一種與植物根系性狀相關(guān)的ZmLRT基因及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與植物根系性狀相關(guān)的ZmLRT基因及其 相關(guān)生物材料與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根系是指植物全部根的總稱(chēng)，其中由胚根細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)所形成的向下垂直生 長(zhǎng)的根，是植物體上最早出現(xiàn)的根，稱(chēng)為主根，有時(shí)也稱(chēng)直根或初生根。大多數(shù)裸子植物和 雙子葉植物的主根繼續(xù)生長(zhǎng)，明顯而發(fā)達(dá)。主根生長(zhǎng)達(dá)到一定長(zhǎng)度，在一定部位上側(cè)向地從 內(nèi)部生出許多支根，稱(chēng)為側(cè)根。
[0003] 研究表明，植物細(xì)胞的許多重要功能基因通過(guò)其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)控制根系的形態(tài) 建成和生長(zhǎng)發(fā)育。在擬南芥中，已經(jīng)證實(shí)許多轉(zhuǎn)錄因子基因在根系發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用。 例如ARF、AUX/IAA和HB家族基因參與根系分生組織的形成；NAC1、IAA28和SLR1等基因參 與了側(cè)根的發(fā)生與形成（Montieletal，2004)。在水稻中，已經(jīng)克隆并證實(shí)bHLH基因家族 中的一個(gè)成員（OsRHLl)參與根毛發(fā)育（Dingetal，2009)、LBD基因家族的ARL1基因控制 不定根原基的形成（Liuetal，2005)。最近，玉米中也克隆了一些根系發(fā)育關(guān)鍵基因，例如 不定根發(fā)育基因RTCS(LBD基因家族）和根毛發(fā)育基因（RTH1與RTH3)(Hochholdingeret al，2009)。另外，還有許多結(jié)構(gòu)基因，包括編碼細(xì)胞骨架蛋白的Actin基因，也發(fā)現(xiàn)與根系 生長(zhǎng)發(fā)育有重要關(guān)系（Gillilandetal，2003)。
[0004] 植物microRNA(簡(jiǎn)稱(chēng)miRNA)是一類(lèi)具有調(diào)控作用的、由20~24個(gè)核苷酸組成的 內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其本身不具有開(kāi)放閱讀框（OpenReadingFrame，0RF)，不編碼任 何蛋白質(zhì)，但具有序列保守性、表達(dá)時(shí)序性和組織特異性。在植物中，miRNA通過(guò)與其特異結(jié) 合的靶mRNA相互作用，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、器官發(fā)育、開(kāi)花與育性轉(zhuǎn)換、養(yǎng)分平衡、 激素分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫響應(yīng)以及病原體的反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)途徑中起重要的作 用（Bartel，2004;Sunkaretal，2004;Sunkaretal，2005;Malloryetal，2006;Yaoet al，2007)。miRNA前體序列可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且大部分的miRNA基因來(lái)源于基因間的區(qū) 域或者內(nèi)含子區(qū)域（Jones-Rhoadesetal，2006;Reinhartetal，2002)。另外，microRNA 是一類(lèi)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后對(duì)其介導(dǎo)的靶基因mRNA進(jìn)行特異性剪 切或阻遏革ElmRNA的翻譯來(lái)調(diào)芐基因的表達(dá)（Baumbergeretal，2005;Qietal，2005)。
[0005]miR166廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中。例如，在擬南芥和水稻中，miR166通過(guò)調(diào)節(jié)其革巴基因：同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白（homeodomain-leucinezipper protein，HD_Zip)的表達(dá)調(diào)控其葉、花及根系的生長(zhǎng)發(fā)育（Emeryetal，2003;Williamset al，2005;Jungetal，2007;Hiroshietal，2007)。在苜蓿中，過(guò)量表達(dá)miR166 會(huì)減少側(cè) 根形成（Boualemetal，2008)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA分子。
[0007] 本發(fā)明提供的DNA分子為如下1)或2)或3):
[0008] 1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0009] 2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的cDNA分子或基因組DNA 分子；
[0010] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交的CDNA分子或基因組DNA分 子。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述DNA分子相關(guān)的生物材料。
[0012] 本發(fā)明提供的上述DNA分子相關(guān)的生物材料為下述A1)至A15)中的任一種：
[0013]A1)含有上述DNA分子的表達(dá)盒；
[0014]A2)含有上述DNA分子的重組載體；
[0015]A3)含有上述DNA分子的重組微生物；
[0016]A4)含有上述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0017]A5)含有上述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0018]A6)含有上述DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0019]A7)含有A1)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0020] A8)含有A1)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0021] A9)含有A1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0022] A10)含有A1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0023] All)含有A1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0024]A12)含有A2)所述重組載體的重組微生物；
[0025]A13)含有A2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0026]A14)含有A2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0027]A15)含有A2)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0028] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述DNA分子或上述相關(guān)生物材料的新用途。
[0029] 本發(fā)明提供了上述DNA分子或上述相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物根系性狀中的應(yīng) 用。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述根系性狀為總根長(zhǎng)和/或主根長(zhǎng)和/或根表面積和/或根體積 和/或側(cè)根數(shù)。
[0031] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物根系性狀為減少總根長(zhǎng)和/或減少主根長(zhǎng)和/或減少 根表面積和/或減少根體積和/或減少側(cè)根數(shù)。
[0032] 本發(fā)明還提供了上述DNA分子或上述相關(guān)的生物材料在編碼miR166中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明還提供了上述DNA分子或上述相關(guān)的生物材料在培育總根長(zhǎng)減少和/或主 根長(zhǎng)減少和/或根表面積減少和/或根體積較少和/或側(cè)根數(shù)減少的植物中的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育總根長(zhǎng)減少和/或主根長(zhǎng)減少和/或根表 面積減少和/或根體積較少和/或側(cè)根數(shù)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的培育總根長(zhǎng)減少和/或主根長(zhǎng)減少和/或根表面積減少和/或根體 積較少和/或側(cè)根數(shù)減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將上述DNA分子導(dǎo)入受體植物中，得到 轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下1)-5)中至少一種的性質(zhì)：
[0036] 1)所述轉(zhuǎn)基因植物的主根長(zhǎng)小于所述受體植物；
[0037] 2)所述轉(zhuǎn)基因植物的總根長(zhǎng)小于所述受體植物；
[0038] 3)所述轉(zhuǎn)基因植物的根表面積小于所述受體植物；
[0039] 4)所述轉(zhuǎn)基因植物的根體積小于所述受體植物；
[0040] 5)所述轉(zhuǎn)基因植物的側(cè)根數(shù)小于所述受體植物。
[0041] 上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為 玉米；所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0042] 本發(fā)明通過(guò)正向與反向遺傳學(xué)相結(jié)合的研究策略，篩選并克隆了一個(gè)控制玉米苗 期根系性狀主效QTL(qLRT5-l)區(qū)間內(nèi)的ZmLRT基因。通過(guò)功能預(yù)測(cè)及鑒定結(jié)果表明：ZmLRT基因?yàn)閙iR166的前體之一，在根系中高豐度表達(dá)，將ZmLRT基因在擬南芥和玉米中超表達(dá) 后，可有效抑制側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育，為深入探討玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理積累了新 的數(shù)據(jù)和資料。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為利用分子標(biāo)記umc1019篩選純合近等基因系的結(jié)果。
[0044] 圖2為主效QTLqLRT5_l近等基因系發(fā)芽后第6天的苗期形態(tài)及根系性狀統(tǒng)計(jì)結(jié) 果。圖2A為苗期形態(tài)；圖2B為總根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中表示差異達(dá)到顯著水平 (p〈0. 05) 表示差異達(dá)到極顯著水平（p〈0. 01)。
[0045] 圖3為綜3和87-1苗期根系特異表達(dá)探針組分布。
[0046] 圖4為ZmLRT基因在玉米第5染色體上的定位結(jié)果。
[0047] 圖5為ZmLRT基因在綜3和87-1基因組DNA上的擴(kuò)增結(jié)果及其基因結(jié)構(gòu)。圖5A 為用于基因克隆的特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果；圖5B為候選基因ZmLRT的基因結(jié)構(gòu)；圖5C為根 據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的三對(duì)引物在綜3、87-1基因組DNA上擴(kuò)增的結(jié)果。其中：M為D2000Size Marker;Exon、Intron分別為外顯子和內(nèi)含子。
[0048] 圖6為ZmLRT全長(zhǎng)序列及其包含成熟miR166的核心序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。圖6A 為ZmLRT全長(zhǎng)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；圖6B為包含成熟miR166的核心序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。 紅線標(biāo)注處為成熟microRNA位點(diǎn)。
[0049] 圖7為ZmLRT基因的不同引物在105份自交系（包括綜3、87_1)中的擴(kuò)增結(jié)果。圖 7A為用引物ZmLRT在105份不同自交系基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果；圖7B為用引物ZmLRT-1 對(duì)圖7A中未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的材料進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果。
[0050] 圖8為ZmLRT基因的時(shí)空表達(dá)模式。圖8A為ZmLRT的電子表達(dá)譜；圖8B為ZmLRT 在87-1不同組織器官中的表達(dá)。
[0051] 圖9為miR166在綜3、87-1及雜交種豫玉22以及部分高代重組近交系苗期根系 中的表達(dá)。其