專(zhuān)利名稱(chēng)：賦予除草劑抗性的細(xì)胞色素p450基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及除草劑耐受性植物和除草劑在此類(lèi)植物上的應(yīng)用。更具體地，本發(fā) 明涉及用于產(chǎn)生商業(yè)植物的基因，所述商業(yè)植物對(duì)某些抑制羥基苯丙酮酸/鹽雙加氧酶 (hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase,HPPD)的除草劑類(lèi)型以及其它類(lèi)型的除草劑是有 抗性的。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)表達(dá)某些細(xì)胞色素P450基因來(lái)在植物中降解此類(lèi)除草 劑。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450(P450)單加氧酶是微生物、植物和動(dòng)物中存在的遍在血紅素蛋白。 由大量且不同的一組同工酶組成，P450介導(dǎo)使用眾多化合物作為底物的大批氧化反應(yīng)，并 且包括牽涉生物合成過(guò)程諸如類(lèi)苯基丙烷、脂肪酸、和類(lèi)萜生物合成的反應(yīng)；天然產(chǎn)物的代 謝；和對(duì)外來(lái)物質(zhì)(異生素)的解毒。參見(jiàn)例如，Schuler (1996) Crit. Rev. Plant Sci. 15 235-284(1996)。在典型的P450催化反應(yīng)中，氧分子(O2)的一個(gè)原子被摻入底物中，而另 一個(gè)原子被還原成水。經(jīng)由對(duì)NADPH的氧化來(lái)提供電子。對(duì)于大多數(shù)真核P450，NADPH: 細(xì)胞色素P450還原酶(膜結(jié)合黃素蛋白)將必需的2個(gè)電子從NADPH轉(zhuǎn)移至細(xì)胞色素 P-450 (Bolwell 等(1994) Phytochemistry 37 :1491_1506 ；Mizutani 禾Π Ohta (1998) Plant Physiol. ，16,357-367)。已知植物細(xì)胞色素P450牽涉對(duì)多種殺蟲(chóng)劑的代謝和解毒以及初級(jí)和次級(jí) 代謝產(chǎn)物的生物合成。已經(jīng)經(jīng)由傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù)(Shuler (1996) Crit. Rev. Plant. Sci. 15 235-284 ；Bolwell 等(1994)Phytochemistry 37 :1491_1506 ;Frear 等(1969) Phytochemistry 8 :2157_2169)及通過(guò)在植物中對(duì)哺乳動(dòng)物或細(xì)菌基因的研究(Shiota等 (1994)Plant Physiol. 106 :17_23 ；0，Keefe 等(1994)PlantPhysiol. 105 :473_482)而收 集了大量證據(jù)。最近，已經(jīng)成功克隆了內(nèi)源植物P450，在異源系統(tǒng)中成功表達(dá)、表征和測(cè)定 (Siminszky 等(1999)PNAS(USA)96 1750-1755)。例如，自菊芋(Jerusalem artichoke, Helianthus tuberosus)克隆 CYP76B1(Robineau 等(1998)Plant Physiol.,118 1049-1056)。發(fā)現(xiàn)此異生素誘導(dǎo)型細(xì)胞色素P450是可強(qiáng)烈誘導(dǎo)的，并且催化對(duì)多種苯脲除 草劑的快速氧化N-脫烷基化以產(chǎn)生非植物毒性代謝物。CYP76B1基因在煙草(Nicotiana tabacum)和擬南芥屬(Arabidopsis)中的異源表達(dá)導(dǎo)致除草劑氧化的速率增加，并且單獨(dú) 足以產(chǎn)生20倍對(duì)利谷隆(linuron)(—種通過(guò)單一脫烷基化而解毒的化合物)的耐受性水 平，而且對(duì)異丙隆(isoproturon)或綠麥隆(chlortoluron)(其需要連續(xù)催化步驟來(lái)解毒) 的耐受性也增加 10 倍(Didierjean 等(2002) Plant Physiol. 130 179-189)。Frear 等(1969)Phytochemistry 8 :2157_2169 證明了定位于棉花幼苗微粒體級(jí)分中的混合功能氧化酶代謝滅草隆(monuron)。積累了進(jìn)一步的證據(jù)，其支持P450牽 涉對(duì)代表數(shù)種不同類(lèi)型的化合物的許多除草劑的代謝和解毒(綜述于Bolwell等(1994) Phytochemistry 37 1491-1506 ；Shuler (1996)Crit. Rev. Plant. Sci. 15 :235_284)。 同 樣地，例如，某些抑制HPPD的除草劑諸如硝磺草酮(mesotrione) (Hawkes等(2001)Proc. Brighton Pest Cont Conf-ffeeds, BCPC,563-568)禾口 topramezone(Grossmann 和 Ehrhardt (2007) Pest Mgmt. Sci. 63 :429_439)的作物/雜草選擇性主要依賴(lài)于細(xì)胞色素 P450型酶的活性。認(rèn)為差別的除草劑代謝P450活性代表使某些作物物種能夠比其它作物或多雜草 物種更耐受特定除草劑的機(jī)制之一。以下專(zhuān)利和申請(qǐng)收集對(duì)于細(xì)胞色素P450在除草劑耐 受性方面的應(yīng)用的背景理解有用的信息(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，380，465 ；6, 121，512 ；5, 349，127 ； 及PCT專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本號(hào)W02007000077)。還可參見(jiàn)U. S. 6，649，814和6，300，544，其公 開(kāi)內(nèi)容涉及細(xì)胞色素P450單加氧酶用于獲得對(duì)昆蟲(chóng)、螨、或線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)有抗性或具有改善的營(yíng) 養(yǎng)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物。已知用于提供對(duì)HPPD除草劑有耐受性的植物的方法，其包括用包含編碼HPPD酶 的區(qū)域的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料(參見(jiàn)例如，美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本號(hào)2004/0058427 ；PCT申請(qǐng) W098/20144 ；PCT申請(qǐng)WO 02/46387 ；還可參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)文本號(hào)2005/0246800，其涉及 大豆品種具有相對(duì)HPPD耐受性的鑒定和標(biāo)記)。然而，迄今通常尚未認(rèn)可的是，細(xì)胞色素 P450酶在與HPPD酶組合表達(dá)，或者在耐受性背景中表達(dá)，或者單獨(dú)在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá) 時(shí)可以提供額外水平的或商業(yè)水平的對(duì)HPPD抑制劑和其它除草劑的耐受性。雖然給定的 HPPD酶可以提供有用水平的對(duì)同一 HPPD抑制劑除草劑的耐受性的，但是它可能完全不足 以提供商業(yè)水平的對(duì)不同的、更想要的HPPD抑制劑除草劑的耐受性，所述不同的、更想要 的HPPD抑制劑除草劑例如可以控制不同雜草譜，更便宜地獲得或提供環(huán)境益處。不僅有特 定的HPPD酶和編碼其的多核苷酸，本發(fā)明提供了增強(qiáng)適合于提供商業(yè)上有用水平的對(duì)特 定HPPD抑制劑除草劑化學(xué)的抗性的HPPD酶的效果的手段，其經(jīng)由使用降解某些、下文規(guī)定 的、HPPD抑制劑除草劑化學(xué)的細(xì)胞色素P450酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，這些細(xì)胞色素P450酶的表 達(dá)還提供了以下手段，即其降低持久存在于植物組織中的母體活性除草劑的量，因此降低 由于向食物或飼料作物的應(yīng)用而進(jìn)入食物和飼料鏈的母體除草劑殘基的總量。另外，本文中所公開(kāi)的基因還提供了一種用于提供對(duì)多種異生素的抗性的 備選方法，所述異生素包括除草劑，并包括諸如具有非HPPD作用模型的磺酰脲類(lèi) (Sulfonylureas)的一些類(lèi)型。發(fā)明概述提供了用于將除草劑抗性或耐受性賦予植物、植物細(xì)胞、組織和種子的組合物和 方法。組合物包括轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織、和種子，它們已經(jīng)單獨(dú)地或者與編碼賦予想 要的性狀的多肽的一種或多種附加的核酸分子組合地用編碼賦予除草劑抗性或耐受性的 細(xì)胞色素P450或其變體的核酸分子轉(zhuǎn)化。具體地，細(xì)胞色素P450或其變體賦予對(duì)HPPD抑 制劑類(lèi)、苯并噻二嗪酮類(lèi)(Benzothiadiazinones)、磺酰脲類(lèi)、和其它類(lèi)型的除草劑(包括 例如咪唑啉酮類(lèi)(Imidazolinones)、三唑并嘧啶類(lèi)(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯 甲酸類(lèi)(Pyrimidinylthiobenzoates)、三唑啉酮類(lèi)(Triazolinones)、生長(zhǎng)素類(lèi)(Auxins)、 乙酰輔酶 A 羧化酶(ACC 酶)抑制劑類(lèi)(Acetyl-coenzyme ACarboxylase inhibitors)、光 系統(tǒng)II (PSII)抑制劑類(lèi)(Photosystem II inhibitors)、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi) (Protoporphyrinogen Oxidase(PPO) inhibitors)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi) (Phytoene Desaturaseinhibitors)、二石肖基苯月安類(lèi)(Dinitroanalines)、禾口乙酉先月安類(lèi))以 及具有未知作用方式的除草劑諸如野燕枯(Difenzoquat)和異噁草酮(Clomazone)的抗性或耐受性。別的多肽也可以賦予對(duì)除草劑(包括HPPD抑制劑類(lèi)和其它除草劑)的抗性或 耐受性。還提供了用于生成和使用本發(fā)明的除草劑抗性或耐受性植物、植物細(xì)胞、組織和種 子的方法。本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :2、4、和6中所示基因序列，其編碼在植物中表達(dá)時(shí)能夠 降解HPPD除草劑類(lèi)的某些除草劑的細(xì)胞色素P450酶。本發(fā)明還涉及過(guò)表達(dá)SEQ ID NO :2、 4、和6中所示P450的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，用于在植物中過(guò)表達(dá)所述基因的遺傳構(gòu)建體，并涉及向 HPPD抗性植物，特別是田地中的作物植物過(guò)多應(yīng)用HPPD類(lèi)除草劑(單獨(dú)地和與其它除草劑 組合地兩者)以進(jìn)行雜草控制而不損害作物植物。本發(fā)明還涵蓋在同一植物中組合P450基 因與賦予對(duì)其它除草劑的抗性的基因，例如賦予對(duì)草甘膦(glyphosate)的抗性的EPSPS基 因(例如，具有對(duì)草甘膦的天然耐受性的EPSPS基因)，和賦予對(duì)草銨膦(glufosinate)的 抗性的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyltransferase)基因(PAT和BAR 基因，記載于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，561，236和5，276，268)。此外，本發(fā)明還提供了具有降低的HPPD 除草劑殘留水平的植物。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了一種DNA構(gòu)建體，其包含1)如下盒，其具有在上游啟動(dòng)子(例如， Rubisco啟動(dòng)子區(qū)的小亞基，包括5’非翻譯前導(dǎo)序列)和下游胭脂氨酸合酶3’終止子序列 可操作表達(dá)控制下的經(jīng)修飾燕麥屬(Avena)HPPD基因；2)如下DNA序列，其編碼在上游擬 南芥或大豆多聚遍在蛋白啟動(dòng)子和5’非翻譯前導(dǎo)序列和來(lái)自組蛋白基因的下游3’終止子 序列可操作控制下的玉米nsfl蛋白序列(SEQ ID NO :2)。圖2顯示了涉及在本發(fā)明中使用的細(xì)胞色素P450酶的多核苷酸和氨基酸序列的 列表。圖3顯示了含有CYP72A1編碼區(qū)的二元載體17107的圖譜。圖4顯示了含有NSF編碼區(qū)的二元載體17108的圖譜。發(fā)明詳述總論本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)，并且具體地，涉及如下轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生(i)在與非 轉(zhuǎn)基因樣(類(lèi))植物相比時(shí)展示出對(duì)除草劑的實(shí)質(zhì)(substantial)抗性或?qū)嵸|(zhì)耐受性的轉(zhuǎn) 基因植物；和(ii)在同樣地與此類(lèi)非轉(zhuǎn)基因樣植物相比時(shí)具有增強(qiáng)的將某些除草劑轉(zhuǎn)化 成氧化代謝物的能力的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及在產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物中使用時(shí)，或者 在由所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生時(shí)的核苷酸序列(及其表達(dá)產(chǎn)物)等。本發(fā)明的組合物包括轉(zhuǎn)基 因植物、植物細(xì)胞、組織、和種子，它們已經(jīng)單獨(dú)地或者與編碼賦予想要的性狀的多肽的一 種或多種附加的核酸分子組合地用編碼賦予除草劑抗性或耐受性的細(xì)胞色素P450或其變 體的核酸分子轉(zhuǎn)化。具體地，細(xì)胞色素P450或其變體賦予對(duì)HPPD抑制劑類(lèi)、苯并噻二嗪酮 類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、和其它類(lèi)型的除草劑(包括例如咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶類(lèi)、嘧啶硫代苯甲 酸類(lèi)、三唑啉酮類(lèi)、生長(zhǎng)素類(lèi)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑類(lèi)、光系統(tǒng)II (PSII)抑制 劑類(lèi)、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi)、二硝基苯 胺類(lèi)、和乙酰胺類(lèi))以及具有未知作用方式的除草劑諸如野燕枯和異噁草酮的抗性或耐受 性。別的多肽也可以賦予對(duì)除草劑(包括HPPD抑制劑類(lèi)和其它除草劑)的抗性或耐受性。 還提供了用于生成和使用本發(fā)明的除草劑抗性或耐受性植物、植物細(xì)胞、組織和種子的方法。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，術(shù)語(yǔ)羥苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧酶(HPPD)、4_羥 苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧酶(4-HPPD)和對(duì)羥苯基丙酮酸鹽(或丙酮酸)雙加氧 酶(p-HPPD)是同義的。如本文中所使用的，對(duì)除草劑具有實(shí)質(zhì)“耐受性”的植物在它們經(jīng)受所述除草劑時(shí) 提供如下劑量/響應(yīng)曲線(xiàn)，其在與由類(lèi)似經(jīng)歷的非耐受樣植物所提供的劑量/響應(yīng)曲線(xiàn)相 比時(shí)轉(zhuǎn)向右側(cè)。此類(lèi)劑量/響應(yīng)曲線(xiàn)具有繪制在X軸上的“劑量”和繪制在y軸上的“百分 比殺死或損傷”，“除草效果”等。典型地，耐受性植物會(huì)需要為非耐受樣植物至少2倍的除 草劑來(lái)產(chǎn)生給定的除草效果。對(duì)除草劑具有實(shí)質(zhì)“抗性”的植物在經(jīng)受通常由農(nóng)業(yè)界采用 來(lái)殺死耕地中的雜草的濃度和比率的除草劑時(shí)展現(xiàn)出很少(若有的話(huà))壞死的、溶解的、褪 綠病的或其它損害。如本文中所使用的，“非轉(zhuǎn)基因樣植物”指與轉(zhuǎn)基因植物類(lèi)似或相同但其不含有賦 予除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因的植物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“賦予”指向植物提供特征或性狀，諸如除草劑耐受性或 抗性和/或其它想要的性狀。這里所公開(kāi)的是一種用于給予對(duì)如下除草劑耐受的作物植物(谷物/玉米 (corn)、稻、玉米(maize)、小麥、大麥、大豆、油菜/蕓苔、棉花等)的方法通過(guò)抑制羥苯 基丙酮酸鹽雙加氧酶(HPPD)起作用的除草劑，或其它除草劑諸如苯并噻二嗪酮類(lèi)、磺酰脲 類(lèi)，及其它種類(lèi)的除草劑，包括例如咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶類(lèi)、嘧啶硫代苯甲酸類(lèi)、三唑啉 酮類(lèi)、生長(zhǎng)素類(lèi)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑類(lèi)、光系統(tǒng)II (PSII)抑制劑類(lèi)、原卟啉 原氧化酶(PPO)抑制劑類(lèi)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi)、二硝基苯胺類(lèi)、和乙酰 胺，以及具有未知作用方式的除草劑諸如野燕枯和異噁草酮。冠詞“一個(gè)”和“一種”在本文中用于指1個(gè)/種或超過(guò)1個(gè)/種(即至至少1個(gè)/ 種)該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。舉例而言，“元件”指一個(gè)或多個(gè)元件。貫穿整篇說(shuō)明書(shū)，單詞“包 含”(包括，含有)會(huì)理解成意指包括規(guī)定的元件、整數(shù)或步驟、或一組元件、整數(shù)或步驟，但 是不排除任何其它元件、整數(shù)或步驟、或一組元件、整數(shù)或步驟。細(xì)胞色素P450序列提供了細(xì)胞色素P450序列，其賦予除草劑耐受性或抗性。此類(lèi)序列包括SEQ ID NO :1、3、和5中所示氨基酸序列，及其變體。還提供的是編碼此類(lèi)氨基酸序列的多核苷酸序 列，包括 SEQ ID NO :2、4、和 6。依照本公開(kāi)內(nèi)容的方法，用編碼能夠氧化某些HPPD抑制劑及還有，任選地，其它 類(lèi)型的除草劑的細(xì)胞色素P450酶(CYP酶)的基因轉(zhuǎn)化作物植物?；蚝邪瑔?dòng)子和 終止子區(qū)域及任選地，其它元件(諸如內(nèi)含子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯增強(qiáng)子等)以便在作物植 物中提供有效量的P450酶的表達(dá)。任選地，對(duì)編碼P450酶的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以 除去對(duì)表達(dá)不利的特征，并對(duì)密碼子選擇進(jìn)行優(yōu)化以在特定的作物中表達(dá)(參見(jiàn)例如，美 國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，051，760 ；EP 0359472 ；EP 80385962 ；EP 0431829 ；及 Perlak 等(1991) PNASUSA 88 =3324-3328 ；本文通過(guò)提及而將它們完全收錄)。在某些實(shí)施方案中，選擇P450酶，因?yàn)?其能夠氧化“其它”除草劑，包括煙嘧磺隆(nicosulfuron)和/或苯達(dá)松(bentazon)，和/ 或因?yàn)槟軌蜓趸疕PPD抑制劑除草劑硝磺草酮和/或磺草酮(sulcotrione)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇P450酶，因?yàn)槠溲趸疕PPD抑制劑，包括但不限于硝磺草酮、SYN449280、異噁氟 草(Isoxaflutole)、特滅酮(Tembotrione)、Topramezone、匹拉沙托(Pyrasulfatole)、石黃 草酮、吡唑特(Pyrazolynate)、節(jié)草唑(Pyrazoxyfen)、氯草酮(Isoxachlortole)、吡草酮 (Benzofenap)、禾口苯并雙環(huán)酮(Benzobicyclon)。編碼在本發(fā)明中使用的細(xì)胞色素P450酶的經(jīng)優(yōu)化基因的例子包括玉米nsfl (SEQ ID NO :1)、玉米 CYP72A1(SEQ ID NO :3)、和稻 CYP81A6 (SEQ IDNO 5)。編碼在本發(fā)明中使 用的細(xì)胞色素P450酶的其它感興趣多核苷酸包括但不限于編碼玉米nsfl (SEQ ID NO :2)、 玉米CYP72A1 (SEQ ID NO :4)、和稻CYP81A6 (SEQ ID NO 6)的氨基酸序列的多核苷酸。可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)鑒定編碼在本發(fā)明中使用的細(xì)胞色素P450酶的 別的多核苷酸序列，其基于它們賦予對(duì)感興趣的除草劑的抗性或耐受性的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。例 如，將候選P450基因轉(zhuǎn)化入合適的酵母菌株中，在其中表達(dá)，并基于它們?cè)隗w外氧化測(cè)試 除草劑的能力來(lái)選擇(參見(jiàn)Siminszky等(1999)PNAS (USA) 96 1750-1755)。合適的酵母 菌株包括諸如WATll或WAT21，其還包含合適的植物細(xì)胞色素P450能力的還原酶(例如如 DenisPompon和Phillipe Urban所描述的)。誘導(dǎo)合適的一段時(shí)間后(例如，取決于轉(zhuǎn)化 載體中所使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，用半乳糖)，使細(xì)胞增長(zhǎng)、收獲、破碎、通過(guò)慣常的手段來(lái)制 備微粒體級(jí)分，并用NADPH測(cè)定氧化經(jīng)14C標(biāo)記的硝磺草酮的能力。任選地，使用培養(yǎng)中的 全部細(xì)胞來(lái)實(shí)施測(cè)定法。容易檢測(cè)具有烯己二酮環(huán)的4和5個(gè)羥基修飾的氧化產(chǎn)物，并通 過(guò)例如RP HPLC或TLC來(lái)與未修飾的母體分開(kāi)(參見(jiàn)Hawkes等2001，BCPC conference Weeds，第 563 頁(yè))?；蛘撸跓煵?、擬南芥、玉米或其它容易轉(zhuǎn)化的、除草劑敏感的植物中表達(dá)候選 P450酶，并對(duì)所得的轉(zhuǎn)化體植物評(píng)估它們對(duì)HPPD抑制劑(類(lèi))(如記載于Didierjean等 (2002)Plant Physiol. 130 179-189中的)或其它感興趣的除草劑的耐受性。任選地，用 除草劑處理植物，或自植物采集的組織樣品，并進(jìn)行測(cè)定以便評(píng)估母體除草劑向氧化代謝 降解產(chǎn)物的代謝轉(zhuǎn)化速率。例如，使用經(jīng)放射性標(biāo)記的硝磺草酮，以及以下文獻(xiàn)中所描述的 分析方法=Hawkes 等 2001，BCPC conference Weeds，第 563 頁(yè)；Alferness 和 Wiebe (2002) J. Agric. Food Chem. ,50 :3926_3934 和 / 或 Gledhill 等(2004) Xenobiotica 31，733-747。 適合于在作物植物中表達(dá)細(xì)胞色素P450編碼序列的基因構(gòu)建體包含細(xì)胞色素P450編碼序 列上游的植物合適的啟動(dòng)子和5’前導(dǎo)序列(例如CMV35S啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子區(qū)域) 和細(xì)胞色素P450編碼序列下游的合適的終止子序列(以確保多聚腺苷酸化(例如nos基 因3’序列)。任選地，構(gòu)建體可以包含別的序列諸如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和/或修飾DNA序 列以在宿主植物中最佳的表達(dá)。如本文中所使用的，有意義的氧化速率定義為足以在轉(zhuǎn)基因植物中提供對(duì)給定底 物除草劑的耐受性明顯(大于約2X)增加的催化速率，其中相對(duì)于類(lèi)似處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)?照植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)給定的P450酶達(dá)多至0. 2%的總細(xì)胞蛋白。在本公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼合適的P450酶的基因選自通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方 法(例如使用來(lái)自Stratagene的λ -ZAPII載體試劑盒)自玉米或稻植物的3_7天齡 幼苗制備的玉米或稻cDNA文庫(kù)。任選地，合適的候選P450編碼序列選自用l-50ppm硝 磺草酮或其它HPPD抑制劑，或用煙嘧磺隆進(jìn)行的約24h處理內(nèi)誘導(dǎo)的那些P450。另外， 合適的候選P450編碼序列選自玉米組織中用安全水平的cyprosulfamide、雙苯噁唑酸(isoxadifen)和/或CGA24678進(jìn)行的24h處理內(nèi)誘導(dǎo)的那些P450 ；或者在其它谷類(lèi)中用 解毒喹(cloquintacet)和/或mefenpyr處理后誘導(dǎo)的那些P450。這可以容易地通過(guò)經(jīng) 由Northern印跡分析、差別展示分析，和/或用包含針對(duì)感興趣植物物種的所有或大多數(shù) P450基因的探針的RNA芯片測(cè)量(相對(duì)的)轉(zhuǎn)錄物水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者，通過(guò)PCR和例如用 于檢測(cè)包含細(xì)胞色素P450特征性血紅素結(jié)合區(qū)的克隆的經(jīng)放射性標(biāo)記的核苷酸的摻入來(lái) 篩選文庫(kù)。例如可以使用用于血紅素基序區(qū)的簡(jiǎn)并5’引物(Ohbayashi等1993)，以及設(shè) 計(jì)用于聚A尾的3’引物(參見(jiàn)Persans等(2001)Plant physiol.，125 :1126)。使用如 此生成的、經(jīng)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物來(lái)再篩選所述文庫(kù)以回收全長(zhǎng)cDNA，然后對(duì)所述全長(zhǎng)cDNA測(cè) 序。通過(guò)例如上文的方法或本領(lǐng)域中已知的其它方法(參見(jiàn)US6380465和US6121512及其 中所引用的所有參考文獻(xiàn)；參見(jiàn)Persans等(2001)Plant physiol.，125 :1126)來(lái)獲得候 選P450基因，然后經(jīng)由表達(dá)它們的方法來(lái)選擇，并測(cè)定它們?cè)诤线m的測(cè)試系統(tǒng)中對(duì)特別是 硝磺草酮或其它HPPD抑制劑(類(lèi))或煙嘧磺隆的氧化(或提供抗性)的能力。一種用于選擇合適的P450酶的備選方法是經(jīng)由對(duì)牽涉對(duì)感興趣除草劑的抗性的 P450基因的遺傳作圖。若基于差別P450響應(yīng)存在具有對(duì)除草劑的耐受性的品系和具有對(duì) 除草劑的抗性的品系，則這是有可能的。以對(duì)候選CYP基因(可經(jīng)由序列同源性和通過(guò)其特 征性血紅素基序容易識(shí)別的；參見(jiàn)Bortiri等(2006) Current Opinion in Plant Biology 9:164-171)的精微結(jié)構(gòu)QTL作圖和測(cè)序?yàn)槔?。例如，甜玉?例如Merit)的某些品系和 雜種對(duì)硝磺草酮易感，并且經(jīng)由與耐受性品種的常規(guī)雜交研究和標(biāo)志物的使用，有可能繪 制與此易感性有關(guān)的QTL的圖譜。我們先前已經(jīng)顯示了，經(jīng)處理的玉米植物中硝磺草酮水 平隨著時(shí)間降低，這是由于基于P450的降解機(jī)制。Merit植物似乎在此降解步驟中有缺陷。 如此，預(yù)期與差別響應(yīng)有關(guān)的QTL含有降解硝磺草酮的一種或多種P450基因。若基因組序 列存在繪圖間隔，則可以鑒定候選CYP基因?；蛘?，對(duì)包含QTL的BACS (細(xì)菌人工染色體克 隆)進(jìn)行測(cè)序，并鑒定候選CYP基因。通過(guò)比較耐受性和敏感性品種中的P450等位基因序 列，鑒定出候選CYP基因(并且是特別容易地，若例如在敏感性品種中有明顯的基因缺損和 /或表達(dá)缺乏)。例如，與本發(fā)明有關(guān)，已知少量玉米品系對(duì)硝磺草酮敏感，而少量對(duì)煙嘧磺隆敏 感。這2組部分重疊(參見(jiàn)HortScience (2005) 40 1801-1805和表1中列表)。表1是基 于用硝磺草酮和煙嘧磺隆篩選玉米品系(Syngenta，Toulouse, FR)。僅顯示了通過(guò)篩選約 400種品系得到的具有最高耐受性和最高敏感性的品系。表1.對(duì)硝磺草酮或煙嘧磺隆的耐受性和對(duì)硝磺草酮和煙嘧磺隆的敏感性之間存 在廣義相關(guān)性*。
權(quán)利要求
一種植物細(xì)胞，其含有包含與啟動(dòng)子可操作連接的編碼細(xì)胞色素P450或其變體的多核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸序列的表達(dá)，其中所述核酸構(gòu)建體在所述植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致與野生型植物細(xì)胞相比對(duì)除草劑的抗性或耐受性改善，其中所述細(xì)胞色素P450或其變體選自下組a)SEQ ID NO2、4、或6中所示核苷酸序列；b)編碼包含SEQ ID NO1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)與SEQ ID NO2、4、或6的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列；和d)編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQ ID NO1、3、或5中所示氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
2.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述除草劑是HPPD抑制劑。
3.權(quán)利要求2的植物細(xì)胞，其中所述HPPD抑制劑選自下組 a)式la的化合物
4.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述除草劑是選自下組的除草劑類(lèi)型的成員苯并噻 二嗪酮類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶類(lèi)、嘧啶硫代苯甲酸類(lèi)、三唑啉酮類(lèi)、生長(zhǎng)素 類(lèi)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑類(lèi)、光系統(tǒng)II(PSII)抑制劑類(lèi)、原卟啉原氧化酶 (PPO)抑制劑類(lèi)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi)、二硝基苯胺類(lèi)、和乙酰胺類(lèi)。
5.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述苯并噻二嗪酮是苯達(dá)松。
6.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述磺酰脲選自下組煙嘧磺隆、三氟啶磺隆、砜嘧磺 隆、乙基氯嘧磺隆、甲酰胺磺隆、環(huán)氧嘧磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、和甲基苯磺隆。
7.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述咪唑啉酮是甲氧咪草煙。
8.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述三唑并嘧啶選自下組唑嘧磺草胺、雙氯磺草胺、 和氯酯磺草胺。
9.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述生長(zhǎng)素選自下組麥草畏、氨草啶、2，4-D、和胺環(huán) 吡克。
10.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述ACC酶抑制劑選自下組精吡氟禾草靈、唑啉草 酯、炔草酯、和精噁唑禾草靈。
11.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述PSII抑制劑選自下組苯達(dá)松、利谷隆、環(huán)嗪酮、 賽克津、氨唑草酮、和噠草特。
12.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述PDS抑制劑是達(dá)草滅。
13.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述二硝基苯胺是胺硝草。
14.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述乙酰胺選自下組乙草胺和精異丙甲草胺。
15.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述PPO抑制劑選自下組氟丙嘧草酯、氟磺胺草醚、 氟酮唑草、嘧啶肟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、和甲磺草胺。
16.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述除草劑是異噁草酮。
17.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼賦予想要的性狀的 多肽的多核苷酸序列。
18.權(quán)利要求17的植物細(xì)胞，其中所述想要的性狀是對(duì)除草劑的抗性或耐受性。
19.權(quán)利要求18的植物細(xì)胞，其中所述想要的性狀是對(duì)HPPD抑制劑的抗性或耐受性。
20.權(quán)利要求19的植物細(xì)胞，其中賦予想要的性狀的所述多肽是經(jīng)修飾的HPPD。
21.權(quán)利要求18的植物細(xì)胞，其中所述想要的性狀是對(duì)草甘膦的抗性或耐受性。
22.權(quán)利要求21的植物細(xì)胞，其中賦予想要的性狀的所述多肽是賦予對(duì)草甘膦的抗性 的EPSPS (5-烯醇-丙酮酸-莽草酸-3-磷酸-合酶)。
23.權(quán)利要求18的植物細(xì)胞，其中所述想要的性狀是對(duì)草銨膦的抗性或耐受性。
24.權(quán)利要求23的植物細(xì)胞，其中賦予想要的性狀的所述多肽是膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶。
25.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是稻、大麥、馬鈴薯、甘薯、蕓苔、向日 葵、黑麥、燕麥、小麥、玉米、大豆、糖甜菜、煙草、芒屬草(Miscanthus grass)、柳枝稷、紅花、 樹(shù)、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、糖甜菜、和甘蔗植物細(xì)胞。
26.權(quán)利要求1的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是大豆植物細(xì)胞。
27.一種植物、植物部分、或種子，其包含權(quán)利要求1的植物細(xì)胞。
28.一種用于在植物中賦予對(duì)除草劑的抗性的方法，所述方法包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 所述植物，所述構(gòu)建體包含與編碼細(xì)胞色素P450或其變體的多核苷酸序列可操作連接的 能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子，其中所述核酸構(gòu)建體在所述植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致 與野生型植物細(xì)胞相比對(duì)除草劑的抗性或耐受性改善，并使經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物再生，其中所述 細(xì)胞色素P450或其變體選自下組a)SEQ ID NO :2、4、或6中所示核苷酸序列；b)編碼包含SEQID NO :1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)與SEQID NO :2、4、或6的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列；和d)編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQID NO :1、3、或5中所示氨基酸序列具 有至少80%的序列同一性。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述除草劑是HPPD抑制劑。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述除草劑是選自下組的除草劑類(lèi)型的成員苯并噻二 嗪酮類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶類(lèi)、嘧啶硫代苯甲酸類(lèi)、三唑啉酮類(lèi)、生長(zhǎng)素類(lèi)、 乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑類(lèi)、光系統(tǒng)II (PSII)抑制劑類(lèi)、原卟啉原氧化酶(PPO) 抑制劑類(lèi)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi)、二硝基苯胺類(lèi)、和乙酰胺類(lèi)。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼賦予想要的性狀的多肽 的多核苷酸序列。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述想要的性狀是對(duì)除草劑的抗性或耐受性。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述想要的性狀是對(duì)HPPD抑制劑的抗性或耐受性。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述想要的性狀是對(duì)草甘膦的抗性或耐受性。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述想要的性狀是對(duì)草銨膦的抗性或耐受性。
36.權(quán)利要求28的方法，其中所述植物是稻、大麥、馬鈴薯、甘薯、蕓苔、向日葵、黑麥、 燕麥、小麥、玉米、大豆、糖甜菜、煙草、芒屬草、柳枝稷、紅花、樹(shù)、棉花、木薯、番茄、高粱、苜 蓿、糖甜菜、或甘蔗植物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述植物是大豆植物。
38.一種控制所處位置的雜草的方法，所述方法包括向所述位置應(yīng)用雜草控制量的一 種或多種除草劑，其中所述位置包含已經(jīng)用如下核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物，所述構(gòu)建體包含 與編碼細(xì)胞色素P450或其變體的多核苷酸序列可操作連接的能夠驅(qū)動(dòng)植物細(xì)胞中的表達(dá) 的啟動(dòng)子，其中所述細(xì)胞色素P450或其變體選自下組a)SEQ ID NO :2、4、或6中所示核苷酸序列；b)編碼包含SEQID NO :1、3、或5中所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；c)與SEQID NO :2、4、或6的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列；和d)編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQID NO :1、3、或5中所示氨基酸序列具 有至少80%的序列同一性。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述一種或多種除草劑是選自下組HPPD抑制劑類(lèi)、苯并 噻二嗪酮類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、三唑并嘧啶類(lèi)、嘧啶硫代苯甲酸類(lèi)、三唑啉酮類(lèi)、生長(zhǎng) 素類(lèi)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)抑制劑類(lèi)、光系統(tǒng)II (PSII)抑制劑類(lèi)、原卟啉原氧化酶 (PPO)抑制劑類(lèi)、八氫番茄紅素不飽和酶(PDS)抑制劑類(lèi)、二硝基苯胺類(lèi)、和乙酰胺類(lèi)。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼賦予想要的性狀的多肽 的多核苷酸序列。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所想要的性狀是對(duì)選自下組的除草劑的抗性或耐受性 HPPD抑制劑、草甘磷、和草銨膦。
全文摘要
提供了用于將除草劑抗性或耐受性賦予植物、植物細(xì)胞、組織和種子的組合物和方法。組合物包括轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、組織、和種子，它們已經(jīng)單獨(dú)地或者與編碼賦予想要的性狀的多肽的一種或多種附加的核酸分子組合地用編碼賦予除草劑抗性或耐受性的細(xì)胞色素P450或其變體的核酸分子轉(zhuǎn)化。具體地，細(xì)胞色素P450或其變體賦予對(duì)HPPD抑制劑類(lèi)、苯并噻二嗪酮類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、和其它類(lèi)型的除草劑的抗性或耐受性。別的多肽也可以賦予對(duì)除草劑(包括HPPD抑制劑類(lèi)和其它除草劑)的抗性或耐受性。還提供了用于生成和使用本發(fā)明的除草劑抗性或耐受性植物、植物細(xì)胞、組織和種子的方法。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101998988SQ200880101112
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月30日
發(fā)明者伯納德斯·T·M·弗努伊杰, 蒂莫西·R·霍克斯 申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司