除草劑降解酶基因、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種阿特拉津除草劑降解酶基因、含有 上述降解酶基因的工程菌以及上述工程菌的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿特拉津又名莠去津，其是一種三嗪類除草劑。阿特拉津除草劑的大量使用，導(dǎo)致 對土壤、地下水和地表水的污染。阿特拉津?qū)游锏纳彻δ苡绊懸驯蛔C明，且被世界野 生動物基金會列為環(huán)境荷爾蒙（內(nèi)分泌干擾劑）的可疑物質(zhì)，有擾亂內(nèi)分泌的作用，是人 類潛在的致癌物。為了治理和修復(fù)阿特拉津污染的環(huán)境，很多研究人員分離和鑒定了大量 能降解阿特拉津的細菌，可將這些菌主要分為兩類。第一類是假單胞菌屬Pseudomonas，例 如：代表菌株為Pseudomonas sp. ADP，其含有atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF六個降解 基因；第二類是節(jié)桿菌屬Arthrobacter，例如：代表菌株為Arthrobacter sp. TC1，其含有 trzN和atzB、atzC三個降解基因。上述兩類細菌的降解途徑中第一步反應(yīng)都是將有毒的 阿特拉津降解為無毒的羥基阿特拉津?，F(xiàn)有技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)由trzN基因編碼的三嗪水解酶 比atzA基因編碼的阿特拉津氯水解酶具有更廣泛的應(yīng)用性且催化能力更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對阿特拉津除草劑的降解問題，提供一種阿特拉津除草劑降 解酶基因。
[0004] 本發(fā)明的目的可通過以下的技術(shù)措施來實現(xiàn)：
[0005] -種除草劑降解酶基因，其為阿特拉津降解酶的編碼基因，所述除草劑降解酶基 因具有如SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，其為含有上述的除草劑降解酶基因的pET_28b(+) 重組質(zhì)粒。
[0007] 本發(fā)明另外提供了含有上述的除草劑降解酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)〇
[0008] 上述基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0009] 細菌總DNA提取步驟：將保藏號為CGMCC N0. 4165的鹽單胞菌SY-AD-9于LB培養(yǎng) 基中進行培養(yǎng)，收集菌體提取總基因組DNA ;
[0010] 目的基因的PCR擴增步驟：以SEQ ID No :2所示的核苷酸序列為上游引物，以SEQ ID No :3所示的核苷酸序列為下游引物，以所得總基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得如 SEQ ID No :1所示的除草劑降解酶基因片段；
[0011] 構(gòu)建重組質(zhì)粒的步驟：將所得除草劑降解酶基因片段與pET-28b(+)質(zhì)粒依次進 行雙酶切和連接反應(yīng)獲得含有除草劑降解酶基因的pET-28b(+)重組質(zhì)粒；
[0012] 重組菌構(gòu)建步驟：將所述的含有除草劑降解酶基因的pET-28b(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到宿主菌E. coli BL21 (DE3)獲得含有除草劑降解酶基因的基因工程菌E. coli BL21 (DE3)。
[0013] 優(yōu)選地，在目的基因的PCR擴增步驟中的PCR反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)變性10分鐘； 94°C變性1分鐘，66 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，進行30個循環(huán)；72 °C再延伸5分鐘。
[0014] 優(yōu)選地，所述目的基因的PCR擴增步驟之后還包括除草劑降解酶基因片段純化的 步驟。
[0015] 優(yōu)選地，所述重組菌構(gòu)建步驟之后還包括基因工程菌E.coliBL21 (DE3)陽性克隆 篩選的步驟。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述的除草劑降解酶基因以及上述的含有除草劑降解酶基因的 基因工程菌E.coliBL21(DE3)在降解阿特拉津除草劑中的應(yīng)用。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下，本發(fā)明的除草劑降解酶基因來源于一 株高效降解阿特拉津的鹽單胞菌Halomonassp.SY-AD-9,其表達產(chǎn)物三嗪水解酶能夠高效 的降解阿特拉津；本發(fā)明利用上述除草劑降解酶基因構(gòu)建的工程菌能夠高效的表達除草劑 降解酶（三嗪水解酶），能夠應(yīng)用于環(huán)境的生物修復(fù)。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明的工程菌的構(gòu)建方法流程圖。
【具體實施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實施 例對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明， 并不用于限定本發(fā)明。
[0020] 除非另有定義，本發(fā)明使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相 同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員可參考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的 標(biāo)準3字母和/或1字母代碼。
[0021] 盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自 測量中存在的標(biāo)準偏差所致。另外，本發(fā)明公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何 和所有子范圍。例如記載的"1至10"的范圍應(yīng)理解為包含最小值1和最大值10之間（包 含端點）的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為"并入本文"的 參考文獻應(yīng)理解為以其整體并入。
[0022] 另外應(yīng)注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復(fù)數(shù)形式，除非 清楚且明確的限于一個所指對象。術(shù)語"或"可與術(shù)語"和/或"互換使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0023] 術(shù)語"部分"和"片段"可互換的指代多肽、核酸或其他分子構(gòu)建物的一部分。
[0024] 生物材料保藏信息：鹽單胞菌Halomonassp.SY-AD-9已于2010年09月13日保存 于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為0611〇：勵.4165，上述菌株163扣嫩 基因序列的GenBank登錄號為HM627247,上述菌株具有與trzN基因功能相似的能夠?qū)⑻?拉津降解為無毒的羥基阿特拉津的除草劑降解酶基因。
[0025] 為了修復(fù)被高濃度阿特拉津污染的土壤，本發(fā)明克隆了上述的鹽單胞菌 Halomonassp.SY-AD-9菌株的阿特拉津除草劑降解酶基因（類trzN基因）到容易培養(yǎng)且 繁殖速度快的大腸桿菌中，并使目的基因表達，降解污染土壤中的高濃度阿特拉津，以修復(fù) 被高濃度阿特拉津污染的土壤。
[0026] 本發(fā)明的除草劑降解酶基因具有如SEQIDNo:1所示的核苷酸序列。
[0027] 本發(fā)明提供的重組質(zhì)粒為含有上述除草劑降解酶基因的pET_28b(+)重組質(zhì)粒。
[0028] 本發(fā)明的工程菌為含有上述除草劑降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21 (DE3)。
[0029] 如圖1所示，上述工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0030] 細菌總DNA提取步驟：將保藏號為CGMCCN0. 4165的鹽單胞菌SY-AD-9于LB培養(yǎng) 基中進行培養(yǎng)，收集菌體提取總基因組DNA;
[0031] 目的基因的PCR擴增步驟：以SEQIDNo:2所示的核苷酸序列為上游引物，以SEQ IDNo:3所示的核苷酸序列為下游引物，以所得總基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得如 SEQIDNo:1所示的除草劑降解酶基因片段；
[0032] 構(gòu)建重組質(zhì)粒的步驟：將所得除草劑降解酶基因片段與pET_28b(+)質(zhì)粒依次進 行雙酶切和連接反應(yīng)獲得含有除草劑降解酶基因的pET-28b(+)重組質(zhì)粒；
[0033] 重組菌構(gòu)建步驟：將所述的含有除草劑降解酶基因的pET_28b(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 到宿主菌E.coliBL21 (DE3)獲得含有除草劑降解酶基因的基因工程菌E.coliBL21 (DE3)。
[0034] 具體地，本發(fā)明的除草劑降解酶基因來源于一株高效降解阿特拉津的鹽單胞菌 Halomonassp.SY-AD-9,其表達產(chǎn)物三嗪水解酶能夠高效的降解阿特拉津；本發(fā)明利用上 述除草劑降解酶基因構(gòu)建的工程菌能夠高效的表達除草劑降解酶（三嗪水解酶），能夠廣 泛地應(yīng)用于環(huán)境的生物修復(fù)。
[0035]實施例1
[0036]trzN基_DNA片段的擴增與純化
[0037] 第一步，細菌總DNA提取：
[0038] 用天根公司基因組提取試劑盒提取鹽單胞菌Halomonas sp. SY-AD-9菌株的基因 組DNA，作為PCR擴增的模板。
[0039] 第二步，trzN基因DNA片段擴增：
[0040]上游引物：5'-GGAATTCCATATGATCCTGATCCGCG-3'（序列表中SEQIDN0. 2)，其中 包含有限制性內(nèi)切酶Ndel的酶切位點（CATATG);下游引物：5'-CCCAAGCTTCTACAAGTTCTTGG GA-3'（序列表中SEQIDNO. 3)，其中包含有限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切位點（AAGCTT)， 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以鹽單胞菌Halomonassp.SY-AD-9菌株的 基因組DNA為模板，采用上述引物進行PCR擴增，擴增的反應(yīng)條件為：在95°C預(yù)變性10分 鐘，然后以94°C變性1分鐘、66 °C退火30秒、72 °C延伸30秒循環(huán)30次，再在72 °C延伸5分 鐘。體系體積為25y1，配制如表1 :
[0041]表1
[0042]

[0043]PCR反應(yīng)完成后，取3y1反應(yīng)產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果。
[0044] 第三步，PCR擴增產(chǎn)物的純化：
[0045] PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，將目的條帶切下，使用TIANGEN公司的瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化PCR片段，其操作步驟如下：
[0046] 柱平衡：向吸附柱CA2中加入500y1平衡液BL，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CA2重新放回收集管中；
[0047] 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量；
[0048] 向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，當(dāng)回收片段小于150bp或者瓊脂糖濃度大于 2%時，需要使用6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心 管，以確保膠塊充分溶解。如還有未溶的膠塊，可補加一些溶膠液或者繼續(xù)放置幾分鐘，直 至膠塊完全溶解；
[0049] 將上一步所得的溶液加入一個吸附柱CA2中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心 30~60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中；
[0050]向吸附柱CA2中加入600 y 1漂洗液PW(使用前檢查是否加入無水乙醇）， 12000rpm離心30~60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入