專利名稱：用于改良蛋白質(zhì)性能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于改造蛋白質(zhì)以優(yōu)化其在某些目的環(huán)境條件下的性能的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于改造酶以優(yōu)化其在特定環(huán)境條件下的催化活性的方 法。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白 酶)的凈表面電荷和/或表面電荷分布的方法，以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑制劑 中表現(xiàn)出改良性能的酶變體。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)在其天然環(huán)境外工作時(shí)，性質(zhì)通常是次佳的。例如，酶(例如，蛋白酶、月旨 肪酶、淀粉酶、纖維素酶等)通常用于衣物洗滌劑中清潔織物上的污漬，所述衣物洗滌劑一 般包括活性成分的復(fù)雜組合。事實(shí)上，大多數(shù)清潔用品包括表面活性劑系統(tǒng)、漂白劑、助洗 齊U、抑泡劑、污垢懸浮劑、污垢釋放劑、熒光增白劑、軟化劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制化合物、 磨料、殺菌劑和香料，以及用于清潔的酶。因此，盡管目前洗滌劑的復(fù)雜性，但仍存在難以完 全去除的許多污漬，部分原因就在于亞最佳的酶性能。盡管有許多酶開(kāi)發(fā)研究，但本領(lǐng)域仍 需要改造蛋白質(zhì)以用于特定用途和條件的方法。事實(shí)上，本領(lǐng)域仍需要快速且系統(tǒng)地修改 蛋白質(zhì)的靜電性質(zhì)以優(yōu)化其在商業(yè)應(yīng)用中的性能的方法。特別地，本領(lǐng)域仍需要改造在工 業(yè)上有用的酶的方法，所述酶包括但不限于脂肪酶、淀粉酶、角質(zhì)酶、甘露聚糖酶、氧化還原 酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和其他酶，以便在清潔溶液中提供改良的活性、穩(wěn)定性和溶解 性。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于改造蛋白質(zhì)以優(yōu)化其在某些目的環(huán)境條件下的性能的方法。在某 些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于改造酶以優(yōu)化其在特定環(huán)境條件下的催化活性的方法。在 某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶)的凈表 面電荷和/或表面電荷分布、以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑制劑中顯示改良性能的 酶變體的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在蛋白質(zhì)，特別是酶中進(jìn)行電荷置換的方法。 在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的酶的方法。本發(fā)明可以用 于改造各種酶以及其他蛋白質(zhì)。特別地，本發(fā)明可以用于開(kāi)發(fā)改良的工業(yè)有用酶，所述工業(yè) 包括但不限于清潔(例如，衣物、餐具、硬表面等)。然而，本發(fā)明不旨在局限于任何具體酶 或蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生與親本中性金屬蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的中性金 屬蛋白酶變體的方法，其包括置換親本中性金屬蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘 基，以產(chǎn)生與親本比較具有更多正電荷或更多負(fù)電荷的中性金屬蛋白酶變體。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)比較親本和變體去除污漬的能力，測(cè)試變體的 洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達(dá)到大于1. 0的 值。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的變體的方法。在 某些實(shí)施方案中，親本中性金屬蛋白酶是野生型成熟形式的中性金屬蛋白酶。在某些其他 實(shí)施方案中，變體衍生自芽孢桿菌科(Bacillaceae)中性金屬蛋白酶。在某些優(yōu)選實(shí)施方 案中，變體衍生自芽孢桿菌屬(Bacillus)中性金屬蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案 中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些優(yōu)選實(shí)施 方案中，洗滌性能在具有堿性PH的液體衣物洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些備選優(yōu)選實(shí)施方案 中，親本中性金屬蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約50%的溶劑可及表面(SAS)的 位置。在某些另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大 于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本中性金屬蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的中性金屬蛋白酶變體的方法，其包括置換親本中性金屬蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸 殘基，以產(chǎn)生與親本比較具有更多正電荷或較少負(fù)電荷的中性金屬蛋白酶變體；和置換親 本中性金屬蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本比較具有更多負(fù)電荷 或較少正電荷的中性金屬蛋白酶變體。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括 通過(guò)比較親本和變體去除污漬的能力，測(cè)試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為 值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達(dá)到大于1. 0的值。在再其它實(shí)施方案中，該方法包括 產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的變體。這些步驟旨在以任何合適的順序進(jìn)行。在某些實(shí)施方案 中，親本中性金屬蛋白酶是野生型成熟形式的中性金屬蛋白酶。在某些其他實(shí)施方案中，變 體衍生自芽孢桿菌科中性金屬蛋白酶。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，變體衍生自芽孢桿菌屬中 性金屬蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體 洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌性能在具有堿性PH的液體衣物洗 滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些備選優(yōu)選實(shí)施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置 是具有大于約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，親本中 性金屬蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某 些優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)堿性氨基酸殘基置換，而在其他 實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換，并且在某些另外 的實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用堿性氨基酸殘基置換。在某些實(shí)施方案中，提供 各種置換組合。在另外的實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨基酸殘 基置換，而在其他實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換， 并且在再其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨基酸殘基置換。在 其他另外的實(shí)施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的至少一個(gè)中性氨基酸殘基用至少一個(gè)中 性氨基酸殘基置換，以產(chǎn)生與親本比較具有相同電荷的中性金屬蛋白酶變體。本發(fā)明不旨 在局限于任何具體的置換組合。所述置換也不旨在以任何特定順序執(zhí)行。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸蛋 白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以產(chǎn) 生與親本比較具有更多正電荷或更多負(fù)電荷的絲氨酸蛋白酶變體。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施 方案中，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)比較親本和變體去除污漬的能力，測(cè)試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達(dá)到大于1. 0的值。在進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的變體的方法。在某些實(shí)施方案 中，親本絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實(shí)施方案中，變體衍 生自芽孢桿菌科絲氨酸蛋白酶。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，變體衍生自芽孢桿菌屬絲氨酸蛋 白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組 合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌性能在具有堿性PH的液體衣物洗滌劑中進(jìn) 行測(cè)試。在某些備選優(yōu)選實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于 約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶 中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸蛋白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以 產(chǎn)生與親本比較具有更多正電荷或較少負(fù)電荷的絲氨酸蛋白酶變體；和置換親本絲氨酸 蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本比較具有更多負(fù)電荷或較少正電 荷的絲氨酸蛋白酶變體。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)比較親本 和變體去除污漬的能力，測(cè)試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改 良的洗滌性能的變體達(dá)到大于1.0的值。在再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法包括產(chǎn)生具有 改良的洗滌性能的變體。所述步驟旨在以任何合適的順序進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，親本 絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實(shí)施方案中，變體衍生自微 球菌亞目(Micrococcineae)絲氨酸蛋白酶。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，變體衍生自纖維單 胞菌屬(Cellulomonas)絲氨酸蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌性能在具有 6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌性能在 具有堿性PH的液體衣物洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些備選優(yōu)選實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白 酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的 優(yōu)選實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約65 %的溶劑可及表 面(SAS)的位置。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)堿性氨基 酸殘基置換，而在其他實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基 置換，并且在某些另外的實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用堿性氨基酸殘基置換。在 某些實(shí)施方案中，提供各種置換組合。在另外的實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至 少一個(gè)酸性氨基酸殘基置換，而在其他實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè) 中性氨基酸殘基置換，并且在再其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸 性氨基酸殘基置換。在其他另外的實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的至少一個(gè)中性氨基 酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換，以產(chǎn)生與親本比較具有相同電荷的絲氨酸蛋白酶 變體。本發(fā)明不旨在局限于任何具體的置換組合。這些置換也不旨在以任何特定的順序執(zhí) 行。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸 蛋白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以 產(chǎn)生與親本比較具有更多正電荷或較少負(fù)電荷的絲氨酸蛋白酶變體；置換親本絲氨酸蛋白 酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本比較具有更多負(fù)電荷或較少正電荷的 絲氨酸蛋白酶變體；和獲得通過(guò)這些步驟產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶變體。在另外的實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)比較親本和變體去除污漬的能力，測(cè)試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達(dá)到大于1. 0的值。在進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，該方法包括產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的變體。所述步驟旨在以任何合適的順序進(jìn)行。在 某些實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實(shí)施 方案中，變體衍生自微球菌亞目絲氨酸蛋白酶。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，變體衍生自纖維單 胞菌屬絲氨酸蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末 或液體洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，洗滌性能在具有堿性PH的液體 衣物洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些備選優(yōu)選實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè) 位置是具有大于約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，親 本絲氨酸蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置是具有大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在 某些優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)堿性氨基酸殘基置換，而在其 他實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換，并且在某些另 外的實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用堿性氨基酸殘基置換。在某些實(shí)施方案中，提 供各種置換組合。在另外的實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨基酸 殘基置換，而在其他實(shí)施方案中，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置 換，并且在再其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)中性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨基酸殘基置換。 在其他另外的實(shí)施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的至少一個(gè)中性氨基酸殘基用至少一個(gè)中 性氨基酸殘基置換，以產(chǎn)生與親本比較具有相同電荷的絲氨酸蛋白酶變體。本發(fā)明不旨在 局限于任何具體的置換組合。這些置換也不旨在以任何特定的順序執(zhí)行。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生與親本蛋白質(zhì)比較，具有改良的洗滌性能的至少一種蛋白 質(zhì)變體的方法，其包括修飾親本蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn) 生與親本蛋白質(zhì)比較，具有更多正電荷、更多負(fù)電荷、更少正電荷或更少負(fù)電荷的至少一種 蛋白質(zhì)變體。在某些實(shí)施方案中，所述修飾包括置換、添加和/或缺失，而在其他實(shí)施方 案中，修飾包括化學(xué)修飾。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案 中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、 alkalase或過(guò)氧化氫酶。在某些進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或 中性金屬蛋白酶。在某些另外的實(shí)施方案中，使用至少一種目的測(cè)驗(yàn)，評(píng)估至少一種蛋白 質(zhì)變體的性能。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述至少一種目的測(cè)驗(yàn)包括測(cè)量底物結(jié)合、 酶抑制、表達(dá)水平、洗滌劑穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、反應(yīng)速率、反應(yīng)進(jìn)度(extentof reaction)、熱 活性、淀粉液化、酯水解、酶促漂白、洗滌性能、生物質(zhì)降解、溶解性、螯合劑穩(wěn)定性和/或糖 化。在某些其他另外的實(shí)施方案中，與親本蛋白質(zhì)比較，至少一種蛋白質(zhì)變體在至少一種目 的測(cè)驗(yàn)中顯示改良的性能。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本酶比較，具有改良的洗滌性能的至少一種酶變體的 方法，其包括修飾親本酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本酶比 較，具有更多正電荷、更多負(fù)電荷、更少正電荷或更少負(fù)電荷的至少一種酶變體。在某些實(shí) 施方案中，修飾包括置換、添加和/或缺失，而在備選實(shí)施方案中，修飾包括化學(xué)修飾。在某 些另外的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)試酶變體和親本酶的洗滌性能，以提供關(guān)于酶 變體和親本酶的性能指數(shù)。在某些實(shí)施方案中，酶變體的性能指數(shù)具有大于1.0的值，而親 本酶的洗滌性能具有1.0的性能指數(shù)。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括產(chǎn)生具有改良的洗滌性能的變體酶。在某些另外的實(shí)施方案中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纖維 素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、alkalase或過(guò)氧化氫酶。在某 些優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或中性金屬蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方 案中，蛋白酶是芽孢桿菌屬蛋白酶。在某些再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，洗滌性能在具有5-12. O 的PH的粉末或液體洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，洗滌性能在具有堿性PH 的液體衣物洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試，而在某些其他實(shí)施方案中，洗滌性能在包含堿性PH的冷水液體洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，置換發(fā)生在親本酶中具有大于約25%的溶劑 可及表面(SAS)的位置中。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，置換發(fā)生在親本酶中具有大于約 50%或大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本酶比較，具有改良的洗滌性能的酶變體的方法，其 包括a)修飾親本酶中一個(gè)或多個(gè)位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本酶比較， 具有更多正電荷、更多負(fù)電荷、更少正電荷或更少負(fù)電荷的第一酶變體；和b)修飾親本酶 中一個(gè)或多個(gè)位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn)生與親本酶比較，具有更多正電荷、更多 負(fù)電荷、更少正電荷或更少負(fù)電荷的第二酶變體。在某些實(shí)施方案中，修飾包括置換、添加 和/或缺失，而在其他實(shí)施方案中，修飾包括化學(xué)修飾。在某些另外的實(shí)施方案中，重復(fù)這 些步驟以產(chǎn)生多種酶變體。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，親本酶是蛋白酶、淀粉酶、纖維素 酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、alkalase或過(guò)氧化氫酶。在某 些優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白酶是中性金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方 案中，親本酶是芽孢桿菌屬蛋白酶。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)試變 體酶和親本酶的洗滌性能，并且在該洗滌性能測(cè)驗(yàn)中比較親本和變體酶去除污漬的能力， 其中親本酶的洗滌性能被定為值1. 0，具有改良的洗滌性能的變體酶達(dá)到大于1. 0的值。在 某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括產(chǎn)生與親本酶比較具有改良的洗滌性能的酶變體。在 某些優(yōu)選實(shí)施方案中，親本酶是絲氨酸蛋白酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白 酶是芽孢桿菌屬絲氨酸蛋白酶或纖維單胞菌屬絲氨酸蛋白酶。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，洗滌性能在具有5-12. 0的pH的粉末或液體洗滌劑組合物中進(jìn)行測(cè)試。在某些另外的 實(shí)施方案中，洗滌性能在具有堿性PH的液體衣物洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在再進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，洗滌性能在包含堿性PH的冷水液體洗滌劑中進(jìn)行測(cè)試。在某些備選實(shí)施方案中，置 換發(fā)生在親本酶中具有大于約25%的溶劑可及表面(SAS)的位置中，而在某些其他實(shí)施方 案中，置換發(fā)生在親本酶中具有大于約50%或大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置 中。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)堿性氨基酸殘基置換，而在其 他實(shí)施方案中，至少一個(gè)酸性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換，至少一個(gè)中性 氨基酸殘基用至少一個(gè)堿性氨基酸殘基置換，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨 基酸殘基置換，至少一個(gè)堿性氨基酸殘基用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換，至少一個(gè)中性 氨基酸殘基用至少一個(gè)酸性氨基酸殘基置換，和/或親本酶中的至少一個(gè)中性氨基酸殘基 用至少一個(gè)中性氨基酸殘基置換以產(chǎn)生與親本酶比較具有相同電荷的酶變體。本發(fā)明旨在 按需使用任何合適的置換組合。本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生與親本蛋白質(zhì)比較，具有改良的洗滌性能的至少一種蛋白 質(zhì)變體的方法，其包括修飾親本蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)位置處的至少一個(gè)氨基酸殘基，以產(chǎn) 生與親本蛋白質(zhì)比較，具有更多正電荷、更多負(fù)電荷、更少正電荷或更少負(fù)電荷的至少一種蛋白質(zhì)變體，并且其中該一個(gè)或多個(gè)位置具有大于約25%的溶劑可及表面(SAS)。在某些 實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)位置在包含親本蛋白質(zhì)和至少一種另外蛋白質(zhì)的同源蛋白質(zhì)序列 氨基酸比對(duì)中是非保守的。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，親本蛋白質(zhì)是酶。在某些特別優(yōu)選的實(shí) 施方案中，酶是蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、氧化酶、 轉(zhuǎn)移酶、alkalase或過(guò)氧化氫酶。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，改良的性能包括選自下述的 一種或多種性能的增加底物結(jié)合、酶抑制、表達(dá)、洗滌劑中的穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、反應(yīng)速率、 反應(yīng)進(jìn)度、熱活性、淀粉液化、生物質(zhì)降解、糖化、酯水解、酶促漂白、洗滌性能、溶解性、螯合 劑穩(wěn)定性和/或紡織品變性(textilemodification)。在某些另外的實(shí)施方案中，修飾包括 置換、添加和/或缺失，而在其他實(shí)施方案中，修飾包括化學(xué)修飾。在某些實(shí)施方案中，至少 一個(gè)置換包含，相對(duì)于親本蛋白質(zhì)，0、-1或-2的凈電荷改變，而在其他實(shí)施方案中，至少一 個(gè)置換包含，相對(duì)于親本蛋白質(zhì)，+1或+2的凈電荷改變。在某些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，親 本蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)置換包含O、-1或-2的電荷改變，并且其中親本蛋白質(zhì)中的至少一 個(gè)另外置換包含，相對(duì)于親本蛋白質(zhì)，+1或+2的電荷改變。在某些備選實(shí)施方案中，相對(duì)于親本蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)變體具有+1或+2的凈電荷改變，而在其他實(shí)施方案中，相對(duì)于親本 蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)變體具有0、-1或-2的凈電荷改變。在某些另外的實(shí)施方案中，置換發(fā)生在 親本酶中具有大于約50%或大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。附圖簡(jiǎn)述圖IA描述了在AATCC液體洗滌劑(實(shí)心三角)以及匹配pH和傳導(dǎo)性的緩沖液 (空心三角)(5mM HEPES pH8. 0,2. 5mM NaCl)中測(cè)量的，隨著相對(duì)于野生型ASP的凈電荷改 變，ASP變體的血液、乳、墨(BMI)微型布樣(microswatch)相對(duì)活性(基于最佳性能者進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)化后)。相似地，圖IB描述了隨著相對(duì)于野生型的電荷改變，ASP組合電荷文庫(kù)(CCL) 的BMI微型布樣相對(duì)活性。圖2描述了在具有各種NaCl濃度——2. 5mM(空心圓圈)、16mM(灰色圓圈)禾口 IOOmM(黑色圓圈)——的5mM HEPES pH8. 0中測(cè)量的，隨著相對(duì)于野生型ASP的電荷改變， ASP變體的相對(duì)BMI微型布樣活性(基于最佳性能者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后)。圖3A描述了隨著電荷改變，F(xiàn)NA CCL在北美衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。相似 地，圖3B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在北美衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖4A描述了隨著電荷改變，F(xiàn)NA CCL在西歐液體衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。 相似地，圖4B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在西歐液體衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖5A描述了隨著電荷改變，F(xiàn)NA CCL在日本粉末衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。 相似地，圖5B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在日本粉末衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖6A描述了隨著電荷改變，F(xiàn)NA CCL在自動(dòng)餐具洗滌的洗滌劑中的烤蛋黃清潔性 能。相似地，圖6B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在自動(dòng)餐具洗滌的洗滌劑中的烤蛋黃清 潔性能。圖7A描述了隨著電荷改變，AmyS-S242Q CCL在BODIPY淀粉上的比酶活性。類似 地，圖7B針對(duì)與親本AmyS酶相比跨越-12至+4的電荷改變梯度的AmyS表面電荷變體，描 述了玉米淀粉液化后的粘度。圖8描述了隨著相對(duì)于野生型ASP的凈電荷改變，ASP變體在枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)中的表達(dá)水平。
圖9描述了隨著相對(duì)于親本FNA的凈電荷改變，F(xiàn)NA變體的LAS/EDTA穩(wěn)定性。

圖10描述了隨著相對(duì)于野生型ASP的凈電荷改變，ASP變體的熱穩(wěn)定性。圖11描述了隨著相對(duì)于野生型AmyS的電荷改變，第一 AmyS電荷梯的熱穩(wěn)定性。圖12提供隨著pH的改變，第一 AmyS電荷梯的稻淀粉清潔活性。pH3. 0-4. 25是 200mM 甲酸鈉 +0. 01% Tween-80。pH4. 25-5. 5 是 200mM 乙酸鈉 +0. 01% Tween-80。數(shù)據(jù)擬 合成滴定曲線，各自具有單個(gè)pKa值。圖13提供依據(jù)相對(duì)于野生型AmyS的電荷改變繪制的在圖12中測(cè)定的pKa值。發(fā)明_既述本發(fā)明提供用于改造蛋白質(zhì)以優(yōu)化其在某些目的環(huán)境條件下的性能的方法。在某 些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于改造酶以優(yōu)化其在特定環(huán)境條件下的催化活性的方法。在 某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶)的凈表 面電荷和/或表面電荷分布的方法，以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑制劑中顯示改良 性能的酶變體。蛋白酶枯草桿菌蛋白酶是在衣物洗滌劑中使用的主要酶，并且可能是全世界最廣 泛使用的酶。大約20年前，注意到表面靜電效應(yīng)可能調(diào)節(jié)枯草桿菌蛋白酶的催化活性(參 見(jiàn)例如，Russell和Fersht，Nature 328 :496_500[1987])。較為近來(lái)，觀察到涉及改變枯 草桿菌蛋白酶的凈電荷的突變顯著影響在洗滌劑中的洗滌性能(參見(jiàn)例如，引入本文作為 參考的EP專利號(hào)0479870B1)。這個(gè)有利效應(yīng)被認(rèn)為是使枯草桿菌蛋白酶pi (等電點(diǎn))朝 向洗滌液的PH遷移的結(jié)果。然而，隨后的工作證實(shí)這個(gè)結(jié)論并非總是適用(參見(jiàn)例如，引 入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)6，673，590B1)。如本專利中指出的，枯草桿菌蛋白酶中電荷 突變的效應(yīng)顯著地依賴于洗滌劑濃度，其中降低親本枯草桿菌蛋白酶的pi的突變提供在 低洗滌劑濃度下更有效的酶，而提高pi的突變提供在高洗滌劑濃度下更有效的酶。這具有 極大用途，因?yàn)橄礈煲褐械南礈靹舛仍谌澜绶秶鷥?nèi)變化極大。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員已經(jīng)顯而易見(jiàn)的是，對(duì)于枯草桿菌蛋白酶的洗滌性能，存在依賴于洗滌液中的pH和洗滌 劑濃度的最適pi。改善枯草桿菌蛋白酶在衣物洗滌劑中的活性的其它努力已經(jīng)描述(參見(jiàn) 美國(guó)專利
發(fā)明者A·肖, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯考-佩雷拉, W·埃赫勒 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司