驗(yàn)有關(guān)的示例性參數(shù)的表格。圖25描繪了與血樣有關(guān)的總細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的演變。圖26示出與血樣有關(guān)的氧消耗隨時(shí)間的演變。圖27示出與血樣有關(guān)的氣體壓力分布圖隨時(shí)間的演變。圖28示出與血樣有關(guān)的血紅蛋白成分分布圖隨時(shí)間的模擬演變。圖29示出與兩種不同血樣有關(guān)的模擬血紅蛋白比例隨時(shí)間的演變。圖30示出與血樣有關(guān)的血量對(duì)氣體分壓的影響。圖31示出與血樣有關(guān)的血量對(duì)血紅蛋白形態(tài)的比例的影響。圖32示出與血樣有關(guān)的白細(xì)胞濃度對(duì)耗氧量的預(yù)測(cè)的影響。圖33示出與血樣有關(guān)的白細(xì)胞濃度對(duì)氣體分壓的預(yù)測(cè)的影響。圖34示出與血樣有關(guān)的白細(xì)胞濃度對(duì)血紅蛋白形態(tài)比例的預(yù)測(cè)的影響。圖35示出與血培養(yǎng)瓶中的血樣有關(guān)的反射光譜隨時(shí)間的演變。圖36示出與血培養(yǎng)瓶中的血樣有關(guān)的血紅蛋白形態(tài)的比例隨時(shí)間的演變。
圖37示出與血培養(yǎng)瓶中的血樣有關(guān)的氣體分壓的比例隨時(shí)間的演變。圖38是在溶血之前與溶血之后血樣的測(cè)量到的反射光譜和估算的反射光譜之間 的對(duì)比。圖39是表示與利用氣體分壓來(lái)檢測(cè)微生物有關(guān)的各種示例性步驟的流程圖。圖40示出與血培養(yǎng)瓶中的血樣有關(guān)的反射光譜隨時(shí)間的演變，其中所述血樣被 細(xì)菌尿腸球菌(E. faecium)污染。圖41示出與被細(xì)菌尿腸球菌污染的血樣有關(guān)的血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)和紅細(xì)胞體積 分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的演變。
具體實(shí)施例方式在下面用于解釋而非限制性的描述中，闡述了細(xì)節(jié)和描述以提供對(duì)本發(fā)明的全面 理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明能以不同于上述細(xì)節(jié)和描述的其他實(shí)施方 式實(shí)施是顯而易見(jiàn)的。根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)涵蓋光譜的一個(gè)區(qū)域?qū)嵤┩干錅y(cè)量和反射測(cè)量來(lái)檢測(cè)血樣中 的微生物污染。所述透射或反射是在向容器中的血樣發(fā)射光之后獲得。在通過(guò)再射出的輻 射收集光譜之后，接著使用數(shù)學(xué)描述(例如，理論模型)將數(shù)據(jù)反卷積成其分量部分。參 JALJansson,P. A. ,Deconvolution :WithApplications in Spectroscopy(Academic Press， 1984)。這種處理的目的是要確定涉及血液物理性質(zhì)的狀態(tài)和化學(xué)成分的模型參數(shù)。這些 參數(shù)的解釋繼而涉及如下特性，例如倍增時(shí)間、呼吸幅度(respiration range)、尺寸、形 狀以及氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的分壓，從而表示血樣中存在的微生物。與這種方法相一致，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)血液中(例如，在血培養(yǎng)瓶中)微生物 的方法和裝置。更具體而言，本發(fā)明利用血液中物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化(例如，血紅蛋 白成分)，還利用血培養(yǎng)瓶的頂部空間中氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的分壓，來(lái)檢測(cè)生物 體的存在并識(shí)別生物體的特性。通過(guò)適應(yīng)于或適合于電磁光譜的UV-Vis-NIR區(qū)的分光光 度程序來(lái)檢測(cè)這些變化。根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式，由此獲得的光譜測(cè)量結(jié)果憑借光譜 反卷積技術(shù)被定量解讀。這種方法包括對(duì)血液中的物理變化和化學(xué)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。A.受微生物影響的血液成分的變化已充分確定的是，血液中生物體的存在導(dǎo)致血液光學(xué)性質(zhì)的變化，例如，通過(guò)引起 血紅蛋白成分的變化以及通過(guò)使紅細(xì)胞溶血。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5427920,No. 5770394 和No. 6379920。這些變化是由微生物生長(zhǎng)的代謝作用和代謝副產(chǎn)物引起。早在19世紀(jì) 20年代就已確定，好氧生物體和厭氧生物體通過(guò)他們的氧化還原系統(tǒng)或者通過(guò)他們的代謝 副產(chǎn)物(特別是CO2)作用于氧合血紅蛋白以使其轉(zhuǎn)化成為脫氧血紅蛋白，并且在適當(dāng)條件 下，轉(zhuǎn)化成為正鐵血紅蛋白或者其他形態(tài)的血紅蛋白，例如氨基甲酰血紅蛋白、碳氧血紅蛋 白或其他血紅蛋白副產(chǎn)物。參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5427920。因?yàn)檠t蛋白以游離形態(tài)或紅細(xì)胞 形態(tài)存在于相對(duì)高濃度的血培養(yǎng)物中，所以血紅蛋白可用于檢測(cè)生物活性，從而檢測(cè)微生 物的存在。B.測(cè)量血液成分的變化血紅蛋白的光學(xué)性質(zhì)在文獻(xiàn)中有廣泛詳述。例如，參見(jiàn)Neill，J. Exp. Med. 41 535-49(1925) ；Anderson et al.，Phys. Med. Biol. 12 173-84(1967) ；Perkampus, UV-VISAtlas of Organic Compounds, 2nd ed. , part 2(1992)。圖 1 分別示出氧合血紅蛋白、脫 氧血紅蛋白、碳氧血紅蛋白和正鐵血紅蛋白的吸收系數(shù)隨波長(zhǎng)的典型變化。他們的光譜特 征的顯著差異是顯而易見(jiàn)的，并且這些差異使得血紅蛋白成分中的微小變化能夠被定量。 參見(jiàn) Dubova et al. , Zh. Prikl. Spektrosk. 36 76-82 (1980) ；Zijlstra et al.，Clin. Chem. 37:1633-38 (1991) 0研究人員利用這些微小的光譜差異設(shè)計(jì)用于血氧測(cè)定(尤其 是脈沖血氧測(cè)定)的非侵入的、基于反射的裝置。例如，參見(jiàn)Naqvi et al. , Photochem. Photobiol. Sci.，132—37 (2004) ； Rodri go, Am. Heart J. 45 809 (1953) ；Zijlstra, W. G.， A Manual ofReflection Oximetry (1958) ；van Assendelft, 0. W. , Spectrometry of HaemoglobinDerivatives (1970)；美國(guó)專利 No. 5983122。相應(yīng)地，有充分的證據(jù)表明不同形態(tài)的血紅蛋白可以通過(guò)血樣的光譜定量確定。 參見(jiàn) Friebel et al. , J. Biomed. Optics 10:064019—1 to 064019—5 (2005)，Dubova et al. and Zijlstra et al. (1991)，supra。檢測(cè)血紅蛋白成分中相對(duì)微小的變化還可以顯著 縮短用于確定樣本中生物體存在所需的時(shí)間。漫透射和漫反射是兩種可以用于實(shí)現(xiàn)這種測(cè)量的技術(shù)。例如，參見(jiàn)=Mignani et al. “In Vivo Medical Sensors,"in Optical Fiber Sensors,Dakin et al.,eds. (1997)； Kortum G. Reflectance Spectroscopy (1969)。這些技術(shù)利用通常用于體外培養(yǎng)所觀察到 的血液和血液懸浮溶液的根據(jù)濃度的漫散射光。參見(jiàn)Hapke，B. Theory of Reflectance and Emittance(1993) ；Schmitt et al. , Ann. ofBiomed. Eng. 14 35-52(1986) ；Reynolds et al, Appl. Optics 15:2059-67(1976) ；McRae et al. , J. Opt. Soc. of America 51: 1366-72(1961)。在反射測(cè)量的情形中，這樣的觀察尤其重要。漫反射測(cè)量不需要光源(即照明光纖)或檢測(cè)器(即接收光纖)準(zhǔn)直。參見(jiàn) Mignani et al. , Kortum et al. , and Hapkie et al. ,supra。此夕卜，這些測(cè)量不需要 探 頭直接放置于樣本容器表面。參見(jiàn)上述的Kortum G. ReflectanceSpectroscopy(1969)并 比較上述美國(guó)專利No. 5427920。圖2描繪了適合于漫反射測(cè)量的市售光纖結(jié)構(gòu)的例子。190nm到IlOOnm之間的光譜區(qū)尤其適合于準(zhǔn)直透射測(cè)量和漫透射測(cè)量，其中 400nm到IlOOnm之間的光譜區(qū)對(duì)于角反射和漫反射來(lái)說(shuō)是理想的。應(yīng)當(dāng)注意，在本文中，術(shù) 語(yǔ)“準(zhǔn)直”是指使用平行的光子光束照射到樣本上。該光子光束可以穿過(guò)樣本(透射)或通 過(guò)反射的輻射觀察到。如果光源“漫射”，那么光會(huì)從多個(gè)方向照射到樣本上。因此，不能確 定與入射光相應(yīng)的透射光和散射光的方向?！奥狈瓷溥m合當(dāng)光均勻地以所有方向反射時(shí)， 因此，從任意方向觀察都是相同的。相對(duì)而言，“角”測(cè)量是角度的函數(shù)，并且通常與準(zhǔn)直光 源一起使用。C.模型實(shí)現(xiàn)為了利用血液的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)作為微生物存在的指示，有必要將觀察到的 這些性質(zhì)的變化與相應(yīng)的測(cè)量到的光譜聯(lián)系起來(lái)。這可以利用對(duì)測(cè)量到的光譜數(shù)據(jù)的反卷 積技術(shù)有效地實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)Jansson，Deconvolution(1984)，supra。為此目的，已研究出諸 如理論模型之類的數(shù)學(xué)描述來(lái)實(shí)現(xiàn)反卷積。實(shí)際上，被選擇用來(lái)描述光譜數(shù)據(jù)(即描述基 本的物理和化學(xué)的理論模型)的模型匹配測(cè)量到的光譜。例如，通過(guò)使根據(jù)理論模型預(yù)測(cè) 的光譜匹配測(cè)量到的光譜來(lái)解析諸如血紅蛋白成分的變化之類的血液的物理性質(zhì)和化學(xué) 性質(zhì)。這些變化直接涉及微生物的存在。此外，采用理論模型的反卷積處理的結(jié)果包括對(duì)微生物的倍增時(shí)間、呼吸速率和其他物理特性的確定，其中，所述其他物理特性例如尺寸和 形狀，還有氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的分壓值和分壓變化速率。取決于通過(guò)血樣獲取信息的類型，可以利用可與基本譜線形狀、發(fā)色團(tuán)和散射圖 樣有關(guān)的光譜數(shù)據(jù)的不同數(shù)學(xué)描述來(lái)使用反卷積技術(shù)。這些數(shù)學(xué)描述包括但不限于理論模 型、經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃徒y(tǒng)計(jì)模型。這些模型可具有如下描述(i)數(shù)學(xué)上的描述(即包括函數(shù)或 公式)和/或(ii)統(tǒng)計(jì)學(xué)的描述(即包括主分量或主數(shù)據(jù)庫(kù))。在所有情況中，在光譜 的描述中隱含的參數(shù)受如下示例性的變量影響 生長(zhǎng)介質(zhì)的成分； 頂部空間的成分，包括氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的分壓； 血樣的初始成分，尤其是血樣的氧化程度； 紅細(xì)胞的濃度；和/或 血樣中存在的微生物的濃度和類型。另外的變量是血培養(yǎng)物中指示劑(例如，血紅蛋白)成分的變化速率，該變化速率 可以是如下參數(shù)的函數(shù) 血樣中初始的指示劑濃度(例如，假設(shè)為血紅蛋白，表示為總血紅蛋白或血細(xì) 胞比容)；和/或 血樣中存在的微生物的初始濃度和生長(zhǎng)速率，其中，所述生長(zhǎng)速率(至少部分 地)受存在的微生物的類型影響。諸如血紅蛋白之類的指示劑的變化速率與氧氣濃度成比例，繼而與存在的微生物 的數(shù)量和他們的呼吸速率成比例。根據(jù)本發(fā)明的原理，已實(shí)現(xiàn)的模型能夠描述如下與樣本的指示劑(例如，血紅蛋 白)成分的變化以及其他物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化有關(guān)的四個(gè)不同的時(shí)間段。這個(gè)模型 基于對(duì)影響光譜的不同變量的分析，所述變量例如上文列舉的變量。1.初始平衡，在這期間，血紅蛋白與溶解于生長(zhǎng)介質(zhì)和頂部空間中的氣體成分 相平衡。在這期間，基于所述介質(zhì)的濃度，紅細(xì)胞可改變尺寸和形狀(例如，膨脹、裂解 (lysis)、圓鋸齒狀及類似的情況)。2.微生物引起血液的血紅蛋白成分和/或物理性質(zhì)的變化的第二時(shí)間段，該第二 時(shí)間段對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)物生長(zhǎng)的“延滯期”的早期(即當(dāng)生物體的數(shù)量低速增加時(shí)，例如，對(duì)應(yīng) 于大約 l_103CFU/mL)。3.血液的血紅蛋白成分和/或物理性質(zhì)快速變化的第三時(shí)間段，其發(fā)生在微生物 的指數(shù)生長(zhǎng)期間(大約106-107CFU/mL)。4.以血液的血紅蛋白和/或物理性質(zhì)的繼續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)樘卣鞯牡谒臅r(shí)間段，其對(duì)應(yīng)于 培養(yǎng)物的指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束和穩(wěn)定期的開(kāi)始(通常在108-109CFU/mL之間)。因此，通過(guò)透射和/或反射獲得的光譜可解析為培養(yǎng)過(guò)程中的任意點(diǎn)血液的血紅 蛋白成分和/或物理性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，反卷積可利用但不限于利用標(biāo)準(zhǔn)的最小二乘估計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn) Welch et al. , J. Clin. Micro. 20 :881_83(1984), Lawson et al. , Solving LeastSquares Problems (1974), and Jansson, supra。對(duì)于透射和反射而言，標(biāo)準(zhǔn)的最小二乘解可根據(jù)線 性或非線性解釋模型實(shí)現(xiàn)。這些模型在接下來(lái)的部分中有更詳細(xì)地描述。
D.模型1.線性解釋模型在合適的近似下可以推導(dǎo)出透射測(cè)量和反射測(cè)量的線性解釋模型。i.透射模型當(dāng)散射效應(yīng)減小到最小(例如，當(dāng)紅細(xì)胞溶血)并且血紅蛋白在溶 液中時(shí)，比爾-朗伯(Beer-Lambert)定律可適用于透射測(cè)量。在這些條件下，光密度可表 示如下τ ( λ ) = α ( λ ) C+ ε(1)式中，τ (λ)表示作為波長(zhǎng)λ的函數(shù)的光密度矢量，α (λ)是作為波長(zhǎng)λ的函 數(shù)的一些形態(tài)的血紅蛋白的吸收系數(shù)矩陣，C表示所考慮的一些形態(tài)的血紅蛋白的濃度矢 量，ε表示與測(cè)量相關(guān)的誤差。普通最小二乘解由下式給出C = (α Τα Γ1 α τ(2)式中，符號(hào)(.”表示矩陣(.)的轉(zhuǎn)置矩陣，而符號(hào)(.Γ1表示矩陣(.)的逆矩陣。ii.反射模型用于反射測(cè)量的最成功的模型之一為庫(kù)貝爾卡-芒克 (Kubelka-Munk)公式，它將無(wú)限層厚度R00 ( λ )對(duì)應(yīng)的漫反射與反射層的基于波長(zhǎng)的宏觀 吸收截面Pa(X)以及修正的宏觀散射截面PstU)和/或細(xì)胞懸浮液聯(lián)系起來(lái) (I-糊)2(3)#JaL Mignani et al. ， Kortum, and Pisharoty, supra?！癷f iE白勺 宏觀散射截面”有時(shí)也稱為“簡(jiǎn)化的宏觀散射截面”。就此而言，這些術(shù)語(yǔ)在本申請(qǐng)全文中 可以互換使用。宏觀吸收截面和修正的散射截面二者都是散射元(主要是紅細(xì)胞，參見(jiàn)下 面的公式10-12)的大小、成分以及濃度的函數(shù)。在弱吸收和固定散射的條件下(即在宏 觀散射截面μ s(λ)等于常數(shù)s時(shí))，僅宏觀吸收截面是血紅蛋白濃度和血紅蛋白成分的函 數(shù)。在這些條件下，宏觀吸收系數(shù)可以由下式表示
'N^aW = NpYj Xjaj(A)(4)
7=1式中，α (λ)具有與公式(1)中相同的含義，Νρ為每體積懸浮液中紅細(xì)胞的數(shù)目， Xj是第j種形態(tài)的血紅蛋白的體積分?jǐn)?shù)。將公式(4)代入公式(3)并且整理項(xiàng)得到Fr(X) == KYxMi(5)式中，F(xiàn)kU)為反射函數(shù)，并且K = Np/S。參見(jiàn)Mignani et al.，supra。注意到 公式(5)中的函數(shù)&(入)與血紅蛋白的成分線性相關(guān)，因此，成分的估計(jì)可以使用公式⑵ 給出的最小二乘解得到。2.非線性解釋模型當(dāng)測(cè)量配置為以使由于紅細(xì)胞的出現(xiàn)而導(dǎo)致的散射對(duì)測(cè)量到的光譜的特征影響 顯著時(shí)適用非線性解釋模型。i.透射模型計(jì)入紅細(xì)胞的尺寸和成分的影響的透射的非線性解釋模型由下式 給出
式中，1是通路長(zhǎng)度，D表示微粒的特征尺寸，Qext表示消光效率，Np為每單位體積 的紅細(xì)胞的數(shù)目?？傁庑蔘raitOiiUhD)是微粒的光學(xué)性質(zhì)和懸浮介質(zhì)的函數(shù)，通過(guò)復(fù) 折射率Π (λ)

式中，η(λ)和Κ (λ)分別表示紅細(xì)胞的復(fù)折射率的實(shí)部和虛部，并且η。( λ)表 示懸浮介質(zhì)的折射率的實(shí)部。復(fù)折射率的實(shí)部和虛部是化學(xué)成分的函數(shù)，并且可通過(guò)來(lái)自散射元的每個(gè)群
體內(nèi)發(fā)色團(tuán)的影響的加權(quán)和計(jì)算出。參見(jiàn)Alupoaei et al.，ChemicalEngineering
式中，ω」表示第j種形態(tài)的血紅蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并且N表示所考慮的發(fā)色團(tuán)的 總數(shù)目(例如，血紅蛋白形態(tài)的數(shù)目)。有必要注意的是，光學(xué)性質(zhì)的相加性僅作為散射計(jì) 算的一部分適用。將公式(6)-(9)表示的散射影響相加實(shí)現(xiàn)了所考慮的血紅蛋白形態(tài)的總 的質(zhì)量平衡。ii.反射模型描述無(wú)限層厚度的對(duì)應(yīng)的漫反射的Kubelka-Mimk模型分別通過(guò)基 于波長(zhǎng)的宏觀吸收截面μ a( λ)和散射截面μ s( λ)將微粒(即紅細(xì)胞)的尺寸和成分的 影響計(jì)入在內(nèi)。所述宏觀吸收截面Pa(X)以及散射截面μ3(λ)描述了給定樣本內(nèi)出現(xiàn) 的多個(gè)散射元和發(fā)色團(tuán)的聯(lián)合的光學(xué)性質(zhì)。宏觀吸收截面可計(jì)算如下 其中，公式(10)右端的第一項(xiàng)包括單微粒吸收截面Cabs和微粒濃度Np的乘積，遍 及N種微粒種群計(jì)算總和，而第二項(xiàng)包含了來(lái)自濃度為Ci的M個(gè)發(fā)色團(tuán)(溶解于樣本的介 質(zhì)中)的吸收的影響。公式(Ila)和(lib)表示了總宏觀散射截面Ps(A)的兩種不同的近似，其中， μ s (λ)是單微粒散射截面cs。a、微粒濃度Np和第J種微粒種群(遍及N種微粒種群)的平 均體積Vp的函數(shù)


(Ila) (iib) 在公式(Ila)和(lib)所示的兩種近似中，多散射近似將一種或一種以上微粒種群的影響計(jì)入在內(nèi)。公式(Ila)中的第一種近似將對(duì)每種單獨(dú)的微粒種群計(jì)算得到的宏觀 散射截面的和估算成總的宏觀散射截面。公式(lib)中的第二種近似將對(duì)每種單獨(dú)的微粒 種群計(jì)算得到的宏觀散射截面的和估算成總的宏觀散射截面，這取決于存在的其他微粒種 群的濃度和體積。對(duì)于每一種上述散射系數(shù)的近似，簡(jiǎn)化(修正)的宏觀散射截面ystU)可以分 別由公式(12a)和(12b)表示 在公式(12a)和(12b)中，散射系數(shù)μ s( λ )被修正以用于解釋散射的各向異性 < μ > (也被稱為不對(duì)稱參數(shù))。單微粒截面Cabs和cs。a可以根據(jù)如下文獻(xiàn)所描述的方法來(lái) 計(jì)算，例如Sharaf, Μ. A.，et al.，Chemometrics (Wiley-IEEE, 1986) ；vande Hulst, H. C.， Light Scattering by Small Particles (Wiley，1957)。所述血紅蛋白成分的影響通過(guò)公式 (8)-(9)中描述的復(fù)折射率產(chǎn)生。吸收和散射截面隨后可根據(jù)從樣本中提取的信息的種類 使用適當(dāng)?shù)纳⑸淅碚?例如Mie、Rayleigh-Debye-Gans等)來(lái)計(jì)算。參見(jiàn)Sharaf et al. and van de Hulst, supra ；Kerker, The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation(1969) ；ffiscombe, Applied Optics 19:1505—09(1980)。待估計(jì)的參數(shù)為對(duì)應(yīng)于每個(gè)發(fā)色團(tuán)的微粒的數(shù)目、尺寸分布和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在透 射測(cè)量的情況下，這些參數(shù)可采用標(biāo)準(zhǔn)非線性估算法通過(guò)測(cè)量到的光譜估計(jì)出來(lái)。參見(jiàn) Lawson et al. and Jansson et al.，Supra0iii.光子漫射近似模型光子漫射近似模型是對(duì)輻射傳遞公式假設(shè)簡(jiǎn)化的的結(jié) 果。參見(jiàn)Mignani et al. and Reynolds et al.，supra。這些模型已成功應(yīng)用到一系列廣 泛的物理現(xiàn)象中，該物理現(xiàn)象包括恒星大氣中輻射能量的傳播和核反應(yīng)堆中的中子散射。 還可參見(jiàn) Chandrasekhar，Radiative Transfer (1950) ；Caseet al.，Linear Transport Theory(1967)。此外，他們充分描述了基本上所有以前的血液中光傳播的研究(其中，極 化效應(yīng)不重要)。參見(jiàn) Cheung et al.，Reynoldset al. (1975)，Reynolds et al. (1976)， supra ；Bell，G. I.，and S.Glasstone, NuclearReactor Theory (Van Nostrand Reinhold Co.，1970) ；Ishimaru, Α. , WavePropagation and Scattering in Random Media(1997)。上述引用的文獻(xiàn)描述了解決血液中光子漫射問(wèn)題的有效方案，該方案是從用于任 意的檢測(cè)器孔徑漫反射(即反向散射強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)化為入射通量)的角度來(lái)陳述。上 述方案可以表達(dá)如下
式中，Df是修正的光子漫射常數(shù)，I1和K1分別表示第1類、第2類的一階修正的 Bessel函數(shù)，a為光源的半徑，1^是Green函數(shù)的第η個(gè)特征值，ζ為厚度，為總的 吸收禾B散身寸截面° 參見(jiàn) Chandrasekhar, Case et al. , Bell et al, and Ishimaruet al., supra ； Johnson,IEEE Trans. Biomed. Eng. 17 129-33(1970)。 入射到孔半徑為b、距離光源的距離為rb的檢測(cè)器的漫反射(反向散射)強(qiáng)度 Rd(A)可通過(guò)下面的公式計(jì)算 式中，Γι = rb-b和r2 = rb+b。類似地，考慮到跨樣本厚度的光子的凈通量，與漫 射近似對(duì)應(yīng)的漫透射率可表示成 式中，d為樣本的厚度，ζ為觀測(cè)到透射光處的厚度，Rdn對(duì)應(yīng)于公式(13)中反射率 級(jí)數(shù)的第η項(xiàng)。發(fā)明人結(jié)合散射截面、吸收截面和透射截面(集合了公式10-12和14)的定義已 實(shí)施公式12-22以構(gòu)成可有效地用于分析透射光譜和反射光譜的基本解釋模型。此外，這 種解釋模型可容易地?cái)U(kuò)展至計(jì)入不同邊界條件、準(zhǔn)直透射條件和反射條件以及分層邊界 (例如，玻璃、塑料和其他薄膜)的影響。參見(jiàn)Cheung et al. and Mignani et al·，supra。 從這些模型中可得到示例性的參數(shù)，該示例性的參數(shù)包括 探測(cè)幾何參數(shù)，涉及光源和檢測(cè)器的孔徑以及二者之間的距離。 樣本的物理特性，包括但不限于散射元、發(fā)色圖(例如，血紅蛋白和核苷酸)和 微粒(例如，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和病原體)的濃度、尺寸和成分。參照兩組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的原理，詳細(xì)描述如下(1)光譜特征隨血樣成 分變化的期望變化的理論模擬；(2)血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中隨時(shí)間的推移而產(chǎn)生的光譜數(shù)據(jù) 用理論模擬反卷積，并且隨后得到的反卷積結(jié)果用于確定微生物的存在。
E.理論模擬1. 一般假設(shè)透射數(shù)據(jù)和反射數(shù)據(jù)基于如下假設(shè)產(chǎn)生首先，假設(shè)三種最普遍形態(tài)的血紅蛋白為氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和正鐵血 紅蛋白，并且描述細(xì)胞群變化的整體機(jī)制由如下示例性的式子的適當(dāng)組合給出 式中，l·^和μ i表示微生物的濃度變化，Nebcj0和Nffial表示紅細(xì)胞的濃度變化，而 [Hb]表示溶液中游離血紅蛋白(由于溶血)的濃度。血紅蛋白成分的變化可描述如下代 謝產(chǎn)物 式中，Hb02、Hb和mHb分別表示氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和正鐵血紅蛋白。這 些計(jì)算可以采用其他形態(tài)的血紅蛋白實(shí)現(xiàn)，所述其他形態(tài)的血紅蛋白包括但不限于碳氧血 紅蛋白和硫血紅蛋白。式子23-26描述了在需氧條件下微生物代謝活動(dòng)的影響。式子23_24可適用于缺 氧條件。在第二假設(shè)下，在初始平衡時(shí)間段，血紅蛋白要么是氧合的，要么是脫氧的，這取 決于頂部空間的成分和樣本容器內(nèi)的介質(zhì)。參見(jiàn)Priezzheve et al.，Shrot et al. and Repaske et al. ,supra。在不存在微生物的情況下，血紅蛋白成分從氧合血紅蛋白到正鐵血紅蛋白緩慢地 變化(參見(jiàn)式子27)。對(duì)于針對(duì)微生物污染的血培養(yǎng)分析來(lái)說(shuō)，可認(rèn)為此過(guò)程不重要。最后，假設(shè)緩沖所述介質(zhì)以防止PH值顯著變化。2.理論上的透射光譜模擬透射光譜體現(xiàn)了樣本的性質(zhì)和測(cè)量裝置的配置。樣本參數(shù)包括但不限于紅 細(xì)胞的體積、培養(yǎng)基中紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)、血紅蛋白在紅細(xì)胞中所占分?jǐn)?shù)。示例性的測(cè)量裝 置可認(rèn)為是拋光的無(wú)透鏡的光纖終端。圖3示出通過(guò)結(jié)合圖1中所示的血紅蛋白的光學(xué)性質(zhì)使用公式(6)至(9)計(jì)算 得到的理論上的漫射透射光譜。圖3中的每條線表示如下四種常見(jiàn)形態(tài)的血紅蛋白中的 一種氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、碳氧血紅蛋白和正鐵血紅蛋白，使用的紅細(xì)胞的體積 (Vp)為90 μ m3，樣本中紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)(N/Vp)為0.084，紅細(xì)胞中的血紅蛋白的體積分 數(shù)為0. 33。值得注意的是氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、正鐵血紅蛋白和碳氧血紅蛋白之間 的光譜差異。血紅素基團(tuán)的特性在400nm(索雷帶，Soret band)附近的吸收帶和在500nm
15與600nm之間的區(qū)域容易顯而易見(jiàn)。圖4給出了圖3中數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)表示。對(duì)數(shù)變換增強(qiáng)了光譜的近紅外區(qū)的吸收帶之 間的差異。比較圖4和圖1表明，即使在將由于紅細(xì)胞的尺寸和濃度引起的散射效應(yīng)計(jì)入 時(shí)(即通過(guò)采用公式6至9)，血紅蛋白的消光光譜的吸收特征仍得以保持。根據(jù)本發(fā)明 的原理，可采用上述差異來(lái)估計(jì)不同形態(tài)的血紅蛋白對(duì)應(yīng)的成分。根據(jù)理論上計(jì)算出的光譜明顯看出(圖3和圖4)，透射測(cè)量足夠清楚以識(shí)別由于 血樣中微生物的存在引起的血紅蛋白的變化。3.理論上的反射光譜為了模擬反射，可考慮示例性的反射探頭配置，該配置包括孔徑直徑為400μπι的 發(fā)射光纖和接收光纖，每個(gè)光纖以500 μ m的中心到中心的距離分隔開(kāi)(例如，參見(jiàn)圖2所 示的配置)。因?yàn)榉瓷湫盘?hào)在500nm以下飽和，所以在血液情況下用來(lái)進(jìn)行反射測(cè)量的合適 的光譜窗可選擇介于500nm到IlOOnm之間。所述光譜窗包括與血紅素基團(tuán)的電子結(jié)構(gòu)對(duì) 應(yīng)的吸收帶。應(yīng)當(dāng)指出的是，上述的波長(zhǎng)范圍的選擇是由于檢測(cè)器裝置與技術(shù)的限制，并不 表示本發(fā)明的各種實(shí)施方式的固有限制。所以如果有更尖端的檢測(cè)系統(tǒng)可用，則可以容易 地?cái)U(kuò)展上述光譜測(cè)量范圍。圖5示出使用公式13計(jì)算的示例性的理論上的漫反射光譜。注意到在圖5中，與 不同形態(tài)的血紅蛋白對(duì)應(yīng)的重要光譜差異區(qū)別明顯。這些反射光譜的差異以及與透射光譜 相關(guān)的差異可用來(lái)估計(jì)由于微生物的存在引起的血紅蛋白的相應(yīng)成分的變化。式子(23)至(26)描述的機(jī)理表明從氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白的轉(zhuǎn)化速率和 /或樣本的微粒數(shù)與微生物的數(shù)目成比例。因此，可以模擬光譜特征如何隨生物體的生長(zhǎng)速 率變化。微生物的代謝活動(dòng)改變需氧樣本中的血紅蛋白的成分。圖6示出20分鐘倍增時(shí)間 內(nèi)典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。圖7和圖8描繪了由于圖6所表征的微生物的代謝活動(dòng)而引起的 由氧合血紅蛋白到脫氧血紅蛋白的轉(zhuǎn)化。上述轉(zhuǎn)化隨時(shí)間的走向通過(guò)圖8中的箭頭表示。 圖7示出氧合血紅蛋白隨時(shí)間的轉(zhuǎn)化，而圖8描述了標(biāo)準(zhǔn)化的反射光譜。標(biāo)準(zhǔn)化包含修正 光譜，這樣血紅蛋白光譜的等吸光點(diǎn)(約805nm)得以保持。這提供了精確的光譜對(duì)光譜的 比較，并且修正了抽樣變化性和測(cè)量對(duì)測(cè)量的變化性。在圖7和圖8所示的模擬中，未考慮初始平衡期。為達(dá)到這組模擬的目的，假設(shè)初 始條件為血液被100%氧合。就此而言，氧合血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)與樣本中微生物的生長(zhǎng)共 同變化。如圖7所示，在細(xì)菌生長(zhǎng)的整個(gè)延滯期(0-4小時(shí))，氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白 逐步轉(zhuǎn)化。隨后，當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期(4-7小時(shí))時(shí)，氧合血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)快速下 降。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)平穩(wěn)生長(zhǎng)期(7-12小時(shí))時(shí)，氧合血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)繼續(xù)下降。血紅蛋 白轉(zhuǎn)化曲線中拐點(diǎn)的存在代表了微生物的代謝活動(dòng)。圖9示出在圖6和圖7中所示的微生物生長(zhǎng)情況下的血樣的完整時(shí)間過(guò)程的模擬 反射光譜。血紅蛋白轉(zhuǎn)化曲線的變化可通過(guò)圖8和圖9所示估算的光譜察知。注意到，當(dāng) 培養(yǎng)物到達(dá)延滯期時(shí)所述光譜出現(xiàn)了明顯的變化。這代表了微生物的代謝活動(dòng)；因此，可識(shí) 別為陽(yáng)性樣本。根據(jù)本發(fā)明的原理，依賴光譜測(cè)量的質(zhì)量，可在延滯期識(shí)別微生物的存在， 從而與傳統(tǒng)技術(shù)的實(shí)現(xiàn)相比顯著地減少了檢測(cè)的時(shí)間。這種提升的檢測(cè)能力的進(jìn)一步的細(xì) 節(jié)和實(shí)施例將在本文中描述。
通過(guò)理論上的透射光譜和反射光譜預(yù)測(cè)的差異清楚表明，由血液中生物體的代 謝活動(dòng)引起的血紅蛋白成分的變化可容易地在電磁光譜的紫外線-可見(jiàn)光-近紅外線區(qū) (UV-Vis-NIR)通過(guò)多波長(zhǎng)光譜技術(shù)測(cè)量出。圖10提供了描述根據(jù)本發(fā)明原理在血樣中檢 測(cè)微生物所需的示例性步驟的順序的流程圖。在步驟100中，用電磁輻射輻照一種或一種 以上血樣。例如，該步驟通過(guò)由可工作在UV-Vis-NIR范圍的寬頻譜光源輻照血樣來(lái)完成。 在步驟102中，測(cè)量反射輻射和/或透射輻射。例如，步驟102可使用市售的分光計(jì)來(lái)完成。 在步驟104中，對(duì)檢測(cè)到的光譜反卷積。例如，反卷積可提供與在血樣內(nèi)或者接觸血樣的指 示劑(例如，血紅蛋白)的獨(dú)特形態(tài)有關(guān)的光譜特性。在步驟106中，分析通過(guò)步驟104獲 得的反卷積結(jié)果以檢測(cè)微生物。例如，檢測(cè)微生物可包括檢測(cè)如下內(nèi)容與微生物有關(guān)的類 型、生長(zhǎng)速率、不存在、存在和/或其他特性。F.氣-液平衡模型現(xiàn)今可用的血培養(yǎng)系統(tǒng)基于在需氧和厭氧環(huán)境中為微生物的生長(zhǎng)建立最優(yōu)的條 件，以及對(duì)由熱力學(xué)封閉系統(tǒng)中微生物的生長(zhǎng)而產(chǎn)生的微生物代謝產(chǎn)物和氣體的檢測(cè)。這 樣的熱力學(xué)封閉系統(tǒng)可定義為已知的質(zhì)量平衡，該質(zhì)量平衡要么是物理上約束的(例如， 像在封閉的容器中)，要么是化學(xué)上約束的(例如，在開(kāi)放容器的情形中，該開(kāi)放容器具有 充當(dāng)重要反應(yīng)外部環(huán)境屏障的惰性氣體)。一般而言，血培養(yǎng)系統(tǒng)是物理上封閉的，因而污染的微生物的代謝產(chǎn)物在瓶中積 聚并在存在的氣相(頂部空間)、液相(例如，培養(yǎng)基和血漿)和固相(例如，固定的指示 劑，微粒)之間分布。此種情況下的微?；旧鲜羌t細(xì)胞(RBC’s)，盡管最初還可能存在能 夠進(jìn)行呼吸作用的白細(xì)胞、血小板和微生物。隨著時(shí)間的流逝，污染微生物的數(shù)目增加，導(dǎo) 致他們的代謝產(chǎn)物的濃度增大，該代謝產(chǎn)物與不同的血液成分相互作用。以這種熱力學(xué)封閉系統(tǒng)的氣態(tài)和液態(tài)成分的狀態(tài)為特征的氣-液平衡模型可用 來(lái)估計(jì)PH值、氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的總壓和分壓。這些參數(shù)是血樣構(gòu)成的重要 指標(biāo)。例如，因?yàn)楦鞣N形態(tài)的血紅蛋白與氧氣和二氧化碳的可用性密切相關(guān)，所以理解這些 氣體的分壓和/或濃度可提供檢測(cè)血樣中微生物存在或不存在的附加維度。類似于先前描述的與應(yīng)用于血紅蛋白反射光譜的反卷積技術(shù)有關(guān)的原理，反射光 譜可與基于理論的模型結(jié)合以估算血培養(yǎng)瓶中的氣-液平衡狀態(tài)。在一種情況下，氣-液 平衡模型可獨(dú)立于反射光譜研究和評(píng)估，并且該模型與光學(xué)測(cè)量一起使用來(lái)進(jìn)行反卷積以 評(píng)定微生物存在或不存在。這些技術(shù)可進(jìn)一步提供血樣中存在的特定微生物的識(shí)別。另一方面，如果僅光學(xué) 測(cè)量可用，那么氣體分壓可通過(guò)反射測(cè)量獲得的液相的成分估計(jì)獲得。而且，與氣-液平衡 模型聯(lián)合使用的反卷積技術(shù)可與通過(guò)相同血樣獲得的附加的物理測(cè)量結(jié)果、化學(xué)測(cè)量結(jié)果 和代謝測(cè)量結(jié)果配對(duì)以確定一種或一種以上微生物存在或不存在。定性描述接下來(lái)提供與將血樣引入到血培養(yǎng)瓶中相關(guān)的事件的示例性順序。在時(shí)刻t = 0_， 在接種血樣之前，假設(shè)具有無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液的血培養(yǎng)瓶處于平衡；這就是說(shuō)，頂部空間的成分與 室內(nèi)溫度和壓強(qiáng)下的液相處于熱力學(xué)平衡。在時(shí)刻t = 0+，所有的血樣已被引入到培養(yǎng)瓶， 血液的物理和化學(xué)參數(shù)(例如，溫度、滲透度、成分、PH值和其他參數(shù))的調(diào)整開(kāi)始以適應(yīng)培 養(yǎng)瓶的物理和化學(xué)環(huán)境。物理調(diào)整的例子包括紅細(xì)胞和其他血液成分的形狀、體積(膨脹、收縮)、數(shù)密度(溶血)的變化。同時(shí)，化學(xué)成分的化學(xué)變化也存在于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的氧氣-二 氧化碳狀態(tài)中，這繼而決定了血紅蛋白的化學(xué)形態(tài)。隨著時(shí)間的流逝，微生物的數(shù)密度在血培養(yǎng)物的培養(yǎng)期增長(zhǎng)。微生物的呼吸代謝 活動(dòng)使血培養(yǎng)瓶中的化學(xué)成分發(fā)生變化，例如，氧氣分壓的減少以及二氧化碳分壓對(duì)應(yīng)的 增加。這些化學(xué)變化驅(qū)使血紅蛋白平衡由氧合血紅蛋白(HbO2)趨向脫氧血紅蛋白(Hb)和 氨基甲酰血紅蛋白(HbC02)。在不存在微生物時(shí)，紅細(xì)胞會(huì)慢慢變老，最終死亡，并且血樣中 存在的血紅蛋白幾天后轉(zhuǎn)化為正鐵血紅蛋白(metHb)。如果由于紅細(xì)胞脆弱而導(dǎo)致出現(xiàn)溶 血和/或由于由某些細(xì)菌(例如，產(chǎn)氣莢膜梭菌)產(chǎn)生溶血，可觀測(cè)到兩種結(jié)果紅細(xì)胞密 度的減少和液相下游離血紅蛋白濃度的增加。值得注意的是，由于微生物的存在而發(fā)生在 血液中的物理和化學(xué)變化，以及微生物的生長(zhǎng)行為，可以使用前面部分所述的分光光度法 來(lái)定量地測(cè)量。同大多數(shù)生物反應(yīng)器一樣，血培養(yǎng)系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜。為了便于理解本發(fā)明的原理，可 做一系列的假設(shè)和近似·生物反應(yīng)器充分混合，每相均勻并工作在等溫條件下。 營(yíng)養(yǎng)物過(guò)剩，這樣該營(yíng)養(yǎng)物的濃度可假設(shè)為常數(shù)。 生長(zhǎng)介質(zhì)的緩沖能力使pH值保持近似為常數(shù)。 僅分析三種形態(tài)的血紅蛋白(氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和氨基甲酰血紅蛋 白)。 血液與血培養(yǎng)環(huán)境之間的初始平衡假設(shè)在t = 0時(shí)刻瞬時(shí)發(fā)生。 血紅蛋白對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于模型的時(shí)步。 血紅蛋白的組成總是與血液培養(yǎng)容器處于化學(xué)平衡。 由于代謝活動(dòng)而產(chǎn)生的血紅蛋白成分的所有可能的影響中僅考慮氧合血紅蛋 白、脫氧血紅蛋白和氨基甲酰血紅蛋白之間的轉(zhuǎn)化。 在呼吸作用中消耗1摩爾氧氣產(chǎn)生1摩爾二氧化碳。在上述假設(shè)下，可形成需氧血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)發(fā)生的過(guò)程的一般數(shù)學(xué)描述以能夠定量評(píng) 估培養(yǎng)物。定量描述物理變化血液成分(主要是紅細(xì)胞群)的物理尺寸影響血液的光學(xué)測(cè)量。紅細(xì)胞的物理變 化的例子可由下面的公式表示 式中，Vrbc (t)是作為時(shí)間的函數(shù)的紅細(xì)胞體積，Vrbcj0是初始的或生理學(xué)上的紅細(xì) 胞體積，Δ ^是最大的體積增長(zhǎng)，而ksw是單位為[mirT1]的膨脹速率常數(shù)。Δ0和ksw兩者都 是特定血樣、溫度、滲透度、成分以及生長(zhǎng)介質(zhì)的PH值的函數(shù)。膨脹意味著液體進(jìn)入到紅細(xì) 胞中使得平均細(xì)胞血紅蛋白降低。紅細(xì)胞中血紅蛋白的體積分?jǐn)?shù)&可以估計(jì)如下 化學(xué)變化
在模型的每個(gè)時(shí)步中，血樣中的細(xì)胞群和血紅蛋白的狀態(tài)是血培養(yǎng)瓶中物理環(huán)境 和化學(xué)環(huán)境的函數(shù)。進(jìn)一步假設(shè)環(huán)境參數(shù)(例如，滲透度、PH值和培養(yǎng)溫度)在整個(gè)實(shí)驗(yàn) 中保持和0時(shí)刻設(shè)置一樣的常數(shù)。因此，唯一被考慮的暫時(shí)變化是血培養(yǎng)瓶中化學(xué)成分的 變化，其包括由于血液成分和微生物新陳代謝導(dǎo)致的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體成分(例如，氧氣和二 氧化碳)的變化。這些化學(xué)變化還影響了血紅蛋白成分和血紅蛋白在不同形態(tài)之間的轉(zhuǎn) 化。例如，系統(tǒng)中氧氣的耗盡可導(dǎo)致氧合血紅蛋白的解離以及脫氧紅蛋白和釋出的氧氣的 產(chǎn)生。如式子(30)所示，脫氧紅蛋白和二氧化碳反應(yīng)可產(chǎn)生氨基甲酰血紅蛋白。如式子 (31)所示，在模型系統(tǒng)中的總的血紅蛋白是三種形態(tài)血紅蛋白的總和并且假設(shè)是守恒的。 應(yīng)當(dāng)注意的是，血紅蛋白與一些試劑和/或微生物代謝產(chǎn)物反應(yīng)可導(dǎo)致形成其他形態(tài)的血 紅蛋白，例如正鐵血紅蛋白、碳氧血紅蛋白、硫血紅蛋白等。然而，如前所述，僅三種形態(tài)的 血紅蛋白在下面示例性模型的研究中考慮
HbCQ<>Hb<>HbQ(30) Hb、HbO2和HbCO2之間的平衡由系統(tǒng)中氧氣和二氧化碳的分壓控制，并且假設(shè)是 瞬時(shí)發(fā)生的，因?yàn)橛捎诩t細(xì)胞膜的大的表面積而使通過(guò)該紅細(xì)胞膜的氣體交換相對(duì)較快。 在這些假設(shè)下，HbO2-Hb-HbCO2平衡反應(yīng)了血培養(yǎng)瓶中的化學(xué)成分。血紅蛋白、氧氣和二氧 化碳之間的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)眾所周知，并且有大量數(shù)學(xué)模型處理氧氣和二氧化碳與血液交換和 影響它們的平衡的主要變量(例如，參見(jiàn)Mendelson，1992 ；Flewelling，2000)?？扇菀椎?使這些模型適合于描述發(fā)生在血培養(yǎng)中的平衡過(guò)程。對(duì)于這里所述的模型，采用Dash和 Bassingthwaighte[2004 ；2006]提出的模型來(lái)描述氧氣和二氧化碳與紅細(xì)胞中血紅蛋白 的平衡結(jié)合。此模型具有如下優(yōu)點(diǎn)包含氣體成分的影響以及溫度、PH值和滲透度的影響。細(xì)胞呼吸除血紅蛋白之外，血培養(yǎng)系統(tǒng)的氣體成分還被其他血液成分(例如，白細(xì)胞和血 小板)的呼吸作用以及微生物(當(dāng)被污染時(shí))影響。已測(cè)量出具體條件下的呼吸速率，并 且已研究出用于解釋電子傳遞鏈、生物量和從環(huán)境可利用的能量的嚴(yán)密的模型[例如，參 見(jiàn)Jin and Bethke，2007]。因?yàn)檫@些模型是普遍的模型且提供了底物和代謝產(chǎn)物之間的聯(lián) 系，所以它們可部署在考慮代謝產(chǎn)物的影響的情況下。在下面的描述中，氧氣的消耗和二氧 化碳的產(chǎn)生通過(guò)由反應(yīng)式(32)表示的簡(jiǎn)單近似表示。具體而言，反應(yīng)式(32)表明了每消 耗1摩爾氧氣，產(chǎn)生1摩爾二氧化碳。對(duì)于富含基質(zhì)的環(huán)境(例如，血培養(yǎng)瓶中的環(huán)境)來(lái) 說(shuō)，這是合理的假設(shè)。 除此之外，由于存在的細(xì)胞群的呼吸作用，假設(shè)培養(yǎng)瓶中氧氣和二氧化碳的總量 的變化是精確的。公式(33)描述了模型的一般呼吸體系。在這個(gè)公式中，假設(shè)氧氣的總損 耗是由J個(gè)細(xì)胞群消耗的氧氣的和，通過(guò)所述細(xì)胞群的數(shù)目密度Nj的產(chǎn)物和分配的呼吸速 率krJ表不 通常，污染的微生物在血培養(yǎng)瓶中氧氣的消耗中占主要位置，這是由于所述微生 物的高代謝呼吸速率。然而，在白血病或血小板增多癥的情況下，白細(xì)胞或血小板分別可使 用大部分可用的氧氣，特別是在微生物數(shù)目少的時(shí)期。細(xì)胞生長(zhǎng)第j個(gè)細(xì)胞群的數(shù)密度隨時(shí)間的演變 (t)可利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)模型來(lái)近似表示，如 公式34所示 已建模的細(xì)胞群的生長(zhǎng)/衰減速率常數(shù)kDj和標(biāo)準(zhǔn)值Njoo和Njtl在圖24的列表中 給出。用于細(xì)胞生長(zhǎng)和呼吸作用的模型能夠?qū)ξ⑸锍醪椒诸?。生長(zhǎng)/衰減速率常數(shù)kDj 和呼吸速率在生物體之間變化，這取決于生物體如何遍及廣泛的物種成簇，如何區(qū)分各 種不同的病原體組。這些參數(shù)的幅值決定了檢測(cè)的時(shí)間。例如，對(duì)于每IOml血液有IO3CFU 的初始接種物，高速生長(zhǎng)的大腸桿菌的通常的檢測(cè)時(shí)間為10小時(shí)，而生長(zhǎng)較慢的白色念球 菌的檢測(cè)時(shí)間大約為24小時(shí)。還可以參見(jiàn)Longzhu Cui, et al，“Cell Wall Thickening Is a CommonFeature of Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus,，，Journal of ClinicalMicrobiology, Jan. 2003, p. 5—14。平衡因素O2的消耗和CO2的產(chǎn)生與細(xì)胞數(shù)目成比例，該細(xì)胞數(shù)目繼而隨著細(xì)胞生長(zhǎng)(微生 物)或者衰減(白細(xì)胞、血小板)變化。在各時(shí)間點(diǎn)，O2和CO2分布于血培養(yǎng)瓶的氣相和液 相之間，并且按照式子(30)所示影響血紅蛋白的化學(xué)形態(tài)。CO2平衡緊接著O2平衡。應(yīng)注 意到僅液相包括碳酸的基于PH值的解離。如公式(35)所表示，鑒于在氣相和液相之間的 氣體輸送的速率比CO2產(chǎn)生和O2消耗的速率大得多，則可以假設(shè)氣體的總平衡在血培養(yǎng)瓶 中瞬間完成。 模型中所作的進(jìn)一步假設(shè)包括適合于血培養(yǎng)瓶的氣相的理想氣體行為和適合于 液相的亨利定律適用性。根據(jù)這些假設(shè)和上述血紅蛋白-O2-CO2的動(dòng)力學(xué)，在氣相、液相和 血紅蛋白之間的氣體分布可以采用標(biāo)準(zhǔn)的氣-液平衡計(jì)算予以估算。G.示例性實(shí)驗(yàn)證明1.材料在這項(xiàng)研究中使用的微生物取自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ManaSSaS，VA)。微生 物介質(zhì)取自BD-BBUFranklin Lakes,NJ) 0下面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)用需氧的和厭氧的血培養(yǎng) 瓶采集，所述血培養(yǎng)瓶為bi0M6rieux公司(Hazelwood，M0)以BacT/ALERT 商標(biāo)出售 的培養(yǎng)瓶。然而，可以使用任何滿足下面的“方法”部分中所提及的標(biāo)準(zhǔn)的容器。來(lái)自健 康個(gè)體的血樣由佛羅里達(dá)血液服務(wù)中心(St. Petersburg，F(xiàn)L)提供，而全部的血球計(jì)數(shù)在CelI-DYN(Abbott Park, IL)上完成。測(cè)量血樣使用(A)反射監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(如圖2所示的那種)和(B)bioMerieux公司 生產(chǎn)的自動(dòng)化微生物檢測(cè)系統(tǒng)BaeT/ALERT 3D(作為參考用)。在臨床環(huán)境中使用的 BacT/ALERT 3D系統(tǒng)通過(guò)使用嵌入每個(gè)瓶底部的變色盤(color-changing disk)來(lái)檢 測(cè)微生物的存在。2.方法為了提高對(duì)血液中微生物活性的檢測(cè)能力，可以遵循下列條件 培養(yǎng)瓶在450nm至1300nm的光譜區(qū)應(yīng)是透光的。 在樣本容器內(nèi)的生長(zhǎng)介質(zhì)和/或其他成分的吸收特性和散射特性可以與獲得 和/或分析反射測(cè)量或透射測(cè)量的能力不相沖突。 可以使用能夠采集400nm至1300nm范圍內(nèi)的電磁輻射的高分辨率分光計(jì)。 容器應(yīng)當(dāng)為封閉系統(tǒng)(與容器外部無(wú)氣體交換)3.樣本制備使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備實(shí)驗(yàn)室生長(zhǎng)的微生物培養(yǎng)物。將2毫升至20毫升的靜脈血液 接種至血液培養(yǎng)容器中。將微生物以濃度為10-100CFU/mL血液加入血液培養(yǎng)容器。將副 本樣本放入反射監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(例如，參見(jiàn)圖2)和參考檢測(cè)系統(tǒng)。4.分光光度測(cè)量法使用Ocean Optics公司(Dunedin，F(xiàn)lorida)的配備有透射元件或者反射探頭的 USB-4000分光計(jì)實(shí)施光譜測(cè)量。通過(guò)將反射探頭置入圖2所示的結(jié)構(gòu)實(shí)施血液的反射測(cè) 量。反射探頭并未實(shí)際接觸容器表面。使用MgO2作為參考，將反射探頭的反射率調(diào)至100 %。5.對(duì)測(cè)量到的光譜反卷積對(duì)測(cè)量到的光譜反卷積包括估算解釋模型式子1至35中適當(dāng)組的可調(diào)參數(shù)，這 樣測(cè)量到的光譜和估算的光譜落在給定的容限內(nèi)。圖11至圖12顯示了在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(t =0. 25小時(shí)和119小時(shí))取得的測(cè)量到的光譜與其相應(yīng)的理論上匹配的光譜之間的對(duì)比。 較早的時(shí)間點(diǎn)(圖11)表示具有高濃度的氧合血紅蛋白的通常的樣本。后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)表示 具有三種形態(tài)的血紅蛋白(具體而言，氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和正鐵血紅蛋白)的混 合物的樣本。圖13至圖15還表明基于解釋模型式子(1)至(35)的估算的光譜與測(cè)量到的光 譜很好地相符。具體而言，圖13示出三種不同的無(wú)污染的血培養(yǎng)物的估算的光譜和測(cè)量到 的光譜，其以字母A、B和C標(biāo)明。表1示出對(duì)每種形態(tài)的血紅蛋白(氧合血紅蛋白、脫氧血 紅蛋白和正鐵血紅蛋白)的反射光譜反卷積所獲得的血培養(yǎng)物成分的參數(shù)。該參數(shù)包括紅 細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)、紅細(xì)胞中血紅蛋白的體積分?jǐn)?shù)、紅細(xì)胞的平均細(xì)胞體積、氧合血紅蛋白所 占分?jǐn)?shù)、脫氧血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)、正鐵血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)和殘差平方和。 圖14和圖15提供了兩種血樣的估算的光譜與測(cè)量到的光譜之間的對(duì)比，每種血 樣具有不同的平均紅細(xì)胞體積。圖14示出觀察到的血培養(yǎng)樣本的反射光譜在形狀和量級(jí) 上的差異。這些差異由于散射元的不同平均細(xì)胞體積而產(chǎn)生。在這個(gè)實(shí)例中，對(duì)照的血培 養(yǎng)物的散射元的數(shù)密度和微?；瘜W(xué)成分的相關(guān)參數(shù)相類似。表2中概括了反卷積結(jié)果。但 是，由于散射元的體積分?jǐn)?shù)與所述微粒的平均細(xì)胞體積成正比，所以這個(gè)參數(shù)也在測(cè)量到 的樣本之間變化。表2 圖14示出散射元的平均細(xì)胞體積和體積分?jǐn)?shù)的影響表現(xiàn)為在反射光譜的幅值 上不同。圖15中呈現(xiàn)的類似實(shí)例表明了在兩種樣本之間的光譜差異，這種差異的特征在于 微粒及其化學(xué)成分的體積分?jǐn)?shù)的可比較值，還在于不同的平均微粒體積(參見(jiàn)表3)。具體 而言，與光譜B相關(guān)的樣本具有更大的微粒數(shù)密度。
表3 i.實(shí)例白色念球菌圖16顯示了血樣的測(cè)量到的光譜與相應(yīng)的理論上估算的光譜之間的對(duì)比，該血 樣在接種后21. 5個(gè)小時(shí)時(shí)被酵母白色念球菌污染。根據(jù)本發(fā)明的原理執(zhí)行的反卷積的結(jié) 果表明測(cè)量到的光譜具有高的脫氧血紅蛋白含量。在上面的實(shí)例中，匹配的光譜為500-850nm之間的光譜，這個(gè)范圍的光譜數(shù)據(jù)具 有可接受的信噪比。反卷積的殘差證實(shí)了 模型準(zhǔn)確地描述了感興趣的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)。任何血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的事件的完整順序可以根據(jù)如下內(nèi)容進(jìn)行解釋在實(shí)驗(yàn)期間的 任何時(shí)間點(diǎn)樣本的血紅蛋白成分的變化、存在的微粒數(shù)目的變化和樣本的物理性質(zhì)和化學(xué) 性質(zhì)的變化(例如，參見(jiàn)式子21至27)。血紅蛋白成分隨時(shí)間的這種變化的例子在圖17和 圖18中針對(duì)白色念球菌示出。如圖17所示，顯然在15小時(shí)處從氧合血紅蛋白向脫氧血紅 蛋白的巨大轉(zhuǎn)化表明微生物的代謝活動(dòng)增加。此外，基于本發(fā)明的原理的反卷積方法的靈 敏度使得對(duì)轉(zhuǎn)化速率變化的提前檢出成為可能?？赏ㄟ^(guò)觀察圖18中的繪圖更好地理解這 種對(duì)從氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白的轉(zhuǎn)化速率隨時(shí)間變化的增強(qiáng)檢測(cè)能力。如圖18所 示，可早在初始接種后的大約10小時(shí)檢測(cè)微生物，而明顯的檢測(cè)可在接種后的大約14小時(shí) 進(jìn)行。ii.實(shí)例大腸桿菌根據(jù)本發(fā)明的原理，可使用上述反卷積方法獲取微生物的識(shí)別特性。這些特性包 括但不限于動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)參數(shù)(例如，倍增時(shí)間和呼吸速率)和物理特性(例如，尺寸和形 狀)。例如，圖19示出對(duì)于使用大腸桿菌的血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可使邏輯生長(zhǎng)模型匹配血紅蛋 白成分隨時(shí)間的變化。此外，注意成分?jǐn)?shù)據(jù)的完美匹配。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，估計(jì)大腸桿菌的倍 增時(shí)間為30分鐘。iii.實(shí)例產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧情況下，缺氧環(huán)境下的血紅蛋白平衡在接種至瓶中后立即將血紅蛋白轉(zhuǎn)化 為大約98%的脫氧血紅蛋白。在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)程中，血紅蛋白成分保持大體不變。與需 氧情況不同，微生物代謝活動(dòng)的主要指標(biāo)是微粒密度或細(xì)胞密度的變化。注意到，在厭氧情 況下，因?yàn)樵谠缙谑Ｓ嘌鹾涎t蛋白轉(zhuǎn)化為脫氧血紅蛋白，所以不用作指標(biāo)。然而，與液體 相關(guān)的其他指標(biāo)可以使用。在溶血生物體的實(shí)例中，游離血紅蛋白濃度的增加與增加的微 生物代謝活動(dòng)一致。圖20顯示了作為示例的反射光譜，該反射光譜從以溶血細(xì)菌產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)現(xiàn) 的血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中獲得。在該實(shí)驗(yàn)的初始幾小時(shí)后，血紅蛋白成分與富氧環(huán)境之間的平衡 是明顯的(圖20，光譜1)。在血紅蛋白成分穩(wěn)定后(光譜2)，光譜在形狀和量級(jí)上的變化 (光譜3)代表細(xì)菌生長(zhǎng)。在此階段，微生物的存在借助分光計(jì)明顯可見(jiàn)。在這種特定的情 形下，在達(dá)到這個(gè)階段后，細(xì)菌濃度使一定量的外毒素產(chǎn)生，該外毒素足以引起紅細(xì)胞的充 分裂解(從光譜4到光譜5的轉(zhuǎn)變)。注意到反射光譜5的強(qiáng)度的顯著降低與微粒數(shù)目的 下降一起出現(xiàn)。在紅細(xì)胞裂解后觀測(cè)到的增加的反射強(qiáng)度(光譜6)歸因于細(xì)菌生命體的 持續(xù)增加。圖20中所示的光譜特性通過(guò)使用前述根據(jù)本發(fā)明的原理的反卷積方法予以定 量。圖21顯示了根據(jù)光譜數(shù)據(jù)獲得的細(xì)胞密度隨時(shí)間的變化。從圖21可明顯看出，根據(jù) 本發(fā)明的原理，這種生物的存在可在大約7. 5小時(shí)或者早在4. 0小時(shí)時(shí)予以檢測(cè)出(明顯的檢測(cè))。在現(xiàn)有技術(shù)的系統(tǒng)中，例如BacT/ALERT系統(tǒng)，這種識(shí)別在12. 2小時(shí)后得出。iv.實(shí)例多種微生物圖22㈧和圖22⑶示出與如下實(shí)驗(yàn)相關(guān)的示例性反射光譜在該實(shí)驗(yàn)中，兩 種不同的微生物光滑念球菌(C. glabrata)(酵母菌)及表皮葡萄球菌(Staphylococcus 印idermidis)(細(xì)菌)都存在于同一血樣中。為了便于理解本發(fā)明的基本檢測(cè)原理，特別 制作圖22㈧以示出700nm單波長(zhǎng)的反射比的值隨時(shí)間的演變。圖22㈧表示與下列各項(xiàng) 相關(guān)的反射比的值的變化(1)初始氧合血紅蛋白，⑵正鐵血紅蛋白形成，⑶脫氧作用， (4)表皮葡萄球菌增加，以及(5)光滑念球菌增加。如圖22(A)所示，兩種微生物的存在和 類型能夠容易地在反射比的值上相區(qū)別。圖22(B)示出在可用于評(píng)定多種微生物的存在、 不存在和/或特性的大波長(zhǎng)范圍的反射光譜隨時(shí)間的演變。與本發(fā)明的上述方法不同，傳 統(tǒng)的系統(tǒng)不能檢測(cè)多種病原體的存在，并且不能提供關(guān)于病原體生長(zhǎng)行為的任何信息。圖23示出在具有多種污染物(具體而言，該多種污染物是細(xì)菌表皮葡萄球菌以及 酵母菌光滑念球菌)的血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)步中血樣的估算的光譜和測(cè)量到的光譜之 間的對(duì)比。圖23圖示了在500-850nm光譜范圍內(nèi)以一種粒子群(紅細(xì)胞)(指定為A)、兩 種粒子群(紅細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞)(指定為B)和三種粒子群(紅細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和菌細(xì)胞) (指定為C)為特征的血培養(yǎng)樣本的測(cè)量到的反射光譜(Riw)和估算的反射光譜(Rfti)以 及殘差平方和(ο s^)。雖然生長(zhǎng)于血培養(yǎng)物中的微生物污染物一般具有小尺寸(例如，細(xì) 菌的典型平均直徑為大約0. 5 μ m至2 μ m，而酵母菌細(xì)胞的直徑一般為3 μ m至10 μ m)，但 是在陽(yáng)性血培養(yǎng)物中它們通常達(dá)到每毫升IO7-IO9個(gè)細(xì)胞的數(shù)密度，從而能夠改變反射信 號(hào)。再來(lái)參考圖23，因?yàn)閮煞N不同的微生物具有不同的生長(zhǎng)速率，因此相應(yīng)地達(dá)到光學(xué)上 重要的數(shù)密度值所需的時(shí)間不同，所以有可能捕捉它們對(duì)反射信號(hào)的單獨(dú)的作用。在圖23 中，從光譜A到光譜B的光譜變化是由于表皮葡萄球菌達(dá)到每毫升0. 8 X IO9個(gè)細(xì)胞的估算 數(shù)密度。表4表示對(duì)圖23所示的漫反射光譜反卷積所獲得的血培養(yǎng)物成分的數(shù)目和其他 相關(guān)的參數(shù)。表皮葡萄球菌的細(xì)胞通常形成團(tuán)簇，估計(jì)該團(tuán)簇的平均細(xì)胞體積為3 μ m3 (參 見(jiàn)表4)。此外，光滑念球菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生額外的光譜變化，該光譜變化在圖23中表示從光譜 B向光譜C的轉(zhuǎn)變。對(duì)光譜C反卷積所獲得的光滑念球菌的平均細(xì)胞體積和細(xì)胞密度的相 應(yīng)估值分別為33. 5 μ m3和每毫升7 X IO7個(gè)細(xì)胞(參見(jiàn)圖4)。 圖14至圖23中顯示的結(jié)果清楚地表明，根據(jù)本發(fā)明的原理，通過(guò)結(jié)合漫反射測(cè)量 結(jié)果和適當(dāng)?shù)慕忉屇Ｐ妥鞫糠治鍪强尚械摹＞痛硕?，血培養(yǎng)物的血液和其他細(xì)胞成分 的生理性質(zhì)可用漫反射捕獲并作定量解析。v.實(shí)施例分壓下列的三個(gè)示例性的案例研究表明了根據(jù)本發(fā)明的原理實(shí)現(xiàn)的完整的處理測(cè)量 模型的性能以及用于細(xì)菌生長(zhǎng)的檢測(cè)的反射光譜模型的靈敏度。 案例I表明了圖24所示的適用于對(duì)照樣本和污染的樣本的示例性參考數(shù)據(jù)的 模型產(chǎn)生的結(jié)果。 案例II敘述了血樣體積的影響，血樣體積為現(xiàn)有的血液培養(yǎng)方法的重要參數(shù)。 案例III表明了血液成分隨增加的白細(xì)胞數(shù)(即白血病患者)而變化的實(shí)例。這個(gè)案例描述了現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)中假陽(yáng)性的可能原因。案例研究I 圖25使用圖24中所示的參考數(shù)據(jù)(IOmL血液；pp02 = 30mmHg ；ppC02 = 50mmHg) 將微生物的生長(zhǎng)與靜脈血的血小板及白細(xì)胞數(shù)目的下降相比較。選定的參數(shù)值和細(xì)胞密度 是實(shí)際情況遇到的典型值。微生物的倍增時(shí)間在生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)豐富的介質(zhì)中的需氧細(xì)菌的范 圍內(nèi)。圖26示出由每個(gè)細(xì)胞群消耗的氧氣分?jǐn)?shù)。白細(xì)胞和血小板的呼吸最初在氧氣的消耗中占主要地位，引起氧氣分壓的相應(yīng)減少。雖然血小板的數(shù)目更多，但是白細(xì)胞的特定呼吸速率使得每種種群的耗氧量大約相同。 微生物是具有較高代謝速率的最有活性的種群，并且數(shù)量不斷增加。微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致高的 氧氣消耗速率，這在生長(zhǎng)的延滯期(約4-6小時(shí))非常明顯。圖27示出了對(duì)照樣本和由100 微生物CFU/mL血液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)O2和CO2在液相和氣相之間隨時(shí)間的分布。瓶中的壓力是 由水、氧氣和二氧化碳作用的結(jié)果(系統(tǒng)處于真空條件下)。在對(duì)照樣本的情形(即沒(méi)有 微生物)中，一旦白細(xì)胞和血小板的種群失去活性，則壓力穩(wěn)定。在污染的樣本的情形中， O2分壓的減少以與細(xì)菌生長(zhǎng)成比例的速率持續(xù)不減細(xì)菌的特定的生長(zhǎng)速率和呼吸速率的 函數(shù)。在兩條線分開(kāi)的點(diǎn)可檢測(cè)微生物的存在。圖28中顯示了血紅蛋白的化學(xué)成分的變化。氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白以及氨 基甲酰血紅蛋白的濃度變化是整個(gè)過(guò)程的演變中氧氣和二氧化碳的分壓變化的結(jié)果。脫氧 血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比例([Hb]/[HbO2])對(duì)分壓的變化靈敏并且顯示在圖29中。該 比例([Hb]/[Hb02])可通過(guò)反卷積得到的反射測(cè)量結(jié)果直接獲得。如前所述，反射光譜是細(xì)胞數(shù)量、血液物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化以及存在于混 合物中的細(xì)胞群的吸收和漫反射特性的函數(shù)。此外，化學(xué)成分的影響通過(guò)復(fù)折射率的加和 性直接引入。反射模型關(guān)于測(cè)量變量是包容的。在此敘述的結(jié)果集中于與血紅蛋白化學(xué)成 分的變化有關(guān)的變量。之前已在圖5中針對(duì)不同形態(tài)的血紅蛋白(包括兩種主要形態(tài)，氧 合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白)說(shuō)明了圖24中列出的示例性血液特性的反射光譜。注意到 每個(gè)血紅蛋白種類所具有的不同的光譜特征；在測(cè)量模型中，這些區(qū)別特征使得精確的定 量光譜反卷積成為可能。通過(guò)使用圖24的列表中包含的血液性質(zhì)、式子28至31表示的物 理變化和化學(xué)變化以及圖5的示例性繪圖所示的化學(xué)成分的變化，反射光譜隨時(shí)間的演變 可根據(jù)本發(fā)明的原理予以推算。圖9進(jìn)一步示出在實(shí)驗(yàn)的全部時(shí)間過(guò)程中的光譜。案例研究II:接種至血培養(yǎng)瓶中的血液的體積構(gòu)成重要的參數(shù)有兩個(gè)原因。對(duì)于少的病原體數(shù) 目而言，血液體積的增加導(dǎo)致樣本包含病原體的較高可能性。從測(cè)量靈敏度的角度看，不同 的血液體積導(dǎo)致在液相和氣相之間不同的氧氣和二氧化碳分布。由于液相充當(dāng)CO2的容器 (capacitor)，而氣相充當(dāng)O2的容器，所以注入的血液的數(shù)量上的變化影響O2的分壓。最優(yōu) 的樣本具有最小體積的血液中的最大微生物濃度。圖30示出添加不同體積的血液(例如，2mL、5mL、IOmL和20mL ；pp02 = 30mmHg ； PPCO2 = 50mmHg)對(duì)O2和CO2分壓的影響。隨著血液體積的增加，不但分壓大大增加，而且 用于測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)的基線變得更難以區(qū)別。因此，關(guān)于是否有細(xì)菌生長(zhǎng)存在的指示被推遲 到生物體處在延滯期。分光光度測(cè)量的優(yōu)點(diǎn)在于，它們?cè)谌缦乱饬x上是自校正的光譜反卷積產(chǎn)生血培 養(yǎng)早期的有關(guān)脫氧血紅蛋白和氧合血紅蛋白的血細(xì)胞比容和相關(guān)濃度的定量信息。圖31 示出以這種方式得到的修正的[Hb]/[Hb02]比例。正如所料，血液體積增加的樣本具有較 大的微生物初始濃度，因此，檢測(cè)的時(shí)間更短。案例研究III:當(dāng)血液培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)僅基于CO2的生成測(cè)量微生物生長(zhǎng)時(shí)，其他細(xì)胞(例如，白細(xì) 胞和血小板)的呼吸可成為混淆因素，特別是在它產(chǎn)生假陽(yáng)性培養(yǎng)物的情形下。這對(duì)于具 有升高的白細(xì)胞濃度的白血病患者而言尤其重要。雖然在這個(gè)案例中只考慮了正常呼吸作
27用的影響，但是白細(xì)胞也可對(duì)病原體的存在起反應(yīng)，并且白細(xì)胞引起突發(fā)性呼吸是公知的， 在所述突發(fā)性呼吸中，在殺死微生物的過(guò)程中耗氧量可以增加到2至3倍[Lee，1999]。使用案例I中的血液參數(shù)，圖32和圖33說(shuō)明了具有一般的(5，000WBC/μ L血液) 和升高的(50，OOOffBC/ μ L血液和250，OOOffBC/ μ L血液)白細(xì)胞水平的感染的血培養(yǎng)物的 頂部空間中CO2和O2分壓的變化。使用直接總壓力測(cè)量或分壓測(cè)量使得唯一地將微生物 的新陳代謝作用與血液自身的呼吸過(guò)程相區(qū)別變得更加困難。另一方面，對(duì)氧合血紅蛋白 和脫氧血紅蛋白的反射光譜的分光光度測(cè)量及其反卷積揭示了與細(xì)菌生長(zhǎng)的存在可直接 聯(lián)系的唯一變化。此外，血紅蛋白成分可以容易地加以校正以使在血培養(yǎng)早期通過(guò)使用與 氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的血細(xì)胞比容及相應(yīng)的濃度有關(guān)的定量信息檢測(cè)微生物成 為可能。圖34示出對(duì)于考慮到的三種白細(xì)胞濃度而言，血培養(yǎng)物中血紅蛋白成分([Hb]/ [HbO2])隨時(shí)間的演變。有效性生成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集用于測(cè)試上述模型的魯棒性。兩個(gè)血培養(yǎng)瓶(BacT/AlertBPA， bioMerieux, Durham, North Carolina)被接種IOmL的包含有大約25CFU大腸桿菌的正常 健康血液(ATTC strain#25922 ；Manassas, Virginia) 將接種的培養(yǎng)瓶(seeded bottle) 之一放入BacT/ALERT 3D系統(tǒng)作比較。對(duì)被接種來(lái)自同一捐贈(zèng)者的IOmL血液的對(duì)照瓶做 相同的操作。這些瓶在37°C進(jìn)行培養(yǎng)，并且反射測(cè)量在11小時(shí)內(nèi)每?jī)煞昼娺M(jìn)行一次。圖 35示出在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選定時(shí)間點(diǎn)處接種的培養(yǎng)瓶的代表性的反射光譜。在圖35中用 箭頭表示隨時(shí)間的轉(zhuǎn)變趨勢(shì)。與圖9類似，在存在活性呼吸和繁殖的細(xì)菌的情況下，反射光 譜從氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白演變。如圖36所示，來(lái)自含有細(xì)菌的培養(yǎng)瓶的[Hb]/[HbO2]比例在9小時(shí)和10小時(shí)之 間與對(duì)照瓶的差異越來(lái)越大，這種差異對(duì)于置入BacT/ALERT 3D系統(tǒng)的培養(yǎng)瓶的陽(yáng)性表達(dá) (positive call)提前至少兩小時(shí)(12. 2小時(shí))。圖37描述了在整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間中頂部 空間的相應(yīng)壓力。與模擬(圖30) —致，隨著細(xì)菌的呼吸作用的影響施加于化學(xué)平衡，總壓 力和氧氣分壓顯著下降。CO2的高溶解度導(dǎo)致頂部空間中CO2的分壓的轉(zhuǎn)變不太明顯。紅細(xì)胞裂解的原因可在血培養(yǎng)物中出現(xiàn)的又一重要過(guò)程是紅細(xì)胞的裂解。裂解的紅細(xì)胞改變血樣中 微粒的體積分?jǐn)?shù)、數(shù)密度和平均細(xì)胞體積。因?yàn)榧t細(xì)胞是血培養(yǎng)物中的主要微粒種群，所以 紅細(xì)胞的裂解會(huì)影響如圖38所示的反射信號(hào)。圖38中的光譜A表示在溶血前來(lái)自血液培 養(yǎng)樣本的漫反射信號(hào)，而光譜B表示在溶血后來(lái)自同一樣本的反射信號(hào)。觀測(cè)到的光譜差 異是樣本中物理變化(即當(dāng)紅細(xì)胞破裂成碎片時(shí)微粒的尺寸、體積分?jǐn)?shù)和數(shù)密度的變化) 以及介質(zhì)中增加的游離血紅蛋白引起的化學(xué)變化的共同結(jié)果。這些結(jié)果通過(guò)表5中提供的 參數(shù)予以表示。裂解的物理干擾和化學(xué)干擾導(dǎo)致觀察到的反射信號(hào)幅度的減小。散射隨著 散射元體積分?jǐn)?shù)的減少而減少，而吸收隨著血紅蛋白在溶液中變成游離血紅蛋白而增加。 此外，如圖38所示，散射的減少使漫反射的吸收光譜特征幾乎不明顯并且使光譜扁平。因 此很顯然，根據(jù)本發(fā)明的原理，用宏觀截面的公式化表達(dá)對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行精確的數(shù)學(xué)描述， 包含有裂解的紅細(xì)胞的樣本的測(cè)量到的反射光譜可作合適地預(yù)測(cè)，并且可獲得樣本成分的 性質(zhì)(例如表5的示例性參數(shù))的合理的定量估計(jì)。表5 圖39提供了根據(jù)本發(fā)明的原理描述在封閉容器內(nèi)檢測(cè)血樣中的微生物所涉及的 示例性步驟的順序的流程圖。與圖10的流程圖相似，在步驟200中，采用電磁輻射輻照一種 或一種以上血樣。在步驟202中，測(cè)量反射輻射和/或透射輻射。在步驟204中，對(duì)檢測(cè)到 的光譜反卷積。在步驟206中，利用分光光度數(shù)據(jù)獲得氣體(例如，氧氣和二氧化碳)的分 壓，而在步驟208中，至少根據(jù)步驟206中獲得的氣體分壓檢測(cè)微生物。注意到，分壓的測(cè) 量可以獨(dú)立于光譜的反射測(cè)量和/或透射測(cè)量附加地或者選擇性地進(jìn)行。在這種情況下， 通過(guò)獨(dú)立的測(cè)量獲得的氣體分壓值可以與光譜的反射測(cè)量和/或透射測(cè)量結(jié)果一起使用 以完成反卷積過(guò)程，從而求出所有有關(guān)的參數(shù)，所述參數(shù)包括但不限于微生物檢測(cè)的時(shí)間。由微生物的代謝產(chǎn)物引起的血液性質(zhì)根據(jù)本申請(qǐng)的原理，還可以通過(guò)檢測(cè)由微生物的代謝產(chǎn)物引起的血液性質(zhì)的變化 來(lái)至少部分地或者在初始時(shí)進(jìn)行微生物的識(shí)別和/或分類。微生物生長(zhǎng)期間的代謝產(chǎn)物 (例如，過(guò)氧化物、乙醇、醛類、硫化物、氮氧化物、磷脂酶和其他分解酶，以及其他類似物) 的產(chǎn)生可引起血液成分(主要是紅細(xì)胞)的化學(xué)性質(zhì)和/或物理性質(zhì)上的某些改變。這些 改變可以包括血紅蛋白化學(xué)成分的變化(即正鐵血紅蛋白、硫血紅蛋白、氮血紅蛋白、氰 血紅蛋白、亞鐵血紅蛋白(ferrylhemoglobin)以及其他類似物的形成物)和/或紅細(xì)胞形 態(tài)結(jié)構(gòu)的變化(即裂解、膨脹、形狀以及其他類似的轉(zhuǎn)變)。實(shí)施例1 在該實(shí)施例的具體實(shí)施方式
中，過(guò)氧化氫酶陰性革蘭氏陽(yáng)性菌可以通過(guò)正鐵血紅 蛋白的產(chǎn)物予以區(qū)分。過(guò)氧化氫酶是將過(guò)氧化氫(其為微生物代謝過(guò)程的常見(jiàn)副產(chǎn)物)轉(zhuǎn) 化為氧分子和水分子的酶。過(guò)氧化氫酶陰性菌缺少這種酶。在臨床實(shí)驗(yàn)室中，最常碰到的過(guò)氧化氫酶陰性菌是腸球菌(屎腸球菌)和鏈球菌(肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)，化膿性鏈 球菌(S. pyogens) (A 群)，無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B 群))。除了解糖葡 萄球菌(S. saccharolyticus)禾口金黃色葡萄球菌厭氧亞禾中(S. aureus subsp. anaerobius) (它們?cè)趨捬鯒l件下生長(zhǎng)更加迅速)外，大部分的葡萄球菌為過(guò)氧化酶陰性。但是，幾乎沒(méi) 有過(guò)氧化氫酶陰性金黃葡萄球菌(CNSA)被報(bào)道適用于免疫抑制的患者(例如，參見(jiàn)Tu and Palutke, 1976 ；Marake et al. ,2005 ；Yilmaz et al.，2005)。缺少酶的一個(gè)主要結(jié)果是在 過(guò)氧化氫酶陰性菌的生長(zhǎng)期間高含量過(guò)氧化氫的產(chǎn)生(參見(jiàn)，Moy et al.，2004)。此外， 大部分的過(guò)氧化氫酶陰性菌具有溶血特性。例如，化膿性鏈球菌是引起紅細(xì)胞部分裂解的 α -溶血鏈球菌，而無(wú)乳鏈球菌和屎腸球菌是引起紅細(xì)胞完全破裂的β -溶血鏈球菌。過(guò)氧化氫是與血紅蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生正鐵血紅蛋白的活性氧之一(例如，參見(jiàn) Dudok et al.，2004)。因此，在血培養(yǎng)物中，由過(guò)氧化氫酶陰性菌產(chǎn)生的過(guò)氧化氫導(dǎo)致形成 大量的正鐵血紅蛋白。這種代謝途徑不同于常見(jiàn)的從氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白的轉(zhuǎn) 變，所述轉(zhuǎn)變對(duì)于大多數(shù)的過(guò)氧化氫酶陰性菌來(lái)說(shuō)是可觀察到的，從而能夠部分識(shí)別過(guò)氧 化氫酶陰性菌。由于正鐵血紅蛋白具有將其與其他形態(tài)的血紅蛋白相區(qū)別的獨(dú)特的光信 號(hào)，所以過(guò)氧化氫酶陰性生物的檢測(cè)可以使用血培養(yǎng)瓶的光學(xué)監(jiān)測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例2 生長(zhǎng)期間由一些微生物釋放的溶酶可以引起紅細(xì)胞溶血，導(dǎo)致將血紅蛋白從細(xì)胞 釋放進(jìn)介質(zhì)。由于紅細(xì)胞的破壞改變了反射光譜和/或透射光譜的光學(xué)特性，所以這種特 性在光學(xué)上可檢測(cè)，并且有助于部分識(shí)別微生物。這種溶血的細(xì)菌可以是屎腸球菌、奇異變 形桿菌(P.mirabilis)、金黃葡萄球菌的一些菌株以及其他類似物。此外，由于α -溶血微 生物只產(chǎn)生部分溶血而β-溶血微生物完全破壞紅細(xì)胞，所以α-溶血微生物和β-溶血 微生物可以相互區(qū)分。試驗(yàn)實(shí)證由微生物生長(zhǎng)引起的血培養(yǎng)物中正鐵血紅蛋白和溶血的產(chǎn)生可以根據(jù)下列涉及 屎腸球菌的示例性血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)予以說(shuō)明。在這些試驗(yàn)中，大約IOml的血液被大約100CFU 的屎腸球菌污染，并且在37°C下通過(guò)連續(xù)攪動(dòng)進(jìn)行培養(yǎng)。每20分鐘進(jìn)行漫反射測(cè)量。圖 40說(shuō)明了在采用屎腸球菌的血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的不同時(shí)間點(diǎn)記錄的四個(gè)選定的漫反射光譜。血 培養(yǎng)物的特征參數(shù)在表6中予以概括，所述特征參數(shù)例如通過(guò)對(duì)反射光譜進(jìn)行數(shù)學(xué)上的 反卷積所估計(jì)的三種形態(tài)血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)以及紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)。
30表6
對(duì)圖40所示的反射光譜反卷積所獲得的血培養(yǎng)物成分的參數(shù)
反卷積得到的血培養(yǎng)物參數(shù)光譜A光譜B光譜C光譜D時(shí)步(hrs)3.09.610.612.3血培養(yǎng)物中散射元的總體積分?jǐn)?shù)0.0570.0540.04600.018紅細(xì)胞中血紅蛋白的體積分?jǐn)?shù)0.350.350.350.35紅細(xì)胞的平均細(xì)胞體積(μιη3)92.092.092.092.0全部血紅蛋白中氧合血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)0.9560.9330.8500.260全部血紅蛋白中脫氧血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)0.0400.0650.1470.310全部血紅蛋白中正鐵血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)0.00040.00180.0030.430裂解的紅細(xì)胞所占分?jǐn)?shù)0.00.050.190.68從圖40和表6可以看出，隨著正鐵血紅蛋白所占分?jǐn)?shù)上升并且紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù) 從光譜A下降至光譜B，然后下降到光譜C和光譜D，反射光譜的形狀和量級(jí)變化顯著。圖41的上面的子圖表示含有屎腸球菌的相同的血液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵的血液培養(yǎng) 參數(shù)隨時(shí)間的演變。在圖41中，實(shí)線和虛線分別表示第一實(shí)驗(yàn)和第二實(shí)驗(yàn)。氧合血紅蛋白 的急劇減少以及脫氧血紅蛋白的急劇增加(在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的大約10小時(shí)明顯可見(jiàn))與之前 對(duì)血培養(yǎng)物中微生物的觀察一致。已經(jīng)表明，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌的濃度達(dá)到每毫升IO7-IO8 個(gè)細(xì)胞。但是，沒(méi)過(guò)多久，出現(xiàn)正鐵血紅蛋白的快速積聚，這是產(chǎn)生ROS的微生物的特性。此 外，圖41的下面的子圖顯示了紅細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)的時(shí)間演變。從圖41可見(jiàn)，在起初的9個(gè) 小時(shí)內(nèi)體積分?jǐn)?shù)保持相對(duì)穩(wěn)定，然后當(dāng)幾乎到達(dá)13至14小時(shí)時(shí)開(kāi)始減少。紅細(xì)胞的這種 完全破裂表明β-溶血微生物的產(chǎn)生。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述教導(dǎo)可以理解，在不脫離本發(fā)明的情況下，上述具體 實(shí)施方式可以進(jìn)行修改和改變。因此可以理解，在權(quán)利要求及其等同變化的范圍內(nèi)，本發(fā)明 可以與所詳述的內(nèi)容不同的方式實(shí)施。
權(quán)利要求
一種評(píng)定血液中微生物存在的方法，該方法包括(a)向至少一種血樣發(fā)射電磁輻射；(b)測(cè)量從所述血樣再射出的電磁輻射的基于波長(zhǎng)的光譜，其中所述測(cè)量為對(duì)透射信號(hào)和反射信號(hào)之一或全部進(jìn)行測(cè)量；然后(c)對(duì)所述光譜反卷積以評(píng)定所述血樣中微生物存在或不存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，根據(jù)血液的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)定量解讀所述光■i並 曰ο
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反卷積確定血液中多種類型的微生物存在或 不存在。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述光譜可以隨時(shí)間測(cè)量，或者在任意離散時(shí)間點(diǎn) 測(cè)量所述光譜。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測(cè)量是對(duì)漫透射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測(cè)量是對(duì)漫反射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測(cè)量是對(duì)角透射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述測(cè)量是對(duì)角反射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述再射出的電磁光譜包括波長(zhǎng)在紫外線區(qū)、可見(jiàn) 光區(qū)和/或近紅外線區(qū)內(nèi)的電磁光譜。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反卷積步驟定量血液成分的物理性質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反卷積步驟(i)包括線性模型或非線性模型 中的至少一種，以及(ii)將所述光譜解析為與微粒相關(guān)的物理特性。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反卷積步驟識(shí)別和定量至少一種形態(tài)的血紅 蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述反卷積(i)包括線性模型或非線性模型中的 至少一種，以及(ii)將所述光譜解析為所述形態(tài)的血紅蛋白。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述評(píng)定包括檢測(cè)微生物存在或不存在。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括通過(guò)所述光譜獲取微生物的識(shí)別特性。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述識(shí)別特性選自動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)參數(shù)和物理特性。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述生長(zhǎng)參數(shù)包括倍增時(shí)間和呼吸速率。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述物理特性包括尺寸和形狀。
19.一種配置成評(píng)定微生物存在的裝置，該裝置包括(a)配置成測(cè)量從血液的樣本射出的多個(gè)波長(zhǎng)的光譜的分光計(jì)；(b)可操作地連接至所述分光計(jì)的透射元件和/或反射探頭；和(c)如下計(jì)算機(jī)(i)該計(jì)算機(jī)操作性地連接至所述分光計(jì)，和(ii)該計(jì)算機(jī)配置成對(duì) 所述光譜執(zhí)行反卷積，從而評(píng)定所述樣本中的微生物存在或不存在。
20.如權(quán)利要求19所述的裝置，其中，所述反卷積(i)包括線性或非線性回歸技術(shù)中的 至少一種，以及(ii)可將所述光譜解析為至少一種形態(tài)的血紅蛋白。
21.如權(quán)利要求19所述的裝置，其中，反射探頭和透射元件中的至少一個(gè)可操作地連 接至所述分光計(jì)。
22.如權(quán)利要求19所述的裝置，其中，所述分光計(jì)包括二極管陣列。
23.如權(quán)利要求21所述的裝置，其中，反射探頭可操作地連接至所述分光計(jì)，并且所述 反射探頭配置成在不與放置所述樣本的容器接觸的情況下工作。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，與氧氣和二氧化碳中的至少一種相關(guān)的分壓值是 通過(guò)反卷積的光譜確定。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，微生物存在或不存在是根據(jù)由一種或一種以上的 微生物代謝產(chǎn)物引起的血液性質(zhì)的變化評(píng)定。
26.一種評(píng)定血液中至少一種微生物存在的方法，該方法包括(a)向封閉容器中的至少一種血樣發(fā)射電磁輻射；(b)測(cè)量從所述血樣再射出的電磁輻射的基于波長(zhǎng)的光譜，其中所述測(cè)量為對(duì)透射信 號(hào)和反射信號(hào)之一或全部進(jìn)行測(cè)量；(c)對(duì)所述光譜反卷積；(d)確定與所述血樣上方頂部空間中的氧氣和二氧化碳中的至少一種相關(guān)的分壓值；和(e)根據(jù)所述分壓值評(píng)定微生物存在或不存在。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，該方法還包括識(shí)別至少一種微生物。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述評(píng)定包括檢測(cè)所述微生物的存在。
29.一種評(píng)定血液中至少一種微生物存在的方法，該方法包括(a)向熱力學(xué)封閉容器中的至少一種血樣發(fā)射電磁輻射；(b)測(cè)量從所述血樣再射出的電磁輻射的基于波長(zhǎng)的光譜以獲得測(cè)量到的光譜值，其 中所述測(cè)量為對(duì)透射信號(hào)和反射信號(hào)之一或全部進(jìn)行測(cè)量；(c)測(cè)量與所述血樣上方頂部空間中的氧氣和二氧化碳中的至少一種相關(guān)的分壓值以 獲得測(cè)量到的分壓值；(d)根據(jù)所述測(cè)量到的光譜值和測(cè)量到的分壓值對(duì)所述光譜反卷積；和(e)根據(jù)所述反卷積評(píng)定微生物存在或不存在。
全文摘要
一種檢測(cè)血液中的微生物的方法，其利用血液的血紅蛋白的變化以及血液的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的變化以檢測(cè)血液中微生物存在。采用分光光度法測(cè)量電磁光譜的紫外線-可見(jiàn)光-近紅外線區(qū)內(nèi)的多個(gè)波長(zhǎng)，并且定量地執(zhí)行反卷積以解讀血液的不同光譜特性，從而能夠檢測(cè)微生物。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101918582SQ200880123837
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者尤利婭·M·謝列布連尼科娃, 德布拉·赫夫曼, 格爾曼·F·勒帕克, 珍妮弗·M·史密斯, 路易斯·H·加西亞-魯比奧 申請(qǐng)人:克拉羅科學(xué)有限責(zé)任公司