魚類病毒性出血性敗血癥病毒g基因的真核表達方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種魚類病毒性出血性敗血癥病毒G基因的真核表達方法，屬于生物 基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 病毒性出血性敗血癥病毒（viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)是引起 鮭鱒魚類和多種海水魚類呈暴發(fā)性流行的烈性傳染病，屬彈狀病毒科，粒外彈狀病毒屬的 成員。病毒基因組從3'端至5'端依次包含N(核蛋白）-P(磷蛋白）-M(基質(zhì)蛋白）-G(糖 蛋白）_NV(非結(jié)構(gòu)蛋白）-L(聚合酶蛋白）6個基因。
[0003] 表面糖蛋白基因G是其重要抗原，也是各類免疫學(xué)檢測試驗優(yōu)選的抗體制備材 料。然而由于不同物種密碼子的偏愛性不同，未經(jīng)改造的野生型G基因在體外表達時往往 不理想，阻礙了VHSVG基因編碼蛋白抗體的獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種魚類病毒性出血性敗血癥病毒G基因主 要抗原域的真核表達方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 在進行真核表達之前，需要對魚類病毒性出血性敗血癥病毒G基因的主要抗原域 的進行預(yù)測。運用NCBIConservedDomains查找工具分析發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列含有 的保守結(jié)構(gòu)域（圖1所示）。利用丹麥科技大學(xué)生物序列分析中心（CBS)網(wǎng)站在線程序 SignalP4. 1對VHSVG蛋白的氨基酸序列作信號肽預(yù)測（圖2所示），并避開信號肽區(qū)域。 采用OptimumAntigen?分析軟件預(yù)測蛋白的優(yōu)勢抗原肽段，應(yīng)用親水性、表面特性、柔韌性 和二級結(jié)構(gòu)4種參數(shù)聯(lián)合的Jameson-Wolf法綜合預(yù)測蛋白的抗原指數(shù)（表1、圖3所示）， 并根據(jù)其結(jié)果選取主要抗原域（Mainantigenicdomains,MAD)4〇-435肽段，命名為GM。
[0007] 本發(fā)明提供的密碼子優(yōu)化后的魚類病毒性出血性敗血癥病毒GM基因序列，序列 如如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供一種含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 進一步的，本發(fā)明提供的魚類病毒性出血性敗血癥病毒G基因的真核表達方法， 其特征在于，包括下列步驟：
[0010] (1)密碼子優(yōu)化的基因合成
[0011] 利用http ://gcua. schoedl. de/服務(wù)器的密碼子分析軟件，分析VHSV-H株基因序 列（GenBank登錄號KJ768664)在昆蟲細胞中的使用頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G基因中有17種密碼 子在昆蟲細胞中使用頻率低于20%。將選取的G基因40-435氨基酸肽段中低頻率密碼子 進行優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列如上所示。
[0012] 同時為便于純化，在40-435氨基酸序列區(qū)域N端加6XHis標(biāo)簽。因此，擬設(shè)計表 達的蛋白序列如下：
[0013]MHHHHHHTPLYTHPSNCREDSFVPIRPAQLRCPHEFEDINKGLVSVPTRIIHLPLSVTSVSAVASGHYL HRVTYRVTCSTSFFGGQTIEKTILEAKLSRQEATNEASKDHEYPFFPEPSCIWMKNNVHKDITHYYKTPKTVSVDLY SRKFLNPDFIEGVCTTSPCQTHWQGVYWVGATPTAHCPTSETLEGHLFTRTHDHRVVKAIVAGHHPffGLTMACTVTF CGTEffIKTDLGDLIQVTGPGGARKLTPKKCVNTDIQMRGATDDFSYLNHLITNMAQRTECLDAHSDITASGKISSFL LSKFRPSHPGPGKAHYLLEGQ頂R⑶CDYEAWSINYNSAQYKTVNNTWKSWKRVNNNTDGYDGMIF⑶KLIIPDIE KYQSVYDSGMLVQRNLVEVPHLSIVF
[0014] 隨后將設(shè)計的40-435氨基酸區(qū)域進行密碼子優(yōu)化的核酸序列，并交由南京金斯 瑞生物技術(shù)有限公司進行基因合成并克隆至PUC57中。
[0015] (2)重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0016] 雙酶切PUC57-GM質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFsatBacdual，酶切產(chǎn)物膠回收后用T4DNA連接 酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細胞。經(jīng)氨芐抗性篩選挑取單菌落，同時進行雙酶切鑒 定，鑒定正確的轉(zhuǎn)移載體命名為pFBd-GM。
[0017] (3)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
[0018] 將重組pFBd-GM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有Bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bac，Bacmid與pFBd-GM 在DHlOBac細胞中發(fā)生同源重組，經(jīng)三抗（慶大霉素7yg/mL、卡那霉素50yg/mL和四環(huán) 素10yg/mL)抗性篩選及藍白斑篩選，挑取白色菌落，重組Bacmid用M13F/M13R通用引物 進行PCR鑒定，擴增條件如下：93°C預(yù)變性3min，94°C30s，55°C45s，72°C5min，30個循環(huán)， 72°C7min。鑒定正確的穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-GM。pFastBacdual質(zhì)粒經(jīng)相同處理得到 rBacmid-N作為陰性對照。
[0019] (4)重組Bacmid的轉(zhuǎn)染及表達產(chǎn)物的分析鑒定
[0020] 用脂質(zhì)體法將重組rBacmid-GM和rBacmid-N分別轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞（9X105個/ mL)，28°C培養(yǎng)，出現(xiàn)細胞病變時收集細胞培養(yǎng)液上清，在sf9細胞上傳3代。用細胞基因組 DNA提取試劑盒提取感染rBacmid-GM和rBacmid-N的細胞的病毒基因組，按照Bac-to-Bac 說明書推薦程序進行PCR鑒定。鑒定正確后，收集轉(zhuǎn)染后第3代細胞培養(yǎng)物，裂解液裂解細 胞后超聲破碎，離心取上清，進行SDS-PAGE電泳，并用相同的方法處理正常sf9細胞作為陰 性對照。將SDS-PAGE電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜，3%BSA進行封閉，1:100稀釋VHSV羊抗陽 性血清，37°C孵育lh，用1:5000稀釋的兔抗羊HRP-IgG(辣根過氧化物酶標(biāo)記）37°C孵育 lh，最后進彳丁顯色鑒定。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] 本發(fā)明對G蛋白采取了B細胞表位多參數(shù)預(yù)測與主要抗原域的截段表達相結(jié)合的 策略，通過密碼子的優(yōu)化和合成基因可以顯著的提高蛋白產(chǎn)量；實現(xiàn)了G蛋白抗原域的在 Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)中的高效表達。經(jīng)Westernblotting對其活性進行初步鑒定分 析證實，該表達蛋白具備免疫原性，這為進一步進行表位疫苗的開發(fā)和VHSV的分子診斷技 術(shù)的建立提供了基礎(chǔ)。
[0023] 本發(fā)明表明利用真核表達系統(tǒng)可獲得與VHSV中G蛋白空間結(jié)構(gòu)更為接近的重組 蛋白，并為進一步開展G基因功能奠定下良好的基礎(chǔ)。
【附圖說明】：
[0024] 圖1是VHSVG蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域⑶D分析結(jié)果。
[0025] 圖2是NeuralNetworks(NN)對VHSVG氨基酸序列的信號肽預(yù)測結(jié)果。
[0026] 圖3是VHSVG蛋白氨基酸序列的抗原指數(shù)分析結(jié)果。
[0027] 圖4是穿梭質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果，M:DNAmarkerDL15000 ;以rBacmid-GM為模板 的PCR產(chǎn)物
[0028] 圖5是重組桿狀病毒細胞破碎后上清Ni柱純化結(jié)果；M:蛋白Marker;1:用鹽酸 胍溶解的沉淀；2:純化后流出；3:20mM咪唑洗脫；4-8 :250mM咪唑洗脫。
[0029]圖 6 是Ni柱純化后Western-blot分析；Ml蛋白Marker(120、80、60、40、30、 20、10) ;M2 蛋白Marker(120、85、60、40、22) ;BSA(2.0yg);純化后G蛋白（1.95yg); VHSV-GM(羊抗血清）。
【具體實施方式】：
[0030] 1材料和方法
[0031] L 1菌株、細胞系與質(zhì)粒
[0032]VHSV-H株由本實驗室分離并保存。E.coliDH5a菌株、pFastBacdual轉(zhuǎn)座質(zhì)粒 以及DHlOBac?CompetentCells感受態(tài)細胞購自南京金斯瑞生物有限公司提供。Sf9昆 蟲細胞由青島蔚藍生物，骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室保存。
[0033] 1. 2試劑
[0034]胎牛血清、CellfectinIIReagent、昆蟲細胞培養(yǎng)基sf900_IISFM、Grace培養(yǎng)基 及Lipofectaminetmreagent購自Gibco公司，RazoalRNA提取試劑盒購自Promega公司； M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA擴增用酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4連接酶和RNA提 取試劑盒購自Promage公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Tiangen公司；6XHis 蛋白質(zhì)純化樹脂Ni-NTA購自QIAGEN公司；兔抗羊HRP-IgG、羊抗鼠HRP-IgG購自Jackson 公司；羊抗鼠FITC-IgG、PEG4000、HAT等購自Sigma公司；BALB/c購自山東大學(xué)實驗動物中 心。VHSV羊抗陽