從陽(yáng)性血培養(yǎng)中隔離活性微生物的流程與配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方案中提出了一些試劑和方法，利用這些試劑和方法可從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中快速隔離出包括肺炎球菌在內(nèi)的活性微生物細(xì)胞。產(chǎn)生的微生物團(tuán)塊既可用于鑒定，也可用于基于生長(zhǎng)的檢測(cè)方法，例如藥敏試驗(yàn)等。本發(fā)明中所述的緩沖液包含一種基液、一種非離子型清洗劑、一種硫醇，并選擇性地包含氯化銨。這些公開(kāi)的方法提出了一種流程，按照該流程，只需要用一個(gè)樣本制備管和一次離心分離即可從PBC血樣中快速分離和濃縮活性微生物，同時(shí)可以將可能對(duì)鑒定方法產(chǎn)生干擾的哺乳動(dòng)物血細(xì)胞碎片清除。
【專利說(shuō)明】從陽(yáng)性血培養(yǎng)中隔離活性微生物的流程與配方 相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)枮?1/604732, 2012年2月29日提交的專利申請(qǐng) 于申請(qǐng)之日的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用的方式并入。 相關(guān)專利申請(qǐng)
[0002] 本專利申請(qǐng)的標(biāo)的涉及美國(guó)專利號(hào)為13/647, 072, 2012年10月8日提交的美國(guó) 專利申請(qǐng)，該專利申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)枮?1/544, 407, 2011年10月7日提交的專 利申請(qǐng)于申請(qǐng)之日的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用的方式并入。 發(fā)明背景
[0003] 敗血癥是一種嚴(yán)重的疾病，是由宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)感染的過(guò)激反應(yīng)所引起的。它 可以引發(fā)全身性炎癥，導(dǎo)致血流量受損。隨著敗血癥的病程發(fā)展，會(huì)因?yàn)樯眢w器官極度缺乏 氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而造成永久性損傷，并最終導(dǎo)致器官衰竭。如果診斷不當(dāng)或不進(jìn)行治療，心 臟會(huì)變得衰弱并可能發(fā)生感染性休克，導(dǎo)致多個(gè)器官衰竭而死亡。為了檢測(cè)敗血癥患者的 血液中是否存在細(xì)菌或酵母菌，必須進(jìn)行血培養(yǎng)。如果存在微生物（血培養(yǎng)陽(yáng)性（PBC))， 則必須鑒定出這些微生物并確定其對(duì)抗生素的敏感性，以提供適當(dāng)?shù)闹委?。血培養(yǎng)陽(yáng)性的 血樣用于隔離、鑒定和進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)（AST)。微生物鑒定的常用方法有質(zhì)譜法， 包括MALDI-T0F/MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）或基于表型生長(zhǎng)的方法，如 Phoenix?ID〇
[0004] 為了鑒定出微生物，在對(duì)微生物進(jìn)行表型分析和AST檢測(cè)時(shí)，需要從采集的血樣 中的血細(xì)胞或其他物質(zhì)中隔離出完整、有活性的微生物。在通過(guò)質(zhì)譜法鑒定微生物時(shí)，微 生物樣本中應(yīng)完全不含已知會(huì)干擾MALDI-T0F/MS鑒定的物質(zhì)，如血細(xì)胞成分、其他細(xì)胞碎 片和鹽等。此外，微生物樣本的量必須足夠，這樣才能得到可靠的鑒定。表型鑒定法，如 Phoenix? ID等需要完整而有活性的微生物，不含可能對(duì)分析所用的酶底物產(chǎn)生干擾的物 質(zhì)。在進(jìn)行AST檢測(cè)，如Phoenix? AST檢測(cè)時(shí)，微生物樣本中需含有能在分析的過(guò)程中， 在有耐藥性且抗生素存在的情況下生長(zhǎng)，有活性，且沒(méi)有發(fā)生改變的微生物。對(duì)所有方法而 言，重要的是量必須充足，純度必須足夠，因?yàn)闃颖局腥鐢y帶殘留的血液或培養(yǎng)基成分，就 會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成直接干擾，或因微生物濃度（濁度）的誤導(dǎo)性偏大而間接造成干擾。
[0005] 按照目前的技術(shù)，從PBC樣本中隔離出活微生物需要進(jìn)行微生物傳代培養(yǎng)，這一 過(guò)程需要的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)。這就會(huì)造成治療的延遲或采用不正確的抗生素治療。
[0006] 微生物中的某些菌株尤其難以在保持生物體活性的情況下從PBC樣本中隔離，例 如肺炎鏈球菌（S. pneumoniae)。之所以難以隔離，部分原因是肺炎鏈球菌能激活自溶素 (autolysin)，從而使這種微生物的細(xì)胞發(fā)生"自毀"。請(qǐng)參見(jiàn)《用陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的肺炎鏈球 菌抗原檢測(cè)法作為替代方法診斷肺炎球菌菌血癥》（Streptococcus pneumoniae Antigen Test Using Positive Blood Culture Bottles as an Alternative Method To Diagnose Pneumococcal Bacteremia，Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 5, May 2005, p.2510-2512.) -文。目前從敗血癥患者體內(nèi)隔離微生物，包括肺炎球菌的方法需 要用血培養(yǎng)瓶進(jìn)行接種。在得到陽(yáng)性信號(hào)后，一部分PBC樣本被取出進(jìn)行革蘭氏染色， 另一部分用于微生物傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)出的微生物菌落用來(lái)進(jìn)行下游的檢測(cè)，如通過(guò) MALDI-TOF/MS進(jìn)行鑒定，表型鑒定法和AST檢測(cè)等。
[0007] 從PBC樣本中隔離活性微生物的其他技術(shù)通常要采用液體分離法，液體中含有裂 解緩沖液和可使PBC樣本中的血細(xì)胞裂解的清洗劑。在裂解后，可將裂解的血細(xì)胞清除而 保留微生物。然而，使用這些裂解緩沖液往往會(huì)影響、破壞微生物或使其失去活性，造成其 數(shù)量不足，無(wú)法滿足某些基于生長(zhǎng)的鑒定方法，如AST檢測(cè)的要求。
[0008] Bruker公司的Sepsityper?系統(tǒng)是一種無(wú)須對(duì)微生物進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即可通過(guò) MALDI-TOF/MS技術(shù)對(duì)PBC樣本中的微生物進(jìn)行直接檢測(cè)的液體分離方法。此方法采用 十二烷基硫酸鈉（SDS)，通過(guò)離心分離產(chǎn)生微生物團(tuán)塊。雖然S印sityper?法通常支持用 MALDI-TOF/MS技術(shù)來(lái)檢測(cè)微生物團(tuán)塊，但由于這種強(qiáng)烈的清洗劑會(huì)和微生物的細(xì)胞壁之間 發(fā)生相互作用，導(dǎo)致活性不足，無(wú)法進(jìn)行基于生長(zhǎng)的鑒定方法和AST法。
[0009] 在Prod'hom等人于2010年2月17日發(fā)表的《采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí) 間質(zhì)譜技術(shù)從血培養(yǎng)陽(yáng)性團(tuán)塊中進(jìn)行直接細(xì)菌鑒定》(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Direct Bacterial Identification from Positive Blood Culture Pellets"，.Tournal of Clinical Microbiology,Vol. 48,N o. 4, p. 1481-1483 (Februaryl7, 2010)) -文中公開(kāi)了一種對(duì)PBC樣本中的紅細(xì)胞進(jìn)行裂解 的方法，該方法先用氯化銨對(duì)細(xì)菌團(tuán)塊進(jìn)行制備，然后采用MALDI-TOF/MS技術(shù)進(jìn)行分析。 然而,這些方法均不足以在包含肺炎球菌的整個(gè)微生物檢測(cè)板內(nèi)得到可靠的MALDI-TOF/MS 數(shù)據(jù)。此外，沒(méi)有跡象表明這些方法會(huì)使微生物能維持滿足基于生長(zhǎng)的鑒定法和AST檢測(cè) 所要求的足夠活性。
[0010] Hansson等人發(fā)表的《用微流控血樣制備法進(jìn)行敗血癥快速診斷》（Microfluidic Blood Sample Preparation for Rapid Sepsis Diagnostics, KTH Engineering Sciences (2012)) -文建議用清洗劑來(lái)裂解血細(xì)胞，以及用氯化銨選擇性地裂解某些類型 的血細(xì)胞。然而，這篇文章卻只字未提具體采用哪種配方或方法可以從不含干擾物質(zhì)的PBC 血樣中隔離出有活性的微生物并對(duì)同一 PBC血樣進(jìn)行諸如MALDI-TOF/MS鑒定和AST檢測(cè) 的下游檢測(cè)。
[0011] 無(wú)論在M. Drancourt的文章《用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)血 樣中的微生物：一次回顧···》（Detection of Microorganisms in Blood Specimens Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-〇f-flight Mass Spectrometry:A Review, Clinical Microbiology and Infection, 16:1620-1625，（2010))還是Nassif等人 的專利文獻(xiàn)W0 2010/100612中，均描述了從PBC血樣中隔離微生物的方法，包括通過(guò)在一 部分PBC血樣中加入皂苷和/或氯化銨來(lái)清除血樣中的紅細(xì)胞、混合物的離心分離和用水 清洗生成的團(tuán)塊來(lái)清除殘留的血蛋白。然而，這些方法在整個(gè)微生物檢測(cè)板內(nèi)無(wú)法在種一 級(jí)得出一致的微生物鑒定結(jié)果，并且/或者無(wú)法鑒定出肺炎球菌。此外，并無(wú)跡象表明用這 些方法生成的微生物團(tuán)塊的活性足以滿足基于生長(zhǎng)的檢測(cè)方法（如AST等）的要求。
[0012] 因此，需要開(kāi)發(fā)出既能夠從PBC血樣中快速分離出微生物，同時(shí)又能保持這些微 生物的活性的試劑和方法，這樣，那些對(duì)細(xì)胞活性有要求，基于生長(zhǎng)的分析方法，例如AST 檢測(cè)等就變得可行。此外，最好這些試劑和方法能夠用于從包括肺炎球菌在內(nèi)的所有類型 的微生物中隔離出有活性的細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】
簡(jiǎn)述
[0013] 在公開(kāi)的本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中描述了一些可從一份PBC血樣中快速隔離出 包括肺炎球菌在內(nèi)的活性微生物細(xì)胞的試劑和方法。用這些不同的試劑和方法所產(chǎn)生的微 生物團(tuán)塊中完全不含干擾物質(zhì)，可用于多種鑒定方法，如MALDI-T0F/MS、基于生長(zhǎng)的鑒定方 法和AST法。這樣就能快速得出結(jié)果而無(wú)需進(jìn)行微生物的傳代培養(yǎng)。通過(guò)不同的實(shí)施方案 獲得的活性微生物細(xì)胞團(tuán)塊，既可以用于MALDI-T0F/MS等快速鑒定系統(tǒng)的直接接種，也可 通過(guò)傳統(tǒng)或自動(dòng)的系統(tǒng)，如BD?公司的Phoenix?ID/AST系統(tǒng)進(jìn)行ID/AST檢測(cè)（AST)。這 些不同的實(shí)施方案也可應(yīng)用于其他的系統(tǒng)和分子檢測(cè)法，例如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，以及本 領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的其他方法。
[0014] 本專利申請(qǐng)描述了幾種不同的"裂解加清洗"緩沖液，這些緩沖液可在裂解哺乳動(dòng) 物血細(xì)胞并洗去細(xì)胞碎片和其他血液成分的同時(shí)保持微生物的活性。本專利申請(qǐng)所描述的 這些"裂解加清洗"緩沖液中包含一種基液，其組成包括，例如：鹽、蛋白胨和其他可以保護(hù) 微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及裂解試劑，如清洗劑、硫醇和用于將細(xì)胞碎片從哺乳動(dòng)物血細(xì)胞中 去除的氯化銨。
[0015] 本專利申請(qǐng)所描述的從PBC血樣中隔離微生物的方法采用"裂解加清洗"緩沖液快 速產(chǎn)生一個(gè)活性微生物團(tuán)塊，此團(tuán)塊可用于下游的檢測(cè)方法，如MALDI-T0F/MS鑒定和AST 檢測(cè)。這些公開(kāi)的方法提供了一種使用樣本制備管，通過(guò)一個(gè)裂解步驟、一個(gè)清洗步驟以及 僅僅一個(gè)離心分離步驟即可從PBC血樣中快速隔離和濃縮微生物的流程。這些方法可以很 容易地根據(jù)自動(dòng)系統(tǒng)的要求而調(diào)整，無(wú)需為了保持細(xì)胞的活性而進(jìn)行微生物的傳代培養(yǎng)。
[0016] 本專利申請(qǐng)所描述的方法沒(méi)有采用那些會(huì)對(duì)微生物鑒定方法，如質(zhì)譜法或 Phoenix? ID等表型法造成干擾的物質(zhì)。此外，通過(guò)本專利申請(qǐng)所描述的方法從一份PBC血 樣中快速隔離出的活性微生物的量能滿足多項(xiàng)下游分析，如質(zhì)譜法鑒定、表型或基于生長(zhǎng) 的鑒定分析，以及AST檢測(cè)的需要。此外，用本專利申請(qǐng)所描述的方法所制備的樣本可滿足 下游分析對(duì)寬檢測(cè)板微生物鑒定的要求，包括最難以鑒定的微生物，如肺炎球菌。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中則提供了一種試劑盒，其中可包括本專利申請(qǐng)所描述的一種 或多種用于從血樣中隔離活性微生物的"裂解加清洗"緩沖液。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1所示為本文所述的一個(gè)實(shí)施方案中描述的一種方法，該方法可從PBC血樣中 隔離活性微生物。
[0019] 圖2所示為本文所述的一個(gè)實(shí)施方案中描述的一種方法，該方法可從PBC血樣中 隔離活性肺炎球菌。 詳細(xì)說(shuō)明
[0020] 用本文所述的"裂解加清洗"緩沖液從PBC血樣中隔離和提純微生物，可以保持微 生物細(xì)胞的活性，進(jìn)而可保證它們對(duì)基于生長(zhǎng)的檢測(cè)，如AST檢測(cè)的響應(yīng)。本文所述的方法 還能降低血樣中細(xì)胞碎片等其他可能對(duì)多種鑒定方法，如MALDI-T0F/MS和Phoenix?ID等 產(chǎn)生干擾的物質(zhì)的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的緩沖液的配方中將鹽的含量降至最 低水平，以免對(duì)MALDI-T0F/MS鑒定分析技術(shù)產(chǎn)生干擾。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的緩沖液和方法用于革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性 菌或酵母菌的隔離與下游分析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，革蘭氏陽(yáng)性菌除包含肺炎鏈球菌以 夕卜，還包含其他種類的鏈球菌。
[0022] "裂解加清洗"緩沖液
[0023] 本文所述的"裂解加清洗"緩沖液均衡含有多種試劑，可對(duì)微生物和用于裂解血細(xì) 胞的裂解試劑起到穩(wěn)定作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液中包含一種基液，其成分包括鹽、 蛋白胨和其他用于穩(wěn)定微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及非離子型清洗劑、硫醇，還可以包含用于裂 解血樣中的血細(xì)胞的氯化銨。
[0024] 雖然無(wú)意受特定理論的約束，但據(jù)信基液有助于微生物的穩(wěn)定，同時(shí)裂解試劑可 裂解血細(xì)胞并清除干擾性的細(xì)胞碎片。本文所述的"裂解加清洗"緩沖液對(duì)多種獨(dú)立作用 的裂解機(jī)制有促進(jìn)作用：水（滲透裂解）、清洗劑（膜溶解）、硫醇（破壞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)之間 的相互作用）和氯化銨（氯化銨基本上可通過(guò)紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，而細(xì)胞發(fā)生裂解的原因是 膜的膠體成分的滲透壓不平衡）。將多種裂解試劑結(jié)合起來(lái)，可以減輕每種裂解試劑對(duì)微生 物的作用強(qiáng)度，并能以比分開(kāi)使用更短的時(shí)間使用。
[0025] 基液的成分可以包含一種微生物營(yíng)養(yǎng)肉汁、一種等滲緩沖液、多種蛋白胨和/或 鹽類。該營(yíng)養(yǎng)肉汁可以采用Trypticase?大豆肉汁等。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，該營(yíng)養(yǎng) 肉汁在"裂解加清洗"緩沖液中的濃度約為10克/升至50克/升。等滲緩沖液是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所公認(rèn)的與全血樣本相容的臨床緩沖液。這類緩沖液通常是磷酸鈉、磷酸鉀和鹽 溶液，如氯化鈉或磷酸鹽緩沖的鹽溶液的混合液。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，該等滲緩沖液 的濃度約為1克/升至85克/升。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，該等滲緩沖液是一種磷酸 鹽緩沖夜。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。按照設(shè)想，基液的 其他成分包括丙酮酸鈉、酵母提取物、檸檬酸鈉、肉蛋白胨和/或右旋葡萄糖等。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種"裂解加清洗"緩沖液可以包含一種非離子型清洗劑或 非離子型清洗劑的混合液。在該實(shí)施方案中，在"裂解加清洗"緩沖液中至少有一種非離子 型清洗劑是非離子型溶血性清洗劑，該清洗劑可以選擇性地裂解血細(xì)胞，但不會(huì)裂解微生 物。設(shè)想的示例型非離子型溶血性清洗劑包括Triton? X-100和皂苷。其他非離子型清洗 劑可以包含'Tween?系列、Brij?:系列、辛基-b-葡萄糖苷、Tergitol?.系列、MEGA系列（包括 N-辛?；?N-甲基葡萄糖胺、N-壬?；?、N-癸?；?、PLUR0NIC?系列，如F-68、毛地黃 阜苷（digitonins)，和CHAP系列等。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，該非離子型清洗劑在"裂 解加清洗"緩沖液中的濃度約為〇. 01克/升至20克/升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解 加清洗"緩沖液含有Triton? X-100,濃度約為6. 7克/升。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液含有Triton? X-100。Triton? X-100 的濃度按照能保持肺炎球菌活性的要求來(lái)選擇。示例性實(shí)施方案所設(shè)想的Triton? X-100 濃度最高為1克/升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液含有Triton? X-100， 濃度約為〇. 335克/升。在又一個(gè)實(shí)施方案中，"裂解加清洗"緩沖液中Triton? X-100的 濃度為：約〇. 1克/升至約1克/升、約〇. 1克/升至約〇. 9克/升、約0. 1克/升至約0. 8 克/升、約0. 1克/升至約0. 7克/升、約0. 1克/升至約0. 6克/升、約0. 1克/升至約 〇. 5克/升、約0. 1克/升至約0. 4克/升、約0. 2克/升至約1克/升、約0. 3克/升至 約1克/升、約〇. 2克/升至約0. 9克/升、約0. 2克/升至約0. 8克/升、約0. 2克/升 至約0. 7克/升、約0. 2克/升至約0. 6克/升、約0. 2克/升至約0. 5克/升、約0. 2克 /升至約0. 4克/升、約0. 3克/升至約0. 9克/升、約0. 3克/升至約0. 8克/升、約0. 3 克/升至約0. 7克/升、約0. 3克/升至約0. 6克/升、約0. 3克/升至約0. 5克/升、或 約〇. 3克/升至約0. 4克/升。"裂解加清洗"緩沖液含有能夠保持肺炎球菌活性并具有某 一濃度的Triton? X-100，也可用來(lái)從肺炎球菌以外的生物體內(nèi)隔離出活性微生物細(xì)胞，并 不需要對(duì)這些其他生物體使用不同的"裂解加清洗"緩沖液。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液可以選擇含有氯化銨。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，氯化銨在"裂解加清洗"緩沖液中的濃度約為〇. 01克/升至80克/升。
[0029] 雖然 申請(qǐng)人:無(wú)意受某種特定理論的約束，但加入氯化銨或其他裂解性成分有助于 減輕"裂解加清洗"緩沖液中其他裂解性成分對(duì)微生物活性的影響。在加入各種裂解試劑 時(shí)，為了能裂解PBC血樣中的血細(xì)胞，需要加入足夠的量。這樣往往會(huì)導(dǎo)致微生物細(xì)胞的死 亡，而這是不希望出現(xiàn)的結(jié)果。用清洗劑、硫醇和氯化銨裂解血細(xì)胞時(shí)，其作用機(jī)理不同。 如果一種"裂解加清洗"緩沖液能結(jié)合多種裂解機(jī)理，各種不同的裂解成分的用量就可以減 少。這樣就可能減輕裂解微生物細(xì)胞這種負(fù)效應(yīng)，但仍足以裂解血細(xì)胞，這樣就能比單獨(dú)使 用任何一種裂解成分更有效地裂解血細(xì)胞。因此，可以在保持微生物細(xì)胞活性的同時(shí)消除 不希望存在的血細(xì)胞成分。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液包含一種基液，該基液包含磷酸鹽緩 沖的鹽溶液、酵母提取物、檸檬酸鈉、肉蛋白胨、右旋葡萄糖、丙酮酸鈉、包含巰基乙酸鈉和 L-鹽酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非離子型清洗劑，并選擇性地包含 PBS。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液包含一種基液，該基液包含 Trypticase?大豆肉汁、酵母提取物、檸檬酸鈉、肉蛋白胨、丙酮酸鈉、包含巰基乙酸鈉和 L-鹽酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非離子型清洗劑。
[0032] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液包含一種基液，該基液包含 Trypticase?大豆肉汁、包含巰基乙酸鈉和L-鹽酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非離子型清洗劑。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述"裂解加清洗"緩沖液包含：一種酪蛋白胨的濃度為約8 克/升至約35克/升、氯化鈉濃度為約2克/升至約10克/升、大豆蛋白胨濃度為約1. 5 克/升至15克/升和磷酸鉀濃度為約0. 5克/升至約5克/升的基液；一種半胱氨酸的 濃度為約〇. 01克/升至2. 5克/升和巰基乙酸鈉濃度為約0. 01克/升至2. 5克/升的硫 醇；和一種皂苷的濃度為約0. 01克/升至約10克/升及Triton? X-100濃度為約0. 01克 /升至約20克/升的非離子型清洗劑。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述"裂解加清洗"緩沖液包含：一種酪蛋白胨的濃度為約8 克/升至約35克/升、氯化鈉的濃度為約2克/升至約10克/升、大豆蛋白胨的濃度為約 1. 5克/升至15克/升和磷酸鉀的濃度為約0. 5克/升至約5克/升的基液；一種半胱氨 酸的濃度為約〇. 01克/升至2. 5克/升和巰基乙酸鈉的濃度為約0. 01克/升至2. 5克/ 升的硫醇；和一種皂苷的濃度為約〇. 01克/升至約10克/升及Triton? X-100的濃度為 約〇. 01克/升至約80克/升的非離子型清洗劑；和濃度為約0. 01克/升至約80克/升 的氯化銨。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇在該"裂解加清洗"緩沖液中加入一種消泡劑，以便 于生產(chǎn)。該消泡劑最好對(duì)"裂解加清洗"緩沖液的性能沒(méi)有明顯的影響。由于消泡劑已為 本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知，這里就不再詳細(xì)描述了。對(duì)發(fā)泡劑及其用量的選擇在很大程 度上屬于設(shè)計(jì)選擇，考慮到本文所述對(duì)"裂解加清洗"緩沖液的要求，這完全屬于本領(lǐng)域技 術(shù)人員能力范圍內(nèi)的事。在一個(gè)實(shí)施方案中，該消泡劑在"裂解加清洗"緩沖液中的濃度為 〇. 1克/升。
[0036] 本文所述"裂解加清洗"緩沖液中各種組分的含量指各種組分在"裂解加清洗"緩 沖液中的最終含量。通常PBC血樣和"裂解加清洗"緩沖液以1:1的體積比混合，也可考慮 其他的體積比。"裂解加清洗"緩沖液中各組分的濃度可根據(jù)"裂解加清洗"緩沖液和PBC血 樣之間體積比的變化而進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，以便在和PBC血樣混合后，"裂解加清洗"緩沖液 中各組分能達(dá)到期望的濃度。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液含有皂苷和Triton? X-100,但不含 消泡劑。雖然不想被理論所束縛，但和在"裂解加清洗"緩沖液中單純使用皂苷一種非離子 型清洗劑相比，用皂苷和Triton? X-100相結(jié)合能使處理后的PBC血樣中的泡沫大大減少。 這種減少泡沫的作用能夠改善作業(yè)流程，更便于清除離心分離后的上清液，從而減少或完 全不需要使用消泡劑（即硅樹(shù)脂液）。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該"裂解加清洗"緩沖液中包含一種含膽堿的溶液，例如在美 國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?3/647,072的專利中所述的含膽堿溶液，該專利的內(nèi)容在此通過(guò)引用全 部并入本文。雖然 申請(qǐng)人:無(wú)意受某種特定理論的約束，但在"裂解加清洗"緩沖液加入含氮 堿溶液，由于在"裂解加清洗"緩沖液中有裂解性成分的存在，可抑制、防止和/或減輕微生 物的自溶，特別是肺炎球菌。
[0039] 在另一個(gè)實(shí)施方案中則提供了一種試劑盒，其中可包括本專利申請(qǐng)所描述的一種 或多種用于從PBC血樣中隔離活性微生物的"裂解加清洗"緩沖液。
[0040] 從PBC血樣中隔離微生物的方法
[0041] 從懷疑至少含有一種微生物的樣本，例如本專利申請(qǐng)所描述的PBC血樣中隔離微 生物的方法采用"裂解加清洗"緩沖液，該緩沖液按照設(shè)想可以快速產(chǎn)生一個(gè)活性微生物團(tuán) 塊，此團(tuán)塊可用于下游的檢測(cè)方法，如MALDI-T0F/MS鑒定和AST檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該方法包含在該"裂解加清洗"緩沖液中加入一部分PBC血樣，以形成一種混合物。在一個(gè) 實(shí)施方案中，PBC血樣與"裂解加清洗"緩沖液的體積比為1:1。對(duì)該混合物進(jìn)行了一段時(shí) 間的溫育，以裂解PBC血樣中的血細(xì)胞。
[0042] 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，與該P(yáng)BC血樣混合的"裂解加清洗"緩沖液中至少含有 一種非離子型清洗劑，該清洗劑的濃度約為〇. 01克/升至20克/升。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，該"裂解加清洗"緩沖液含有Triton? X-100,濃度約為6.7克/升。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，該"裂解加清洗"緩沖液中Triton? X-100的濃度為約1克/升。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，該"裂解加清洗"緩沖液中Triton? X-100的濃度約為0. 335克/升。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，該"裂解加清洗"緩沖液中Triton? X-100的含量范圍是：約0. 1克/升至約1克/ 升、約〇. 1克/升至約〇. 9克/升、約0. 1克/升至約0. 8克/升、約0. 1克/升至約0. 7 克/升、約0. 1克/升至約0. 6克/升、約0. 1克/升至約0. 5克/升、約0. 1克/升至約 〇. 4克/升、約0. 2克/升至約1克/升、約0. 3克/升至約1克/升、約0. 2克/升至約 0. 9克/升、約0. 2克/升至約0. 8克/升、約0. 2克/升至約0. 7克/升、約0. 2克/升 至約0. 6克/升、約0. 2克/升至約0. 5克/升、約0. 2克/升至約0. 4克/升、約0. 3克 /升至約0. 9克/升、約0. 3克/升至約0. 8克/升、約0. 3克/升至約0. 7克/升、約0. 3 克/升至約0. 6克/升、約0. 3克/升至約0. 5克/升、或約0. 3克/升至約0. 4克/升。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在將一部分PBC血樣與"裂解加清洗"緩沖液混合而制備混合 物后，對(duì)該混合物進(jìn)行不超過(guò)約5分鐘的溫育。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該混合物在溫育過(guò)程 中被上下顛倒幾次，以保證PBC血樣和"裂解加清洗"緩沖液能均勻混合。在溫育后，通過(guò)對(duì) 該混合物進(jìn)行濃縮形成一個(gè)團(tuán)塊，該團(tuán)塊含活性微生物和一種含血細(xì)胞碎片的上清液?？?對(duì)離心分離的加速度和時(shí)間范圍進(jìn)行優(yōu)化，以得到一個(gè)易于辨別的團(tuán)塊，以便在不影響該 團(tuán)快的情況下清除該上清液。有各種變量會(huì)影響離心分離的加速度和時(shí)間，例如混合物的 體積、樣本試管的尺寸和形狀和轉(zhuǎn)子的類型等。在一個(gè)實(shí)施方案中，以l〇〇g至5000g的加 速度對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離的時(shí)間為 小于或等于10分鐘。
[0044] 在離心分離后，上清液被丟棄，同時(shí)用另外一份"裂解加清洗"緩沖液清洗該團(tuán)塊。 在清洗步驟中使用的"裂解加清洗"緩沖液可以和在裂解步驟中用于裂解血細(xì)胞的"裂解加 清洗"緩沖液的配方相同，也可不同。在清洗了該團(tuán)塊后，對(duì)該混合物進(jìn)行再次離心分離。 含有血細(xì)胞碎片的上清液被再次丟棄，而含有活性微生物的團(tuán)塊則被保留?？蓪F(tuán)塊頂部 的微量溶液清除。最后，可將該團(tuán)塊再次懸浮在一種溶液中，以用于下游分析。在一個(gè)實(shí)施 方案中，該團(tuán)塊被懸浮在一種濃度至少為約4麥克法蘭（McFarland)的溶液中。
[0045] 本文所述各實(shí)施方案中生成的活性微生物團(tuán)塊可用于制取下游各種檢測(cè)方法所 共用的樣本，這些監(jiān)測(cè)方法包括質(zhì)譜鑒定法，例如MALDI-T0F/MS鑒定、基于生長(zhǎng)的表型鑒 定，和Phoenix? ID和AST檢測(cè)，如Phoenix? AST檢測(cè)。此外，整個(gè)方法可在一個(gè)樣本試管 中實(shí)現(xiàn)，無(wú)需將樣本在多個(gè)試管之間轉(zhuǎn)移。因此，本專利中所述的方法可以很容易地根據(jù)自 動(dòng)系統(tǒng)的要求而調(diào)整。
[0046] 可采用本專利中所述的多種方法，如提高PBC血樣的體積、采用多等份的PBC血 樣、多重旋轉(zhuǎn)等，來(lái)增加初始用量中微生物的數(shù)量，以提高產(chǎn)量。此外，用這些方法還可以迅 速制備樣本，并且便于自動(dòng)化。此外，本專利中所述的方法和緩沖液可以裂解血細(xì)胞、從PBC 血樣中清除干擾物并提供高產(chǎn)量的活性微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)增加 PBC血樣 的初始用量和/或從PBC血樣中取出多個(gè)等份進(jìn)行隔離，然后將生成的微生物團(tuán)塊結(jié)合成 一個(gè)樣本的方法來(lái)提高活性微生物團(tuán)塊的產(chǎn)量。
[0047] 圖1所不為本文所述方法的一個(gè)實(shí)施方案。將一份PBC血樣，如5毫升血樣轉(zhuǎn)移 到（100) -個(gè)樣本試管中。在該P(yáng)BC血樣中加入一定量，如5毫升的"裂解加清洗"緩沖液 (105)中進(jìn)行混合（110)，例如混合5分鐘。對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離（115)，例如在2200g 的加速度下分離10分鐘，得到含活性微生物的團(tuán)塊A和含血細(xì)胞碎片的上清液A。上清液A 被倒出并丟棄（120)而團(tuán)塊A則被保留（125)。在團(tuán)塊A中加入另一份，如5毫升的"裂解 加清洗"緩沖液（130)，重新使該團(tuán)塊懸浮。重新懸浮的團(tuán)塊A在混合（135)后生成第二份 混合物。對(duì)第二份混合物進(jìn)行離心分離（140)，例如在2200g的加速度下分離10分鐘，得到 含活性微生物的團(tuán)塊B和含有第一步離心分離時(shí)未能清除的血細(xì)胞碎片的上清液B (115)。 上清液B被倒出并丟棄（145)而團(tuán)塊B則被保留（150)。團(tuán)塊B的至少一部分被懸?。?55) 在一種溶液中，例如600升的無(wú)菌去離子水中，生成一種稠密的微生物懸浮液，例如可生成 一種濃度約4麥克法蘭（McFarland)的懸浮液。生成的微生物懸浮液可用于各種下游檢測(cè) 方法（160)，例如MALDI/TOF-MS鑒定，和基于生長(zhǎng)的表型鑒定，例如使用Phoenix?系統(tǒng)的 鑒定，和基于生長(zhǎng)的AST方法，例如Phoenix? AST檢測(cè)。
[0048] 在本文所述的這些活性微生物隔離方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在PBC血樣與"裂解 加清洗"緩沖液混合之前或同時(shí)，先和一種膽堿溶液混合進(jìn)行溫育，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?13/647, 072的專利中所述，該專利的內(nèi)容在此通過(guò)引用已全部并入本文。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方案中描述了多種可從PBC血樣中隔離活性肺炎球菌的方法。這些 方法中包括獲得一份懷疑含有至少一種微生物的血樣。將該血樣的一部分加入一個(gè)厭氧血 培養(yǎng)瓶，并將該血樣的另一部分加入一個(gè)需氧血培養(yǎng)瓶。這兩個(gè)培養(yǎng)瓶被溫育至得到陽(yáng)性 信號(hào)為止。在把一部分需氧PBC血樣和本文所述的"裂解加清洗"緩沖液混合后形成一種混 合物，對(duì)該混合物進(jìn)行一段時(shí)間的溫育以裂解血細(xì)胞，并對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離以生成 一個(gè)團(tuán)塊后，可以獲得該血樣中存在肺炎球菌的早期跡象。團(tuán)塊如果呈綠色，即可視為血樣 中存在肺炎球菌的早期跡象。通過(guò)目測(cè)觀察需氧陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中是否存在一種綠色溶液， 也可獲得血樣中是否存在肺炎球菌的早期跡象。
[0050] 在獲得肺炎球菌存在的早期跡象后，該厭氧PBC血樣可以用于隔離活性肺炎球 菌，從而通過(guò)本文所述的方法進(jìn)行下游分析，以隔離出活性微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該 方法包含在本文所述的"裂解加清洗"緩沖液中加入一部分厭氧PBC血樣，以形成一種混合 物。對(duì)該混合物進(jìn)行了一段時(shí)間的溫育，以裂解PBC血樣中的血細(xì)胞。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，隔離活性肺炎球菌的方法包括采用一種含Triton? X-100的" 裂解加清洗"緩沖液。Triton? X-100的濃度按照能保持肺炎球菌的活性來(lái)選擇。設(shè)想的 濃度不超過(guò)約1克/升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，隔離活性肺炎球菌的方法包括采用一種含 Triton? X-100約0. 335克/升的"裂解加清洗"緩沖液。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在將一部分PBC血樣與"裂解加清洗"緩沖液混合而制備混合 物后，對(duì)該混合物進(jìn)行不超過(guò)約5分鐘的溫育。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該混合物在溫育過(guò)程 中被上下顛倒幾次，以保證PBC血樣和"裂解加清洗"緩沖液能均勻混合。在溫育后，通過(guò) 對(duì)該混合物進(jìn)行濃縮形成一個(gè)團(tuán)塊，該團(tuán)塊含活性微生物和一種含血細(xì)胞碎片的上清液。
[0053] 在離心分離后，上清液被丟棄，同時(shí)用另外一份"裂解加清洗"緩沖液清洗含肺炎 球菌的該團(tuán)塊。在清洗步驟中使用的"裂解加清洗"緩沖液可以和在裂解步驟中用于裂解 血細(xì)胞的"裂解加清洗"緩沖液的配方相同，也可不同。在清洗了該團(tuán)塊后，對(duì)該混合物進(jìn) 行再次離心分離。含有血細(xì)胞碎片的上清液被再次丟棄，而含有肺炎球菌的團(tuán)塊則被保留。 最后，可將該團(tuán)塊再次懸浮在一種溶液中，以用于下游分析。
[0054] 這種從PBC血樣中隔離活性肺炎球菌的方法的一個(gè)實(shí)施方案如圖2所示?？色@得 一份懸浮有肺炎球菌的血樣（200)。將該血樣的一部分（例如10毫升）加入（205) -個(gè)厭 氧血培養(yǎng)瓶，并將該血樣的另一部分（例如10毫升）加入（210) -個(gè)需氧血培養(yǎng)瓶。如果 厭氧和需氧PBC瓶?jī)?nèi)均得到陽(yáng)性信號(hào)（215)，則表明存在一種微生物。將一份厭氧PBC血 樣，如5毫升血樣轉(zhuǎn)移到（220) -個(gè)試管中。在該P(yáng)BC血樣中加入一份，例如5毫升本文所 述的"裂解加清洗"緩沖液，形成一種混合物，該緩沖液含有為保持肺炎球菌的活性而選定 濃度，如〇. 335克/升的Triton? X-100。對(duì)該混合液進(jìn)行一段時(shí)間（例如5分鐘）的溫育 (230)，以裂解其中的血細(xì)胞。然后對(duì)該混合液進(jìn)行離心分離（235)，產(chǎn)生一個(gè)綠色團(tuán)塊，這 即可視為血樣中存在肺炎球菌的早期跡象（240)。獲得肺炎球菌存在的早期跡象后（240)， 制備一份該厭氧PBC血樣（245)，通過(guò)本文所述的任何方法進(jìn)行下游分析，以從PBC血樣中 隔離出活性微生物，包括，例如，按照?qǐng)D1中所述的方法，使用含有Triton? X-100的"裂解 加清洗"緩沖液，Triton? X-100的濃度為保持肺炎球菌的活性而選定，如0. 335克/升。
[0055] 實(shí)施例
[0056] 實(shí)施例1
[0057] 在血培養(yǎng)瓶中接種產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048)或金黃色葡萄球菌（ATCC 43300MRSA)，并溫育至出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)為止，獲得陽(yáng)性血培養(yǎng)（PBC)樣本。將該P(yáng)BC血樣的一 部分（5毫升）從瓶中直接取出后加入一個(gè)15毫升的錐形管。在該P(yáng)BC血樣中加入氯化膽堿 (〇. 5毫升的20 %氯化膽堿溶液），在室溫下溫育20分鐘后，用Beckman J6-MI離心機(jī)和一 個(gè)JS-4. 2轉(zhuǎn)子，在132g的加速度下進(jìn)行5分鐘的離心分離。將上清液加入另一個(gè)15毫升 的錐形管，并與5毫升含16克/升氯化銨、6. 7克/升Triton? X-100和BD Bactec Lytic 1〇(目錄號(hào)：442265)的"裂解加清洗"緩沖液混合。在室溫下對(duì)混合物進(jìn)行5分鐘的溫育。 然后將裂解的樣本在1855g的加速度下進(jìn)行10分鐘的離心分離。在清除上清液后，將留下 的團(tuán)塊懸浮在4.5毫升BD Phoenix? ID肉汁（目錄號(hào)：246001)中。將一部分回收的微生 物用來(lái)通過(guò)平板測(cè)數(shù)法確定微生物的活性。平板測(cè)數(shù)法的活性測(cè)定結(jié)果表明，裂解后的產(chǎn) 氣腸桿菌濃度為1.85x 109cfu/毫升，而裂解之前在PBC血樣中的含量為1.65x 109cfu/毫 升。活性測(cè)定結(jié)果還表明，裂解后的金黃色葡萄球菌濃度為1.25x 108cfu/毫升，而裂解之 前在PBC血樣中的含量為2. 00x 108cfu/毫升。
[0058] 用BD Phoenix? ID肉汁將另一份回收的細(xì)菌懸浮液進(jìn)一步稀釋至濃度為0. 5麥 克法蘭（McFarland)，用于 Phoenix? ID/AST 檢測(cè)。BD Phoenix? ID/AST 系統(tǒng)如美國(guó)專利 號(hào)為 5, 922, 593、6, 096, 272、6, 372, 485、6, 849, 422、和 7, 115, 384 的專利所述，這些專利的 內(nèi)容在此通過(guò)引用已全部并入本文。將上述接種的菌劑一部分通過(guò)Phoenix? ID用于表型 鑒定，將其倒入BD Phoenix? ID/AST檢測(cè)板的鑒定部分（碧迪公司）并用一個(gè)塑料蓋密封。 將上述接種的菌劑的另一部分通過(guò)Phoenix? AST用于AST檢測(cè)，將其倒入BD Phoenix?ID/ AST檢測(cè)板的AST部分（碧迪公司）并用一個(gè)塑料蓋密封。為每個(gè)隔離出的微生物團(tuán)塊計(jì) 算一系列抗生素的抗菌藥物敏感性最小抑菌濃度（MIC)。將微生物團(tuán)塊的MIC結(jié)果與用相 同菌株的平板純培養(yǎng)物（"對(duì)照"）的MIC結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。對(duì)比后可看出檢測(cè)方法所得出的 結(jié)果是否與對(duì)照方法實(shí)質(zhì)上等同，即測(cè)定測(cè)試方法和對(duì)照方法之間的基本一致率（EA)。如 果稀釋差（dilution difference)為0,表明檢測(cè)方法和對(duì)照方法完全一致。稀釋差為-1或 1表明檢測(cè)方法被視為屬于對(duì)照方法的基本一致率范圍內(nèi)，也即在試驗(yàn)的正常誤差范圍內(nèi)。 稀釋差如果超出此范圍，例如 _4、+4、_3、+3、_2、和+2等，則表明結(jié)果不在抗生素/微生物 測(cè)試的基本一致范圍內(nèi)。AST結(jié)果的方法和驗(yàn)證的詳細(xì)描述見(jiàn)《臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室程序的 驗(yàn)證與確認(rèn)》（ASM Press，1997 年 2 月）（"Verification and Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory，'，Cumitech 31, (Feb. 1997, ASM Press)) 一 文。
[0059] 從兩份PBC血樣中回收的細(xì)菌的Phoenix?鑒定結(jié)果均正確，均鑒定為產(chǎn)氣腸桿菌 和金黃色葡萄球菌，兩份血樣的置信度均為99%。Phoenix? AST檢測(cè)的結(jié)果表明與從板上 菌落中制備的樣本相比，一致率（EA)為100%，即稀釋差在-1到+1的稀釋差范圍內(nèi)。金黃 色葡萄球菌的AST檢測(cè)結(jié)果包括正確鑒定出該MRSA菌株應(yīng)有的四（4)個(gè)耐性因子，包括耐 甲氧西林葡萄球菌（MRS)、mecA介導(dǎo)的耐藥葡萄球菌（mecA)、產(chǎn)生β -內(nèi)酰胺酶的葡萄球 菌的 MLSb 顯型（STAMLS)。
[0060] 這些結(jié)果表明，本文所述的"裂解加清洗"緩沖液可用于從PBC血樣中隔離出活性 微生物，用于下游鑒定和AST檢測(cè)。
[0061] 實(shí)施例2
[0062] 通過(guò)在血培養(yǎng)瓶中接種屎腸球菌（ATTC 700221)、糞腸球菌（ATCC 51299)、金黃 色葡萄球菌（ATCC 43300)或奇異變形桿菌（ATCC 29906)獲得四種陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本。制備 四種不同的"裂解加清洗"緩沖液，其配方的匯總見(jiàn)下方表1。 表1:

【權(quán)利要求】
1. 一種用于從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中隔離和濃縮活性微生物的緩沖液，該緩沖液包含一種 基液、至少一種非離子型清洗劑、至少一種硫醇，并且選擇性地包含氯化銨，其中所述緩沖 液中基液、至少一種非離子型清洗劑、至少一種硫醇的含量是根據(jù)保持肺炎球菌的活性的 要求而選擇的。
2. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種非離子型清洗劑包含Triton X-100，其在所述緩沖液中的濃度不超過(guò)約1克/升。
3. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種非離子型清洗劑包含Triton X-100，其在所述緩沖液中的濃度約為0. 335克/升。
4. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述的基液包含從由一種營(yíng)養(yǎng)肉汁、一種等滲緩 沖液、一種蛋白胨和一種鹽溶液的一組物質(zhì)中所選出的至少一種。
5. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中所述緩沖液中的營(yíng)養(yǎng)肉汁濃度為約10克/升至 50克/升。
6. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中所述營(yíng)養(yǎng)肉汁含有胰蛋白胨大豆肉汁。
7. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中所述的等滲緩沖液包含從由磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸 鹽緩沖的鹽溶液和鹽溶液組成的一組物質(zhì)中選出的至少一種。
8. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中緩沖液中等滲緩沖液的濃度為約1克/升至20克 /升。
9. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中所述的蛋白胨從一組包含酪蛋白胨和大豆蛋白胨 的蛋白胨中選出。
10. 如權(quán)利要求4所述的緩沖液，其中所述的基液包含從由丙酮酸鈉、酵母提取物、檸 檬酸鈉、肉蛋白胨、右旋葡萄糖和磷酸鹽緩沖的鹽溶液組成的一組物質(zhì)中選出的至少一種。
11. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種非離子型清洗劑從由Triton系列 清洗劑、皂苷、Bri j系列清洗劑、辛基-b-葡糖苷、Tergitol系列清洗劑、CYMAL系列清洗劑、 MEGA系列清洗劑、PLUR0NIC系列清洗劑和CHAP系列清洗劑所組成的一組清洗劑中選出。
12. 如權(quán)利要求2所述的緩沖液，進(jìn)一步包括至少另一種非離子型清洗劑，該清洗劑在 所述緩沖液中的濃度為約〇. 01克/升至20克/升。
13. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種硫醇從由L-鹽酸半胱氨酸、巰基乙 酸鈉、巰基乙胺、巰基丁二酸、巰基乙醇、巰基乙磺酸和硫代甘油組成的一組物質(zhì)中選出。
14. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種硫醇在所述緩沖液中的濃度為約 0.005克/升至4克/升。
15. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，該緩沖液進(jìn)一步含有氯化銨。
16. 如權(quán)利要求15所述的緩沖液，其中氯化銨在緩沖液中的濃度為約0. 01克/升至 80克/升。
17. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述的基液包含磷酸鹽緩沖的鹽溶液、酵母提取 物、檸檬酸鈉、肉蛋白胨、右旋葡萄糖和丙酮酸鈉； 所述至少一種硫醇包含L-鹽酸半胱氨酸和巰基乙酸鈉；且 所述至少一種非離子型清洗劑包含皂苷和TritonX-100。
18. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述的基液包含胰蛋白胨大豆肉汁、酵母提取 物、檸檬酸鈉、肉蛋白胨和丙酮酸鈉； 所述至少一種硫醇包含L-鹽酸半胱氨酸和巰基乙酸鈉；且 所述至少一種非離子型清洗劑包含皂苷和TritonX-100。
19. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述基液包含胰蛋白胨大豆肉汁； 所述至少一種硫醇包含L-鹽酸半胱氨酸和巰基乙酸鈉；且 所述至少一種非離子型清洗劑包含皂苷和TritonX-100。
20. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述基液包含：酪蛋白胨，其在所述緩沖液中的 濃度為約8克/升至約35克/升、氯化鈉，其在所述緩沖液中的濃度為約2克/升至10克 /升、大豆蛋白胨，其在所述緩沖液中的濃度為約1. 5克/至15克/升和磷酸鉀，其在所述 緩沖液中的濃度為約〇. 5克至約5克/升； 所述至少一種硫醇包含：半胱氨酸，其在所述緩沖液中的濃度為約0. 01克/升至約 2. 5克/升和巰基乙酸鈉，其在所述緩沖液中的濃度為約0. 01克/升至約2. 5克/升； 所述至少一種非離子型清洗劑包含：皂苷，其在所述緩沖液中的濃度為約0. 01克/升 至約10克/升和Triton X-100,其在所述緩沖液中的濃度為約0. 01克/升至約20克/ 升；且 所述選擇性含有的氯化銨，如果含有，其在所述緩沖液中的濃度為約〇. 01克/升至約 80克/升。
21. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，該緩沖液進(jìn)一步含有一種消泡劑。
22. 如權(quán)利要求1所述的緩沖液，其中所述至少一種非離子型清洗劑為皂苷和Triton X-100的混合物，且所述緩沖液不含消泡劑。
23. -種關(guān)于從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中隔離和濃縮活性有機(jī)物的方法，包括： 將一種陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的一部分與如權(quán)利要求1所述的緩沖液混合后形成一種混合 物，其中所述緩沖液的量和陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的量之比能保證將細(xì)胞裂解，同時(shí)又能夠保持 所述陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中微生物的活性； 可以選擇對(duì)所述混合物進(jìn)行溫育； 對(duì)所述混合物進(jìn)行離心分離，產(chǎn)生一個(gè)團(tuán)塊和上清液； 將所述上清液丟棄，同時(shí)保留所述團(tuán)塊； 用所述緩沖液使團(tuán)塊再次懸浮，生成一種團(tuán)塊的懸浮液； 對(duì)所述團(tuán)塊的懸浮液進(jìn)行離心分離，再次產(chǎn)生上清液和第二個(gè)團(tuán)塊； 將再次產(chǎn)生的上清液丟棄，同時(shí)保留含有活性微生物的第二個(gè)團(tuán)塊。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述部分陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本和等量的緩沖液混合， 形成所述的混合物。
25. 如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包含將第二個(gè)團(tuán)塊用一種溶液進(jìn)行再次懸浮， 并對(duì)第二個(gè)團(tuán)塊的懸浮液進(jìn)行至少一次下游檢測(cè)，所述至少一次檢測(cè)從包含：質(zhì)譜法鑒定 微生物、表型鑒定、藥敏試驗(yàn)和分子檢測(cè)的一組檢測(cè)中選擇。
26. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述微生物從包含：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性 細(xì)菌和酵母菌的一組微生物中選擇。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為肺炎鏈球菌。
28. -種關(guān)于從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中隔離和濃縮活性肺炎鏈球菌的方法，包括： 獲得一份懷疑含有至少一種微生物的血樣； 將該血樣的一部分加入一個(gè)厭氧血培養(yǎng)瓶，并將該血樣的另一部分加入一個(gè)需氧血培 養(yǎng)瓶； 從厭氧和需氧血培養(yǎng)瓶中獲得陽(yáng)性信號(hào)； 獲得肺炎鏈球菌在所述血樣中存在的早期跡象，做法是將一部分需氧陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本 與如權(quán)利要求1所述的緩沖液混合后形成一種混合物，對(duì)該混合物進(jìn)行溫育，以裂解血樣 中的血細(xì)胞，然后對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離后產(chǎn)生一個(gè)綠色團(tuán)塊，該團(tuán)塊即為血樣中存在 肺炎鏈球菌的早期跡象； 制備一份厭氧陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本，用于下游分析，包括： 將一部分厭氧陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本與濃度不超過(guò)約1克/升的X-100混合后形成一種混合 物； 可以對(duì)該混合物進(jìn)行溫育； 對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離后，產(chǎn)生一個(gè)團(tuán)塊和一些上清液； 將所述上清液丟棄，同時(shí)保留所述團(tuán)塊； 用所述緩沖液對(duì)所述團(tuán)塊進(jìn)行重新懸浮，生成團(tuán)塊的懸浮液； 對(duì)團(tuán)塊的懸浮液進(jìn)行離心分離，再次產(chǎn)生上清液和第二個(gè)團(tuán)塊； 將再次產(chǎn)生的上清液丟棄，同時(shí)保留含活性肺炎鏈球菌的第二個(gè)團(tuán)塊。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述部分厭氧陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本和等量的緩沖液混 合，形成所述的混合物。
30. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述部分厭氧陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本和X-100濃度為約 0. 335克/升的所述緩沖液混合，形成所述的混合物。
31. 如權(quán)利要求28所述的方法，進(jìn)一步包含將第二個(gè)團(tuán)塊用一種溶液進(jìn)行再次懸浮， 并對(duì)第二個(gè)團(tuán)塊的懸浮液進(jìn)行至少一次下游檢測(cè)，所述至少一次檢測(cè)從包含：質(zhì)譜法鑒定 微生物、表型鑒定、藥敏試驗(yàn)和分子檢測(cè)的一組檢測(cè)中選擇。
32. -個(gè)用于從陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中隔離和濃縮有機(jī)物的試劑盒，包含如權(quán)利要求1所 述的至少一種配方的試劑。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104254597SQ201380021036
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】蘇珊.M.基歇爾, 萬(wàn)德.懷特, 威廉.B.布勞紹, 戴安.魯波, 詹姆斯.Y.周, 朱莉.L.羅薩勒斯, 杰弗里.H.布魯頓, 約翰.D.曼特羅, 阿德里安.P.麥立科, 唐納德.R.卡利漢, 本.唐, 馮麗萍, 柯蒂斯.M.高斯內(nèi)爾, 肖恩.比蒂, 約翰.P.道格拉斯 申請(qǐng)人:Bd公司