一種以RNA介導(dǎo)的特異性敲除FGF5基因獲得基因編輯綿羊的方法及其專用sgRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，涉及CRISPR/Cas9技術(shù)，具體涉及一種以RNA介導(dǎo) 的特異性敲除FGF5基因獲得基因編輯綿羊的方法及其專用sgRNA。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組操作技術(shù)是近年基于基因組和基因信息技術(shù)發(fā)展起來(lái)的通過(guò)人工設(shè)計(jì)實(shí) 現(xiàn)對(duì)特定基因或基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯的前沿技術(shù)，目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)動(dòng) 物育種和模式動(dòng)物等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在動(dòng)物育種領(lǐng)域，由于傳統(tǒng)育種手段的增產(chǎn)潛力已 經(jīng)發(fā)揮到接近極限，利用高效穩(wěn)定的基因組操作技術(shù)創(chuàng)新育種手段和提升現(xiàn)代動(dòng)物育種效 率和技術(shù)水平，對(duì)于育種新材料的創(chuàng)制和品種培育至關(guān)重要而且極為迫切。
[0003] 近年來(lái)，科學(xué)家們根據(jù)細(xì)菌獲得性免疫的原理，發(fā)明了基于CRISPR/Cas9的基因 組編輯新技術(shù)，不僅大大降低了對(duì)動(dòng)物進(jìn)行基因敲除、基因修飾的難度，更是將動(dòng)物轉(zhuǎn)基因 技術(shù)由傳統(tǒng)的隨機(jī)整合推向了高度精確的基因組定向刪除、突變或插入，開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物生產(chǎn)的新時(shí)代。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個(gè)由核酸和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物，它 對(duì)靶點(diǎn)的識(shí)別依賴于核酸對(duì)核酸的識(shí)別，通過(guò)堿基的互補(bǔ)配對(duì)完成。打靶一個(gè)位點(diǎn)只需要 在原有載體的基礎(chǔ)上替換20-30bp的核苷酸，相當(dāng)于合成一對(duì)引物，構(gòu)建過(guò)程相對(duì)于ZFN和 TALEN更加簡(jiǎn)單快捷，適合規(guī)模化、高通量的組裝。相比ZFN和TALEN，Cas9介導(dǎo)的基因組 編輯其靶標(biāo)序列的特異性決定于一段小的與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的RNA。這種基于堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則的識(shí)別，相比較于蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用要更加穩(wěn)定和簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)一次操 作同時(shí)突變兩個(gè)以上基因或位點(diǎn)，大大提高了基因組編輯技術(shù)效率。
[0004] 由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)中發(fā)揮活性作用的核心部件為SgRNA和蛋白質(zhì)，因此可以 通過(guò)構(gòu)建載體，體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA后，顯微注射動(dòng)物受精卵而獲得打靶動(dòng)物，在整個(gè)打靶過(guò) 程中不存在外源DNA的整合。而且由于mRNA的不穩(wěn)定性，不會(huì)長(zhǎng)期存在生物體內(nèi)，也不會(huì)對(duì) 環(huán)境產(chǎn)生進(jìn)一步影響，因而可以避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因?qū)е碌纳锇踩珕?wèn)題。也就是說(shuō)，CRISPR/ Cas9技術(shù)修飾的是一個(gè)物種自身的基因，采取mRNA或RNA作為基因打靶原材料，沒(méi)有任 何篩選用抗性基因，因而不存在生物安全性問(wèn)題。而且，獲得的最終產(chǎn)品是經(jīng)過(guò)了遺傳修飾 的（通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法定點(diǎn)修飾，因?yàn)檫@個(gè)系統(tǒng)是細(xì)菌里的，所以要靠轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)到 動(dòng)植物中），但終產(chǎn)品里卻可以不包含任何轉(zhuǎn)基因的成分，大大提高了安全性。所以，在目前 動(dòng)植物新品種培育，尤其是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備中，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的打靶系統(tǒng)被研究者廣 為采用。
[0005] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs)是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的多功能肽類生長(zhǎng)因子。FGF5 基因是FGF基因家族中的一員，在毛發(fā)生長(zhǎng)周期中具有重要的調(diào)控作用。有研究表明，F(xiàn)GF5 突變可以導(dǎo)致毛發(fā)生長(zhǎng)周期中生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，從而使毛發(fā)的長(zhǎng)度增加。近年來(lái)的研究表明 FGF5基因可作為影響長(zhǎng)毛兔產(chǎn)毛量潛在的主效基因，并且在狗、貓、羊等動(dòng)物中檢測(cè)FGF5 基因的錯(cuò)義突變、多態(tài)性分析的研究，上述研究表明動(dòng)物的長(zhǎng)毛性狀與FGF5基因的缺失突 變相關(guān)。
[0006] 傳統(tǒng)的綿羊品種培育主要是通過(guò)基于表型選擇的雜交改良等常規(guī)育種技術(shù)，在一 定程度上取得了育種效果。但是常規(guī)育種周期長(zhǎng)、預(yù)見(jiàn)性差、選擇效率低，通過(guò)常規(guī)育種方 法在品種改良上所獲得的遺傳增益日趨平緩，尤其在聚合高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等多個(gè)優(yōu)良性狀 的品種選育方面進(jìn)展不大，培育新品種的難度也越來(lái)越大，而且，在大動(dòng)物基因組上實(shí)現(xiàn)修 飾和改造的成本和技術(shù)要求仍然很高。新型的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)通過(guò)人工設(shè)計(jì) 的核酸酶，既能夠在體內(nèi)基因組的特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)雙鏈斷裂而造成定點(diǎn)突變，也可以在基因 組特定的多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)造成雙鏈斷裂實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段序列的刪除、翻轉(zhuǎn)與重復(fù)，甚至定點(diǎn)的實(shí) 現(xiàn)染色體之間的易位，能夠?qū)崿F(xiàn)一次操作同時(shí)突變兩個(gè)以上基因或位點(diǎn)，大大縮短育種的 時(shí)間，加快育種進(jìn)程，有望實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因重組和聚合，達(dá)到定向選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)動(dòng)物新品種 的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種以RNA介導(dǎo)的特異性敲除FGF5基因獲得基因編輯綿羊 的方法及其專用sgRNA。
[0008] 本發(fā)明提供了一種能夠特異的靶向修飾綿羊FGF5基因的sgRNA(sgRNArcF5-l)，為 序列表的序列4自5'末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5'末 端第2至21位核苷酸的RNA。本發(fā)明的實(shí)施例中，所述sgRNAF(；F5-l具體可為序列表的序列 4所示的RNA。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)編碼所述sgRNAFSF5-l的DNA分子。編碼所述sgRNArcF5_l的DNA分 子具體可為序列表的序列3所示的DNA分子。
[0010] 本發(fā)明還保護(hù)一種能夠特異的靶向修飾綿羊FGF5基因的靶向序列，為序列表的 序列1自5'末端第335至354位核苷酸。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種特異性敲除綿羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的 sgRNA。所述成套核酸分子還可包括Cas9mRNA。所述Cas9mRNA為編碼序列表的序列6所示 Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具體可為具有序列表的序列7自5'末端第7至4278位 核苷酸的RNA，更具體可為序列表的序列7所示的RNA。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)一種特異性敲除綿羊FGF5基因的成套核酸分子，包括所述的DNA分 子。所述成套脫氧核糖核酸分子還可包括編碼Cas9mRNA的DNA分子。所述Cas9mRNA為編碼 序列表的序列6所不Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具體可為具有序列表的序列7自5' 末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具體可為序列表的序列7所示的RNA。編碼Cas9mRNA 的DNA分子具體可為具有序列表的序列5自5'末端第24至4295位核苷酸的DNA分子，更 具體可為序列表的序列5所示的分子。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)一種特異性敲除綿羊FGF5基因的方法，是將所述能夠特異的靶向 修飾綿羊FGF5基因的sgRNA和Cas9mRNA共轉(zhuǎn)染綿羊細(xì)胞，從而敲除綿羊FGF5基因。所述 Cas9mRNA為編碼序列表的序列6所示Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具體可為具有序列 表的序列7自5'末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具體可為序列表的序列7所示的RNA。 所述共轉(zhuǎn)染的方式具體可為共注射。所述綿羊細(xì)胞具體可為綿羊受精卵單細(xì)胞。
[0014] 以上任一所述綿羊FGF5基因可為編碼序列表的序列2所示的蛋白質(zhì)的基因。以 上任一所述綿羊FGF5基因具體可為序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自 5'末端第268至21110位核苷酸所示的DNA分子。
[0015]目前在大動(dòng)物基因組上實(shí)現(xiàn)修飾和改造的成本和技術(shù)要求仍然很高，因此獲得特 異、高效的sgRNA成為綿羊基因組編輯培育的關(guān)鍵。本發(fā)明提供的sgRNA特異性較高且能 夠精確靶向修飾綿羊FGF5基因，實(shí)現(xiàn)基因突變。
[0016] 本發(fā)明中，首次采用CRISPR/Cas9技術(shù)在綿羊受精卵中實(shí)現(xiàn)FGF5基因的精準(zhǔn)修飾 突變并獲得基因編輯綿羊，利用這種方法不僅構(gòu)建步驟簡(jiǎn)單，安全性高，而且大大降低了昂 貴的實(shí)驗(yàn)成本和縮短實(shí)驗(yàn)周期，實(shí)現(xiàn)了綿羊優(yōu)良基因重組和聚合，為綿羊大規(guī)模功能基因 的分析和驗(yàn)證帶來(lái)了希望，也為目前和今后綿羊分子細(xì)胞工程育種提供安全、精準(zhǔn)的新方 法。
[0017] 本發(fā)明中，將sgRNA和Cas9mRNA顯微注射動(dòng)物受精卵，在整個(gè)打靶過(guò)程中不存在 外源DNA的整合，而且由于mRNA的不穩(wěn)定性，不會(huì)長(zhǎng)期存在于生物體內(nèi)，也不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生 進(jìn)一步影響，因而可以避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因?qū)е碌纳锇踩珕?wèn)題。
[0018] 本發(fā)明將新的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)與顯微注射技術(shù)相結(jié)合，不僅使綿羊 打靶效率更高更準(zhǔn)確，而且在一個(gè)世代內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了綿羊雙基因敲除，大大促進(jìn)了綿羊產(chǎn) 肉、產(chǎn)毛雙性能的改良，為綿羊新品種培育提供了更為廣闊的空間和更有效的技術(shù)工具。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為限制性內(nèi)切酶Bbsl酶單酶切px330質(zhì)粒后的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道 M為lkbDNAMarker。
[0020] 圖2為體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物sgRNAFSF5-l和sgRNArcF5-2的凝膠電泳圖；泳道M為RNA Marker,泳道1和2依次為sgRNAF(；F5-l和sgRNAF(；F5-2。
[0021] 圖3為Cas9體外酶切法檢測(cè)FGF5-sgRNA靶點(diǎn)效率的酶切電泳結(jié)果，泳道1和2 分別為sgRNAFSF5-l和sgRNArcF5-2相應(yīng)的酶切電泳結(jié)果，泳道DNA為41 lbp的FGFOTNA片段， 泳道M為DNA Marker。
[0022] 圖4為采用Cas9_F和Cas9_R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳 圖；泳道M為lkb DNA Marker。
[0023] 圖5為Cas9mRNA的凝膠電泳圖；泳道M為RNAMarker。
[0024] 圖6為綿羊胚胎FGF5基因巣式PCR產(chǎn)物和T7EN1酶切的電泳圖；圖6-A中，1F-37F 為試驗(yàn)處理組各個(gè)樣本革E標(biāo)基因FGF5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Con為注射Nuclease-freewater 發(fā)育的囊胚，CK為水對(duì)照，泳道M為150bpDNAMarker;圖6-B中，1F-37F為試驗(yàn)處理組各 個(gè)樣本靶標(biāo)基因FGF5的T7EN1酶切產(chǎn)物，Positive為靶標(biāo)基因FGF5的T7EN1酶切產(chǎn)物， Negative為靶標(biāo)基因FGF5的非T7EN1酶切產(chǎn)物，泳道M為150bpDNAMarker。
[0025] 圖7為突變胚胎的編輯形式；黑色