專利名稱：重組mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合毒素的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的新生血管抑制劑，特別是涉及一種具有抑制新生血 管形成作用的mtVEGF^/MAP30KDEL融合毒素及其編碼基因，與其在制備抗腫瘤、糖尿 病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新生血管形成的疾病藥物中的 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，新生血管抑制劑已受到人們的普遍關(guān)注。研究表明，只要抑制了新生血 管形成或者破壞已有的血管網(wǎng)絡(luò)，就能有效控制并治療腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增 生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病。在新生血管形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (VEGF)及其受體(VEGFR1和VEGFR2)發(fā)揮了關(guān)鍵作用，與腫瘤等多種疾病關(guān)系密 切，尤其是VEGFR2在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，而正常組織幾乎無(wú)法檢測(cè)到。 因此，以VEGFR2為耙點(diǎn)設(shè)計(jì)的融合毒素將能有效破壞新生血管而不損傷正常組織，具 有良好的臨床應(yīng)用前景和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力。
迄今為止，新生血管抑制劑的主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槟[瘤血管靶向藥物。在競(jìng)爭(zhēng)激烈的 世界抗癌藥市場(chǎng)中，針對(duì)VEGFR2設(shè)計(jì)的腫瘤血管靶向藥物近年來(lái)發(fā)展非常迅速，除了 Avastin和Iressa已成功上市外，目前仍有幾十種藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。這些藥 物按作用機(jī)理可分為作兩類 一類是抑制腫瘤血管生成，如Avastin和Iressa，這類 藥物在腫瘤生長(zhǎng)初期具有抑制效果，但對(duì)于發(fā)展到一定程度的腫瘤，只能阻止其進(jìn)一 步增大，不能達(dá)到縮小腫瘤的目的；另一類則是以VEGFR2為靶點(diǎn)的融和毒素，這類藥 物主要通過(guò)直接破壞腫瘤血管來(lái)控制腫瘤生長(zhǎng)，是前者的重要補(bǔ)充。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有II型VEGF受體(Flkl/KDR)特異性，可特異性殺傷新生血 管內(nèi)皮細(xì)胞的融合毒素。
本發(fā)明所提供的具有選擇性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素，名稱為 mtVEGFm/MAP30KDEL，是通過(guò)連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白MAP30的氨基端(N 端)連接tntVEGFm得到的融合蛋白。
所述苦瓜籽核糖體失活蛋白MAP30是本發(fā)明的發(fā)明人從苦瓜籽中獲得的一種分子 量為30kD的核糖體失活蛋白，其氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示，其編碼序列可如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
所述人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子突變體mtVEGFm基因是通過(guò)全基因合成獲得的，其 氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示，其編碼序列可如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
所述連接肽的選擇是多種多樣的，其氨基酸殘基序列可如序列表中的SEQ ID NO: 7所示的多肽，其編碼序列可如序列表中的SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。
為獲得更好的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位效果，所述融合毒素的C-末端還可攜帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定 位信號(hào)KDEL，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ IDNO: 9所示， 其編碼序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
所述連接肽也可替換為其類似物，這些類似物與所述連接肽的差別可以是氨基酸 序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽 包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴 露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)。類 似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氮基酸)的類似物，以及具有非天 然存在的或合成的氨基酸的類似物。
具體來(lái)講，所述融合毒素mtVEGFm/MAP30KDEL，是下述氨基酸殘基序列之一
1) 序列表中的SEQ ID NO: 5;
2) 將序列表中SEQIDNO: 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO: 5由393個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-121位氨基 酸殘基為mtVEGF121;自氨基端第122-126位氨基酸殘基為連接肽序列，自氨基端第 127-389 (263aa)位氨基酸殘基為苦瓜籽核糖體失活蛋白MAP30;自氨基端第390-393 (4aa)位氨基酸殘基為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL。
編碼上述具有破壞新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL的基 因r/^^ /^/鵬"傲Z^U ,是下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO: 6的DNA序列;
2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 5的DNA序列;
3) 與序列表中SEQ ID NO: 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有選擇 性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的核苷酸序列；
4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液在65'C下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO: 6由1179個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1179 位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5'端第 1-363位堿基為mtVEGFm的編碼序列，自5'端第364-378位堿基為連接肽的編碼序 列，自5'端第379-1167位堿基為苦瓜籽核糖體失活蛋白MAP30的編碼序列，自5' 端第1168-1179位堿基為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL的編碼序列。
所述融合毒素mtVEGF^/MAP30KDEL的片段、衍生物和類似物也是本發(fā)明要保護(hù)的， 是指保持本發(fā)明的mtVEGF121/MAP30相同生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片 段、衍生物或類似物可定義為1)由一個(gè)或多個(gè)保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選為 保守性氨基酸殘基)所取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是，也可以不是 由遺傳密碼編碼的；2)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽；3)成熟多 肽與另一個(gè)化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形 成的多肽(如用來(lái)純化此多肽的序列，或是抗體片段或其它抗原配體序列的融合毒 素)，或是將編碼另一個(gè)多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部 分)融合就可以獲得融合多肽的編碼序列，再使該融合多肽的編碼序列獲得表達(dá)，就 可產(chǎn)生融合多肽。所述產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)公知的，包括連接編碼多肽的 編碼序列，從而使它們?cè)谕粋€(gè)讀碼框中，并且使融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動(dòng) 子和終止子。
所述mtVEGFm/MAP30KDEL的類似物與mtVEGF^/MAP30KDEL的差別可以是氨基酸序 列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包 括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露 于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)。類似 物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然 存在的或合成的氨基酸的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明融合毒素的氨基酸殘基序列并不限 于上述例舉的具有代表性的序列。
所述ratVEGF,2yMAP30KDEL融合毒素還可為經(jīng)過(guò)修飾的，或經(jīng)修飾提高了其抗蛋白 水解性能或優(yōu)化了溶解性能的mtVEGF121/MAP30KDEL多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)) 形式包括1)體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式，如乙?；螋然?；2)糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽，這 種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶) 而完成；3)具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的 序列。編碼本發(fā)明mtVEGF121/MAP30KDEL融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形 式。DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是單鏈的或是雙鏈的，也可以是編碼鏈 或非編碼鏈。
本發(fā)明還提供了所述融合毒素多核苷酸的變異體，其編碼與mtVEGF121/MAP30KDEL 有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以 是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體，還可包括取代變異體、缺失變異體 和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是 一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
. 含有本發(fā)明基因/^^^/^/M/^^2^Z的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增/^^W^/廁尸J^SfiZ中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL的方法。
本發(fā)明所提供的融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL的表達(dá)方法，是將所述融合毒素 mtVEGF121/MAP30KDEL基因、該基因變異體或含有融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL基因的 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離純化蛋白， 得到融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL。
所述具有選擇性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL基 因可插入到重組表達(dá)載體中。構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體，可為任意一種指本 領(lǐng)域熟知的可進(jìn)行外源基因表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺 乳動(dòng)物細(xì)胞病毒(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體)。所述載體包括但不限于在細(xì) 菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(AH Rosenberg, et al. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 1987， 56(1) : 125-135); 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(SJ Lee and D Nathans. Proliferin secreted by cultured cells binds to marmose 6-phosphate receptors. J". Biol. Chem. 1988; 263: 3521-3527)和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊?只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定表達(dá)，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要 特征是通常含有復(fù)制點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體還可為包含有Thioredoxin (Trx)突變體編碼 序列的融合表達(dá)載體，可將該載體命名為pET32a載體，其中Trx突變體在蛋白表達(dá) 過(guò)程中能更有效促進(jìn)細(xì)菌胞漿中目的蛋白二硫鍵的形成進(jìn)而促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。
其中，以pET32a為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述具有抑制新生血管作用的融合毒 素基因mtVEGFl21/MAP30KDEL的重組表達(dá)載體為pET32a-mtVEGF121/MAP30KDEL?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有所述具有選擇性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)
胞作用的融合毒素基因mtVEGF121/MAP30KDEL的重組表達(dá)載體，如體外重組DNA技術(shù)， DNA合成技術(shù)禾口體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook， et al Molecular cloing， a Laboratory Manual. Cold spring harbor laboratory. New York, 1989)。所述具有選擇性殺 傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因mtVEGFm/MAP30基因的DNA序列可以有效連 接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。所述啟動(dòng)子可為大腸桿菌 的lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒和其它一些已知的可控制基因在原 核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。所述表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié) 合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，所述表達(dá)載體還可包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞的表型形狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因 以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因等。
所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；高等 真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌；鼠傷寒沙門氏菌的 細(xì)菌細(xì)胞；真核細(xì)胞如酵母、植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9等昆蟲(chóng)細(xì)胞；CH0、 COS、 293 細(xì)胞或Bowes黑色素瘤細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列，將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，長(zhǎng)度通常為10-300個(gè)堿基對(duì)， 作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的長(zhǎng)度約為100-270個(gè)堿 基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子或腺病毒增強(qiáng)子等。
:可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，將重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子， 誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并對(duì)重組蛋白進(jìn)分離純化。
培養(yǎng)含有本發(fā)明具有抑制新生血管作用的融合毒素mtVEGF121/MAP30KDEL編碼基
因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
所述融合毒素mtVEGF2/MAP30KDEL及其編碼基因可用于制備抗腫瘤、糖尿病晚期 眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新生血管形成疾病的藥物，因而本發(fā)明 還提供了一種抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的藥物。
本發(fā)明所提供的抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的 藥物，其活性成分為融合毒素ratVEGF121/MAP30KDEL或其編碼基因。
所述具有抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等作用的融合毒 素mtVEGF12I/MAP30KDEL基因可存在于真核表達(dá)載體中。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促 進(jìn)劑、表面活性劑和吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液或凍干粉劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可 以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物和基因藥物的常規(guī)
劑量，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。本發(fā)明的融合毒素mtVEGFm/MAP30KDEL(給予50u g/mL 融合毒素20u l)能顯著抑制雞胚尿囊膜[CAM]新生血管形成；荷瘤裸鼠試驗(yàn)結(jié)果表明， 在注射劑量為20rag/kg體重時(shí)，融合毒素可明顯延緩腫瘤的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供了一種具有抗新生血管作用的融合毒素mtVEGF12/MAP30KDEL及其編 碼基因。該蛋白是利用重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子mtVEGFm突變體(mtVEGF121)與 來(lái)源于苦瓜籽的核糖體失活蛋白MAP30通過(guò)連接肽連接而成的融合毒素。其中，血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子mtVEGFm作為運(yùn)載工具，可使該融合毒素與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 受體Flkl/KDR特異結(jié)合并內(nèi)化進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后苦瓜籽核糖體失活蛋白MAP30 發(fā)揮其毒素效應(yīng)，殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。其中mtVEGF121 作為靶向分子，通過(guò)與VEGFR2特異結(jié)合，將融合毒素經(jīng)過(guò)胞吞作用帶入腫瘤血管內(nèi) 皮細(xì)胞內(nèi)。與天然型人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF121 (wtVEGF121)功能不同的是， mtVEGFm只有VEGFR2特異性，而失去了與VEGFR1結(jié)合的能力，因此避免了癌癥患者 血液或者腫瘤組織中可溶性VEGFR1對(duì)融合毒素的中和作用以及融合毒素對(duì)于其它表 達(dá)VEGFR1的正常細(xì)胞(如造血干細(xì)胞、單核細(xì)胞等)的殺傷作用，從而保證了融合 毒素對(duì)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的高度特異性，使其更加有效和安全。融合毒素C-末端內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL可增加游離MAP30毒素在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的富集，進(jìn)一步增強(qiáng)融合毒 素的殺傷效果(MAP30毒素可使其中核糖體大亞基的28SrRNA發(fā)生脫腺嘌呤作用，抑 制細(xì)胞蛋白質(zhì)的翻譯，進(jìn)而殺死腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞新生血管)。此外，該融合 毒素的表達(dá)條件簡(jiǎn)單，易于純化，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因而，可以該融合毒素 為活性成分制備抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新 生血管形成的疾病藥物。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為在大腸桿菌中表達(dá)以及經(jīng)純化的Trx-mtVEGF121/MAP30KDEL融合蛋白的12 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖2為純化的mtVEGF121/MAP30KDEL融合蛋白的12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢
測(cè)結(jié)果
9圖3為融合毒素對(duì)雞胚尿囊膜新生血管形成的影響(光鏡觀察) 圖4為對(duì)照組和試驗(yàn)組給藥后不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)曲線
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn) 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell， David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物合成及測(cè)序工作均由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。 實(shí)施例1、融合蛋白Trx-mtVEGF121/MAP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建 用下述方法構(gòu)建具有破壞新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素mtVEGF2/MAP30KDEL 的編碼基因及其原核表達(dá)載體，具體方法包括以下步驟
一、 mtVEGF121G4S全基因合成
ratVEGF,2iG4S全基因(見(jiàn)序列2)由北京奧科公司合成，序列的5'端包含限制性內(nèi) 切酶《/w I酶切位點(diǎn)(GGTACC )和腸激酶識(shí)別位點(diǎn)DDDDK的編碼序列 (GACGACGACGACAAG) ， 3，包含限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(GGATCC)載體為pUC57 (由北京奧科公司提供)。
二、 MAP30KDEL基因的克隆
1、 引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增MAP30與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL融合基因(MAP30KDEL)的引物，并 在上游引物添加限制性內(nèi)切酶5朋WI識(shí)別位點(diǎn)，在下游引物添加限制性內(nèi)切酶7K^ I 識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下
上游引物BamH I—F: 5， -^^7(XgATgTTAACTTCgATTTgTCg，
下游引物Not I—R: 5， -gCggCCgCTCATTACAgTTCATCTTTATTCACAACAgATTCCCC。
2、 苦瓜籽總RNA提取
取市售苦瓜籽于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑 (Invitrogen公司)，4°C、 12000rpm離心10分鐘，取上清，每lmL TRIzol加入氯仿 200ul，劇烈振搖30秒，室溫放置3分鐘，4°C、 12000rpm離心15分鐘，取上層水 相溶液，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4°C、 12000rpm離心10分鐘， 棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇(DEPC水配置)洗滌，放置至沉淀透明后加入適量DEPC 水溶解，-7(TC保存?zhèn)溆谩?br> 3、 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增MAP30KDEL基因
用SuperscMAPt II (Introgen公司)試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作取lug苦 瓜籽總RNA作模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后取5ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板參照下述PCR體系擴(kuò)增MAP30KDEL基因10XPyrobest緩沖液5ul，上、下游引物(BamH I一F、 Not I一R) 各50pmol， 10mM dNTPs lul， Pyrobest DNA聚合酶lul，補(bǔ)水至50 ul。 PCR反應(yīng) 參數(shù)為先94°C 30sec， 55°C 40sec， 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)；然后72"C延伸7 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用天根公司的目的基因純化、回收試劑盒回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，方法與步驟一相同。然后，對(duì)回收、純化的目的基因進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))， 結(jié)果PCR擴(kuò)增的MAP30KDEL基因的大小約為800bp，與預(yù)期大小一致。 4、 MAP30KDEL基因與pEASY-B載體連接
向4ii 1純化的MAP30KDEL基因的PCR擴(kuò)增片段中加入1 u 1 pEASY-B (購(gòu)自北京 全式金生物技術(shù)有限公司)連接混合物，室溫放置5分鐘，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，得到攜帶有MAP30KDEL基因的重組載體，命名為 pEASY-B-MAP30KDEL。常規(guī)方法提取質(zhì)粒。
三、pET32a(+)-mtVEGF121/MAP30KDEL融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
1、 pET32a(+)-MAP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建
① 將載體pET32a(+)(購(gòu)自Novagen)和pEASY-B-MAP30KDEL質(zhì)粒載體用限制性 內(nèi)切酶jfe朋yi和#"1進(jìn)行雙酶切，20u 1反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為5ullOXBuffer 1， lOul質(zhì)粒，lul萬(wàn)a/z^1， lul I，水3ul，混勻，在37。C下酶切2小時(shí)。
② 將pET32a(+)載體和pEASY-B-MAP30KDEL酶切片段切膠混合一起回收，方法參 照天根公司說(shuō)明書(shū)和步驟一。洗脫體積為30ul。
③ pET32a(+)載體與MAP30KDEL片段的連接取26n 1步驟②的洗脫產(chǎn)物，加3 til 10XT4 DNA連接酶緩沖液，lul連接酶，混勻，16。C連接過(guò)夜。
取5 u 1步驟③連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。 ⑤對(duì)轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，方法為取單菌落懸于50"1水中， 99。C裂解10分鐘；50W反應(yīng)體系為于39M1 H20中加入10XTaq緩沖液，lOmM dNTPs，通用擴(kuò)增引物T7promoter (5， -TAATACgACTCACTATAg)和T7 terminator (5， -:TgCTAgTTATTgCTCAgC)各1W， 1W模板，Taq酶;反應(yīng)條件為94°C 3min， 94。C 30sec， 56°C 40sec， 72°C 60sec，共30個(gè)循環(huán)?？蓴U(kuò)增出約900bp DNA片段 的為陽(yáng)性克隆。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆的進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，小量法提質(zhì)粒 (方法與步驟一相同)，用限制性內(nèi)切酶5s/W I和I進(jìn)行雙酶切鑒定，方法同 步驟①，經(jīng)酶切得到約800bp DNA片段的為陽(yáng)性克隆。 3、 pET32-mtVEGF121/MAP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建
①對(duì)質(zhì)粒載體pET32-MAP30KDEL和pUC57-mtVEGF121G4S用限制性內(nèi)切酶fe/z^I和《如1進(jìn)行雙酶切，20ul反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為5ul 10XBuffer 2， 10lU質(zhì)粒， 1 ii 1 I， 1 u 1 5a/i必I，水3 p 1，混勻，在37。C下酶切2小時(shí)。
② 將經(jīng)酶切的pET32-MAP30KDEL和mtVEGFmG4S酶切片段切膠混合一起回收，方 法參照天根公司說(shuō)明書(shū)和步驟一。洗脫體積為30y 1。
③ pET32-MAP30KDEL和ratVEGFmG4S片段的連接取26 n 1步驟②的洗脫產(chǎn)物， 加入3ul 10XT4DNA連接酶緩沖液，1 y 1連接酶，混勻，16'C連接過(guò)夜。
④ 取5 ix 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化菌落的雙酶切鑒定分別取4個(gè)單菌落接種于5mL含有200u g/mL羧芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37'C、 250rpm下培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后，提取質(zhì)粒， 用限制性內(nèi)切酶《p" I和I進(jìn)行雙酶切鑒定，從而獲得攜帶融合毒素 mtVEGF121/MAP30KDEL編碼基因的原核表達(dá)載體，命名為pET32a-mtVEGF121/MAP30KDEL。
實(shí)施例2、融合蛋白mtVEGF121/MAP30KDEL的制備
一、 融合蛋白Trx-mtVEGF^/MAP30KDEL在大腸桿菌中的表達(dá)
1. 將pET32a-mtVEGF121/MAP30KDEL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami B (DE3) pLysS， 在37。C下培養(yǎng)30小時(shí)，篩選陽(yáng)性克隆。
2. 將陽(yáng)性單菌落接種于10mL LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200 ti g/mL，卡那霉 素30ug/mL，四環(huán)素25y g/mL和氯霉素34u g/mL)中，在37°C、 250rpm條件下培 養(yǎng)過(guò)夜。
3. 將10mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至1L LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200ixg/mL，卡 那霉素30tig/mL，四環(huán)素25ug/mL和氯霉素34yg/mL)中，在37°C、 250rpm條件 下培養(yǎng)至0D6。。^0. 6 (約6小時(shí))。
4. 加入IPTG至終濃度為0. lmM (加入1M IPTG溶液100 u 1)，在23°C、 250rpm 條件下繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜；培養(yǎng)結(jié)束后，6000rmp離心5分鐘收獲細(xì)菌。
5. 將細(xì)菌沉淀重懸于40mL 10mM Tris* HC1 (pH 8.0)中，冰浴中超聲破碎(功 率300W，每次5秒，間隔5秒，共50次)，在4。C、 12000rpm下離心30分鐘，收集 上清。
二、 融合蛋白Trx-mtVEGFm/MAP30KDEL的純化
1、用Ni-NTA親和柱純化Trx-mtVEGF121/MAP30KDEL融合蛋白
① 用5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(10mM Tris' HC1， pH8. 0， 300mM NaCl， 10mM 咪唑)平衡鎳柱(購(gòu)自Qiagen公司)。
② 將細(xì)胞粗提液緩慢上柱，流速約0. 5mL/min;用10倍柱床體積的洗液(10mMTris* HC1， pH8.0， 300mM NaCl， 20mM咪唑)洗脫雜蛋白。
③用含有300raM NaCl， 250mM咪唑的lOmM Tris' HC1 (p朋.0)洗脫目的蛋白， 收集3倍柱床體積的洗脫液。同時(shí)取樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如 圖l所示(泳道M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，泳道l為誘導(dǎo)前，泳道2為誘導(dǎo)后，泳道 3為裂解上清，泳道4為裂解沉淀，泳道5為上樣流出液，泳道6為純化的融合蛋白)。
三、 融合蛋白的切割及Trx標(biāo)簽的去除
按每50單位腸激酶(rEK)裂解10毫克步驟二純化的Trx-mtVEGF121/MAP30KDEL 融合蛋白，室溫消化過(guò)夜。
四、 mtVEGF12/MAP30KDEL的進(jìn)一步純化
用Blue S印harose 6 FF親和層析純化mtVEGF121/MAP30KDEL蛋白，具體方法包括
以下步驟
① 上柱用5倍柱床體積的20mM Tris' HC1 (pH7. 4) ， 50mM NaCl緩沖液平衡 凝膠柱，將步驟4酶切產(chǎn)物緩慢上柱，流速約為0.5mL/min。
② 洗柱用10倍柱床體積的20mM Tris* HC1 (pH7. 4) ， 150mM NaCl緩沖液洗 脫雜蛋白。
③ 洗脫洗脫液為20raM Tris* HC1 (pH7. 4) ， 2M NaCl，收集2個(gè)柱床體積。
透析或凝膠過(guò)濾置換緩沖液lOmM Tris* HC1 (pH7. 4) ， 150mM NaCl。
用腸激酶消化去除組氨酸標(biāo)簽，并經(jīng)Blue S印harose 6 FF柱(購(gòu)自GE公司) 純化。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示(泳道M為低分子 量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，泳道l為經(jīng)純化的mtVEGFm/MAP30KDEL融合蛋白)，得到了高純度的 分子量為43KD的目的蛋白mtVEGF121/MAP30KDEL。
實(shí)施例3、融合毒素對(duì)雞胚尿囊膜[CAM]新生血管形成的影響 取繁殖場(chǎng)孵化的9天齡受精雞卵，在照卵燈下尋找胚頭右下方血管稀少區(qū)(約胚頭 右下方0.5-l厘米處)，劃定1厘米X1厘米開(kāi)窗位置，在雞胚氣室端鉆l毫米小孔并穿 透殼膜。用75%乙醇消毒開(kāi)窗部位，用手術(shù)剪輕輕揭去蛋殼及殼膜，暴露出雞胚尿囊 膜，將甲基纖維素碟輕輕放置于尿囊膜上血管較少的部位，用微量進(jìn)樣器將濃度分別 為50pg/mL的融合毒素mtVEGF^/MAP30KDEL 20pl滴入甲基纖維素碟中，陽(yáng)性對(duì)照組加 入200ng bFGF，用無(wú)菌透明膠帶封窗后放入孵化箱，37"C繼續(xù)孵育，3天后揭去透明 膠帶，加入甲醇、丙酮等量混合固定液，在室溫下固定15 min,待絨毛尿囊膜血管中 的血液凝固后，以纖維素小碟為中心剪下直徑約3 cm的尿囊膜，放入盛有水的平皿內(nèi) 展開(kāi)，然后平鋪于濾紙上，在解剖顯微鏡下觀察用藥區(qū)血管形成情況，結(jié)果如圖3所
13示，與對(duì)照組相比，在本發(fā)明融合毒素mtVEGF^/MAP30KDEL的作用下，雞胚尿囊膜[CAM] 新生血管的形成受到明顯抑制。
實(shí)施例4、 mtVEGF121/MAP30KDEL的抑瘤實(shí)驗(yàn)
取5周齡Balb/c裸鼠，雌性，體重為18-20g，隨機(jī)分為2組，每組5只。體外 培養(yǎng)A375M細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心)，每只裸鼠注射5乂105人黑色素瘤 A375M癌細(xì)胞，把接種腫瘤細(xì)胞的當(dāng)天定為第一天，分別在第5、 7、 9、 10、 11天經(jīng) 尾靜脈注射給藥，mtVEGFm/MAP30KDEL劑量為20mg/kg體重，并以注射相同體積的生 理鹽水(saline)為對(duì)照。在不同時(shí)間測(cè)量對(duì)照組和試驗(yàn)組(mtVEGF121/MAP30KDEL)小 鼠腫瘤的大小，根據(jù)每組小鼠腫瘤大小的平均值繪出對(duì)照組(saline)和試驗(yàn)組 (mtVEGF^/MAP30KDEL)給藥后不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)曲線，生長(zhǎng)曲線如圖4所示，顯示 融合毒素ratVEGF121/MAP30KDEL對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。<formula>formula see original document page 15</formula><213> 人屬人5"邵ie/LS)
<400〉 2
ggtaccgacg acgacgacaa ggcaccgatg gcagaaggag gagggcagaa tcatcacgaa 60
gtggtgaagt tcatggatgt ctatcagcgc agctactgcc atccaatcga gaccctggtg 120
gacatcttcc aggagtaccc tgatgagatc gagtacatct tcaagccatc ctgtgtgccc 180
ctgatgcgat gcgggggctg ctgcaatagc gagatg卿g agtgtgtgcc cactgaggag 240
tccaacatca ccatgcagat tatgcggatc aaacctcacc aaggccagca cataggagag 300
atgagcttcc tacagcacaa caaatgtgaa tgcagaccaa agaaagatag agcaagacaa 360
gaaaaatgtg acaagccgag gcggggtggc ggtggatcc 399
<210> 3 <211〉 265 <212〉 PRT
<213> 葫戸禾斗苦瓜(#。/z 。Wc<3 c力sr朋"3) <400〉 3
Gly Thr Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr
15 10 15
Thr Lys Phe lie Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys
20 25 30
Val Tyr Asp lie Pro Leu Leu Tyr Ser Thr lie Ser Asp Ser Arg Arg
35 40 45
Phe lie Leu Leu Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr lie Ser Val
50 55 60
Ala lie Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp 65 70 75 80
Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn lie Leu
85 90 95
Phe Lys Gly Thr Arg Lys lie Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu
100 105 110
Asn Leu Gin Thr Ala Ala His Lys lie Arg Glu Asn lie Asp Leu Gly115 120 125
Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala lie Thr Thr Leu Phe Tyr
130 135 140
Gin Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu lie Gin Thr 145 150 155
Ala Ala Arg Phe Lys Tyr lie Glu Arg His Val Ala Lys
165 170 Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala lie lie Ser Leu Glu
180 185 Ser Ala Leu Ser Lys Gin lie Phe Leu Ala Gin Asn Gin 195 200 205
Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu lie Lys Pro Thr Gly Glu
210 215 220
Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly Asn lie 225 230 235
Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn Phe lie
245 250 Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Asn 260 265
<210〉 4 <211> 809 〈212〉 DNA
<213> 葫戶禾斗苦瓜(ifo邁oro7ca c力ara/2".s)
〈400〉 4
ggatccgatg ttaacttcga tttgtcgact gccactgcaa aaacctacac aaaatttatc GO
gaagatttca gggcgactct tccatttagc cataaagtgt atgatatacc tctactgtat 120
tccactattt ccgactccag acgtttcata ctcctcaatc tcacaagtta tgcatatgaa 180
accatctcgg tggccataga tgtgacgaac gtttatgttg tggcctatcg cacccgcgat 240
gtatcctact tttttaaaga atctcctcct gaagcttata acatcctatt caaaggtacg 300
cggaaaatta cactgccata taccggtaat tatgaaaatc ttcaaactgc tgcacacaaa 360
ataagagaga atattgatct tggactccct gccttgagta gtgccattac cacattgttt 420
tattacaatg cccaatctgc tccttctgca ttgcttgtac taatccagac gactgcagaa 480
17
Tyr Asn Ala
Thr Ala Glu 160
Tyr Val Ala 175
Asn Gin Trp 190
Gly Gly Lys
Arg Phe Gin
Lys Leu Leu 240
Thr Thr Met 255gctgcaagat ccaaatctag ttggcgcaga gaacggtttc ctgaactcca
ttaagtatat cgagcgacac gttgctaagt atgttgccac taactttaag ccatcataag cttggaaaat caatggtctg ctctctccaa acaaatattt atcaaggagg aaaatttaga aatcctgtcg eLCcttataaa accteiccggg aagtaaccaa tgttgattca gatgttgtaa aaggtaatat caaactcctg gagctagcac tgctgatgaa aactttatca caaccatgac tctacttggg
540 600 660 720 780
gaatctgttg
tga_attaatg agcggccgc
<210> 5
<211〉 430
<212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220〉 <223>
〈400〉 5
Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin
15 10 15
Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gin Arg Ser Tyr
20 25 30
Cys His Pro lie Glu Thr Leu Val Asp lie Phe Gin Glu Tyr Pro Asp
35 40 45
Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys
50 55 60
Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Met Arg Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu 65 70 75 80
Ser Asn lie Thr Met Gin lie Met Arg lie Lys Pro His Gin Gly Gin
85 90 95
His lie Gly Glu Met Ser Phe Leu Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg
100 105 110
Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gin Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg
115 120 125
Gly Gly Gly Phe Leu Gly lie Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys130
Phe Gly Lys Ala Phe 145
Leu Gly
135
Gly Glu lie Met
Val 150
Asn Phe Asp Leu
Tyr Thr Lys Val
Ser Asp Val 165
Lys Phe lie Glu Asp Phe 180
Asp lie Pro Leu
140
Asn Ser Gly Gly 155
Thr Ala Thr Ala
Ser 170
Ala Thr Leu Pro
Tyr 195
lie Leu Leu Asn
Arg 185
Tyr Ser Thr lie
Arg Phe 210
Val Ala lie Asp Val Thr 225 230 Asp Val Ser Tyr .Phe Phe
Leu 200
Thr Ser Tyr Ala
Leu 215
Asn Val Tyr Val
Tyr 220 Ala
Ser 205 Glu
Tyr
Tyr .Phe 245
Leu Phe Lys Gly Thr Arg 260
Gin Thr Ala Ala
Lys Glu Ser Lys
Val 235
Pro Glu Ala
Glu Asn Leu 275
Pro Ala Leu Ser
Gly Leu 290
Ala Gin Ser Ala Pro 305
Glu Ala Ala
lie
His 280 Ala
Pro 250
Leu Pro Tyr Thr
Thr 265
Lys lie Arg Glu
Ser 295
Ala Leu Leu Val
Asn 285 Phe
Phe 190 Asp
Thr
Arg
Tyr
Gly 270 lie
Tyr
Arg Phe 325
Ala Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu 340
Leu Ser Lys Gin
Ser Ala Leu Leu Val Leu 310 315 Lys Tyr lie Glu Arg His
lie Thr Thr Leu 300
lie Gin Thr
Gly Phe 160 Lys Thr 175
Ser His
Ser Arg
lie Ser
Thr Arg 240 Asn lie 255
Asn Tyr Asp Leu Tyr Asn
Thr Ala 320
Arg His Val Ala Lys Tyr Val 330 335 lie lie Ser Leu Glu Asn Gin
Trp Ser Ala 355
Arg Asn Pro Val
Ala 345
Phe Leu Ala Gin
lie 360
Leu lie Lys
lie Ser Leu Glu 350 Gin
Lys Phe Arg Asn Pro Val Asp 370 375 Gin Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val
Pro Thr 380 Lys Gly
Gly Gly Glu Arg Phe Asn lie Lys Leu
Asn 365 Gly
19<formula>formula see original document page 20</formula>1269
〈210> 7
<211〉 5
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
<400〉 7
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
<210〉 8
〈211〉 15
<212> 腿 <213>人工序列
<220> 〈223〉
<400> 8
ggcggtggcg geitcc 15
<210> 9
<211> 4
<212〉 PRT
〈213〉 人屬人(Zfo膨5"柳.e/ 50
<400> 9
Lys Asp Glu Leu
1<210> 10 <211> 12 <212〉 DNA
<213〉 人屬人(/fo/ffo sapj'e/2s) <400> 10
aaagatgaac tg 1權(quán)利要求
1、具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素，是通過(guò)連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白MAP30的氨基端連接mtVEGF121得到的融合蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合毒素，其特征在于所述連接肽的氨基酸殘基序 列如序列表中SEQ ID NO: 7所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合毒素，其特征在于所述融合毒素是下述氨基酸殘基序列之一1) 序列表中的SEQ ID NO: 5;2) 將序列表中SEQIDNO: 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有選擇性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的融合毒素，其特征在于所述融合毒素的C-末端還攜帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸殘基序列如序列表中 SEQ ID NO: 9所示，其編碼序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
5、 編碼權(quán)利要求1或2或3或4所述的具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合 毒素的基因。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 6的DNA序列;2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 5的DNA序列;.3)與序列表中SEQ ID NO: 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有選擇 性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
7、 含有權(quán)利要求5或6所述具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因的 表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
8、 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素的表達(dá) 方法，是將權(quán)利要求5或6所述具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因、該 基因變異體或含有所述具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因的重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離純化蛋白，得到具 有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素；所述含有具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用 的融合毒素基因的表達(dá)載體為pET32-mtVEGF121/MAP30KDEL。
9、 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素在制備抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新生血管形成的 疾病藥物中的應(yīng)用。
10、權(quán)利要求5或6所述的具有殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素的編碼基 因在制備抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新生血管 形成的疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有選擇性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素與應(yīng)用。該融合毒素是通過(guò)連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白MAP30的氨基端連接mtVEGF₁₂₁得到的融合蛋白。mtVEGF₁₂₁作為運(yùn)載工具，可使該融合毒素與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體F1k1/KDR特異結(jié)合并內(nèi)化進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后MAP30發(fā)揮其毒素效應(yīng)，殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞新生血管。該融合毒素的表達(dá)條件簡(jiǎn)單，易于純化，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因而，可以該融合毒素為活性成分制備成抗腫瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種涉及新生血管形成疾病的藥物。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101434657SQ200810238848
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者周滿祥, 孫紅琰, 申云飛 申請(qǐng)人:山西康寶生物制品股份有限公司;周滿祥;孫紅琰