專利名稱：：一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類功能性的聚乳酸降解酶，尤其涉及一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：聚乳酸是在人們對(duì)環(huán)境和能源可持續(xù)發(fā)展的要求下應(yīng)運(yùn)而生的一種可降解塑料，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在醫(yī)療、紡織和包裝產(chǎn)業(yè)中的大量應(yīng)用，成為最具潛力的替代現(xiàn)有塑料的高分子材料。雖然聚乳酸具有可降解性能，但它在自然界中的降解過程比較緩慢，快速完全降解存在一定困難，因此在使用聚乳酸產(chǎn)品的同時(shí)，需要開發(fā)聚乳酸的降解菌株和降解酶類來加速聚乳酸廢棄產(chǎn)品的降解與回收，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)廢棄物處理回收系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的物料循環(huán)，進(jìn)一步推動(dòng)聚乳酸產(chǎn)品代替現(xiàn)有塑料。由于聚乳酸是一種新興的非天然存在的人工合成化合物，對(duì)其的生物酶法降解必定是由生物體內(nèi)己有的酶類來實(shí)現(xiàn)的，因此聚乳酸降解微生物和高效降解酶類都有一定的特殊性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)某些來源于微生物的特定酶類對(duì)聚乳酸具有降解作用，但這些酶的分離純化和性質(zhì)研究目前均很有限。所以，研究和開發(fā)具有微生物的聚乳酸降解酶具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，更具體地說是來源于無枝酸菌屬04myco/a")和擬無枝酸菌屬(^m;;co/ato/w/力的三種具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶——降解酶I(尸/ame7)、降解酶II(尸to"5")和降解酶III(尸/awe3);同時(shí)本發(fā)明還提供了所述聚乳酸降解酶及其制品在聚乳酸產(chǎn)品循環(huán)利用及其垃圾處理中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶由無枝酸菌屬和擬無枝酸菌屬的菌種通過菌株發(fā)酵而獲得，或由該類菌種的基因在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)而獲得。本發(fā)明所述的一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶為上述產(chǎn)酶菌株或由重組菌所產(chǎn)的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的任一蛋白組分。本發(fā)明的一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III;其中聚乳酸降解酶I包含含有N-末端氨基酸序列為IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶II包含具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶III包含具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是所述聚乳酸降解酶具有SEQIDNO:3序列1-241位、30-241位氨基酸或SEQIDNO:4的1-176位氨基酸。信息學(xué)分析顯示序列中具有絲氨酸蛋白酶保守的三聯(lián)體位點(diǎn)。酶的N端測(cè)序結(jié)果顯示三種酶的N端分別為IVGGGTAPTVSWGAQ、IVGGGNATQVYSFMV和YDVRGGDAYYINNSS，將此序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與蛋白酶類同源性最高。上述編碼聚乳酸降解酶II的核苷酸序列/^"w么它包含顯示于SEQIDNO:l中的3核苷酸序列或者含有與此序列至少80%同源性的核苷酸序列。上述編碼聚乳酸降解酶ni的核苷酸序列p/"cw",它包含顯示于SEQIDNO:2中的核苷酸序列或者含有與此序列至少80%同源性的核苷酸序列。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述SEQIDNO:l和SEQIDNO:2中的序列應(yīng)是新的，SEQIDNO:l與Sacc/wra;w/worae^^meaNRRL2338菌分泌的secretedtrypsin-Ukeserineprotease具有79%的一致性，SEQIDNO:2與Sacx/zara/w/j^/wraeo^raeaNRRL2338菌的serineproteaseprecursor具有70%的一致性。其中涉及的核苷酸序列p/ao^2，長度是726bp，共編碼241個(gè)氨基酸殘基，其中的l-87bp編碼聚乳酸降解酶II的信號(hào)肽序列，88-723為成熟肽編碼序列；p&o^長度為531bp，編碼聚乳酸降解酶III176個(gè)氨基酸殘基的成熟肽序列。本發(fā)明所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的酶學(xué)特征本發(fā)明所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，在SDS-PAGE測(cè)定時(shí)，為分子量在18.0-35.0kDa之間的任一聚乳酸降解酶組分。本發(fā)明所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶為等電點(diǎn)^9.卜10.0的堿性蛋白質(zhì)。進(jìn)一步的，所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶在SDS-PAGE測(cè)定時(shí)，聚乳酸降解酶I的分子量為24.0kD，聚乳酸降解酶II的分子量為19.5kD,聚乳酸降解酶III的分子量為18.0kDa;所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的等電點(diǎn)均為堿性；所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶對(duì)聚乳酸、蛋白質(zhì)或小肽底物如N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ni加anilide、N-succinyl隱Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide或N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide均有降解活性，聚乳酸降解酶II還具有微弱的酯酶活性，但在N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide上沒有活性；所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的蛋白酶活性和聚乳酸降解活性均受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的強(qiáng)烈抑制，但不受胃蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑的抑制。本發(fā)明所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶及其制品在聚乳酸產(chǎn)品循環(huán)利用及其垃圾處理中的應(yīng)用。其中降解聚乳酸的最適酶反應(yīng)溫度在pH7條件下為5CTC-6(TC;最適酶反應(yīng)pH在最適酶反應(yīng)溫度條件下為pH9.5-10.5，聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III在最適酶反應(yīng)條件下在5(TC和60'C，聚乳酸降解酶II在4(TC和5(TC時(shí)溫度穩(wěn)定性較好，保溫8小時(shí)后殘余酶活仍為原酶活的80%左右，在同樣條件下三種酶在pH7-9之間pH穩(wěn)定性較好(詳見具體實(shí)施例)。其他的，所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶作為有效功能組分還可以在制備去污劑、化妝品中應(yīng)用以及在皮革加工中應(yīng)用。具體的，如應(yīng)用有效量的本發(fā)明所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶和制劑上可接受的載體或輔料制備具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶制劑；其中所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶是指具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶單一組分或多組分的純酶制品和/或粗酶制品，和/或任一具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶組分的發(fā)酵液。生產(chǎn)上述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶和制備相應(yīng)基因的方法。為了分離本發(fā)明的聚乳酸降解酶，首先將產(chǎn)酶菌株(^T^CO/flto/^&OhMtofc)在好氧條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所說的培養(yǎng)基包含可同化的碳源和氮源及其它必須營養(yǎng)物，按現(xiàn)有技術(shù)組成，其中優(yōu)選的是以葡萄糖為碳源，明膠或蛋白胨為有機(jī)氮源。在培養(yǎng)之后，分離菌體沉淀和上清液，濃縮上清液，然后進(jìn)行樹脂純化。在優(yōu)選的實(shí)施例中，使用pH7.0磷酸緩沖液處理的CMSepharoseFastFlow陽離子交換樹脂、Phenyl-5PW疏水介質(zhì)及SephadexG-50fine凝膠過濾介質(zhì)進(jìn)行純化，最后在純化的聚乳酸降解酶純品中任選地加入防腐劑。詳見具體實(shí)施例。制備上述編碼聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的核苷酸序列的方法，步驟如下1.利用CTAB/NaCl法提取爿wyco/ato戸h的基因組DNA,2.將聚乳酸降解酶的電泳條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，進(jìn)行蛋白的N端測(cè)序，3.根據(jù)測(cè)序結(jié)果及蛋白酶保守的絲氨酸活性位點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，利用PCR技術(shù)克隆編碼聚乳酸降解酶的基因的一部分，4.再根據(jù)獲得的部分基因設(shè)計(jì)引物，利用SEFA-PCR染色體步移技術(shù)克隆已知基因的上下游序列，測(cè)序后進(jìn)行拼接校對(duì)，在其中得到了含有編碼序列的開放閱讀框架，5.根據(jù)開放閱讀框架的兩端設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從基因組DNA中克隆該基因并測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證明克隆到的基因序列與利用PCR和SEFA-PCR技術(shù)克隆到的基因序列完全正確。根據(jù)上述基因制備方法，分別得到了編碼聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III的基因p/"(xse2和//a^ye3。本發(fā)明提供的編碼聚乳酸降解酶的基因信息，為本領(lǐng)域人員利用熟知的常規(guī)DNA重組技術(shù)將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，生產(chǎn)相應(yīng)的聚乳酸降解酶提供了信息。本發(fā)明涉及的聚乳酸降解菌株和聚乳酸降解酶，對(duì)蛋白質(zhì)及小肽類物質(zhì)具有降解作用，因此可應(yīng)用于傳統(tǒng)的蛋白酶工業(yè)，而且發(fā)明涉及的聚乳酸降解酶具有特殊的聚乳酸降解活性，因此可應(yīng)用于聚乳酸產(chǎn)品的回收與循環(huán)加工工業(yè)，另外，根據(jù)上述聚乳酸降解酶的廣底物特異性，本發(fā)明還可應(yīng)用在含有聚乳酸廢棄物及毛發(fā)、角質(zhì)等蛋白類物質(zhì)的混合垃圾的處理上。圖1.菌株在聚乳酸唯一碳源平板上生長且形成透明水解圈的情況圖2.粗酶液與三個(gè)純聚乳酸降解酶組分的SDS-PAGE圖譜。其中l(wèi)，粗酶液；M，分子量marker;2，聚乳酸降解酶I;3，聚乳酸降解酶II;4，聚乳酸降解酶III。圖3.聚乳酸降解酶分離純化的流程圖。其中PLAaseI代表聚乳酸降解酶I;PLAaseII代表聚乳酸降解酶II;PLAaseIII代表聚乳酸降解酶III。圖4.聚乳酸降解酶MALDI-TOF分析的肽指紋圖譜。其中A，聚乳酸降解酶I的肽指紋圖譜；B，聚乳酸降解酶II的肽指紋圖譜；C，聚乳酸降解酶III的肽指紋圖譜。具體實(shí)施例方式借助下列實(shí)施例更詳細(xì)的說明本發(fā)明，但顯然，本發(fā)明的范圍不受限于這些實(shí)施例。實(shí)施例l降解菌株的篩選將活化的東方擬無枝酸菌菌種(菌種庫，市售)、環(huán)境樣品富集液點(diǎn)種或涂布于PLA乳化平板上，3(TC恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，15-30天觀察菌株的生長和透明水解圈的形成情況，篩選能夠在平板上生長并形成明顯透明水解圈的菌株。為防止水分蒸發(fā)，定期補(bǔ)水，保持潮濕的環(huán)境。篩選培養(yǎng)基成分及制作方法如下基本培養(yǎng)基250mg酵母膏，lg(NH4)2S04,100mgNaCl，200mgMgSO4'7H2O,20mgCaCl2.2H20,10mgFeS04'7H20,0.5mgNa2Mo04.2H20,0.5mgNa2W04，0.5mgMnS04,1.6gK2HP04,0.2gKH2PO4蒸餾水定容至1L，自然pH。PLA乳化平板的制備O.lgPLA粉末溶于2ml三氯甲垸中，將所得溶液與100ml含有0.1。/。PlysurfA210G的基本培養(yǎng)基混合，混合液經(jīng)超聲波處理，制得PLA乳化液，75'C加熱60min左右去除三氯甲烷，得到含PLA的乳化培養(yǎng)基，加入1.5%瓊脂制得乳化平板。經(jīng)篩選獲得了對(duì)聚乳酸具有高效降解能力的菌株東方擬無枝酸菌，菌株在聚乳酸唯-碳源平板上生長且形成透明水解圈的情況見圖l。實(shí)施例2酶的純化X，coto印^on'e"tofc采用3L的GBCS-5型生物發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基為10g明膠，10g葡萄糖，2g酵母膏，5gNaCl，1.6gK2HP04，0.2gKH2P04，0.5gMgS04定容至1L蒸餾水中。發(fā)酵液離心取上清得到的粗酶液，超濾濃縮后，經(jīng)過CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析，TSK-gelphenyl-5PW疏水層析，SephadexG-50fine分子篩層析進(jìn)行分離純化。具體地說，濃縮粗酶液用含10mMNaCl，pH7.0的20mM磷酸緩沖液透析除鹽，進(jìn)行CMSepharoseFastFlow層析，電泳結(jié)果顯示所得酶組分尚未分純，將三個(gè)洗脫峰分別收集，并進(jìn)行下一步分離。用硫酸銨調(diào)節(jié)上述洗脫峰收集液的鹽濃度，進(jìn)行TSK-gelphenyl-5PW疏水層析，硫酸銨梯度遞降洗脫，分別透析層析后的蛋白峰收集液，測(cè)定其PLA降解活性。將活性蛋白TCA沉淀后進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果顯示，其中兩個(gè)活性蛋白組分已經(jīng)達(dá)到了電泳純，將其分別命名為聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶m，而另一活性部分仍然還有部分小分子蛋白雜帶，因此，將此活性部分收集進(jìn)行SephadexG-50fine分子篩層析，得到了純酶組分，命名為聚乳酸降解酶I。綜上所述，經(jīng)過CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析，TSK-gelphenyl-5PW疏水層析和分子篩層析，獲得了三個(gè)純酶組分，分別命名為聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶ii和聚乳酸降解酶in。粗酶液與三個(gè)純酶組分的電泳圖譜如附圖2所示，分離純化的流程總結(jié)如附圖3。實(shí)施例3酶的特性測(cè)定1.酶的分子量的測(cè)定用10。/。的SDS-PAGE分析純化的降解酶組分，通過遷移率計(jì)算得到聚乳酸降解酶I、n和III的分子量分別為24.0、19.5和18.0kDa。2.等電點(diǎn)測(cè)定采用等電聚焦電泳對(duì)三個(gè)聚乳酸降解酶的等電點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，電泳之后，切膠測(cè)定pH梯度，推測(cè)蛋白的等電點(diǎn)，同時(shí)以pl約為ll的溶菌酶作對(duì)照。切膠pH梯度測(cè)定結(jié)果結(jié)合電泳圖譜可以推測(cè)分離到的三種聚乳酸降解酶I、II和III的等電點(diǎn)均大于IO，因此這6三種酶均為堿性蛋白。3.聚乳酸降解酶的N端測(cè)序純酶組分進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，考馬斯亮藍(lán)R250染色，將純酶的電泳條帶用氨基酸序列分析儀進(jìn)行N端測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下聚乳酸降解酶IIVGGGTAPTVSWGAQ;聚孚L酸降解酵IIIVGGGNATQVYSFMV;聚孚L酸降解酵IIIYDVRGGDAYYINNSS。將三個(gè)N端測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，PLAaseI的N端顯示出與來源于爿附少cotoo戸^sp.K104-l的poly(L-lacticacid)depolymeraseB具有93%的一致性；PLAaseII的N端與來源于Sacc/wra;o(y^omeo;AraeaNRRL2338所分泌的一系列trypsin-Iike絲氨酸蛋白酶具有一定的66%—致性；PLAaseIII與來源S/z^;toOTycM//vWara和S^印to/w;;a^coe//co/wA3(2)的絲氨酸蛋白酶具有86%的一致性。4.MALDI-TOF-PMF鑒定純化的酶組分進(jìn)行SDS-PAGE，將目的條帶切下膠內(nèi)胰酶酶解，37'C反應(yīng)16h后，進(jìn)行激光輔助離子時(shí)間飛行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜儀為AXIMA-CFRplus,SHIMADZU，選擇合適的譜峰在MASCOTPeptideMassFingerprint數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析(www週trixscience扁)。肽指紋圖譜如附圖4所示。比對(duì)結(jié)果并沒有找到匹配程度較高的蛋白，暗示這三種聚乳酸降解酶可能是屬于新的酶組分。同時(shí)肽指紋圖譜還顯示出這三個(gè)酶的酶解峰并不相同，所以，這三種酶并不是來源于同一前體的酶類，而是三個(gè)獨(dú)立的酶組分。5.聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性的最適酶反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性在本實(shí)驗(yàn)中，采用的反應(yīng)時(shí)間為6h。在不同溫度下測(cè)定其酶活，以最高點(diǎn)的酶活性為100%，以相對(duì)酶活性作圖。測(cè)定結(jié)果顯示聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶m的最適作用溫度分別為6(TC，5(TC和60'C左右。將聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III酶液分別在5(TC、6(TC和7(TC，聚乳酸降解酶1I酶液在4(TC、5(TC、6(TC下保溫0.5h、lh、2h、4h、6h、8h，以4'C保存的原酶液酶活為100%，測(cè)定保溫后的殘余酶活，聚乳酸降解酶I和聚乳酸降解酶III在50'C和6(TC時(shí)，溫度穩(wěn)定性較好，保溫8h后，仍然具有80%的殘余酶活，而聚乳酸降解酶II在4(TC和5(TC時(shí)溫度穩(wěn)定性較好，在60'C保溫8h后殘余酶活會(huì)下降到原酶活的20%。6.聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性的最適酶反應(yīng)pH及酶pH穩(wěn)定性將酶液置于pH4-ll的系列緩沖液環(huán)境中，測(cè)定不同pH條件下，不同酶的聚乳酸降解活力，結(jié)果顯示，降解活性在堿性條件下要高于酸性和中性條件，因此使用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液在pH8.5-11.5的緩沖液中，集中測(cè)定堿性條件下的最適pH。將最高點(diǎn)的酶活定義為100%，以相對(duì)酶活作圖，結(jié)果顯示聚乳酸降解酶I，聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III的最適作用pH分別為pH9.5、pH10.5和pH9.5。將酶液置于不同pH緩沖液中4t:放置24h后，測(cè)定其降解活性，將最高點(diǎn)的酶活性定義為100%,以相對(duì)酶活作圖，結(jié)果顯示在pH7-9期間，三種酶的pH穩(wěn)定性都較好，環(huán)境過酸或過堿都會(huì)使其活性明顯下降。7.降解酶的底物特異性分別以聚乳酸、酪蛋白、pNPC8(典型的酯酶底物)、聚羥基丁酸酯、N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide禾卩N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide為底物進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果表明，聚乳酸降解酶i，聚乳酸降解酶n和聚乳酸降解酶in對(duì)聚乳酸、酉各蛋白、N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyl-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide和N-succinyI-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide都具有明顯的活性，而且，聚乳酸降解酶II對(duì)pNPC8還呈現(xiàn)微弱的降解活性。另外，雖然聚羥基丁酸酯與聚乳酸同屬于生物可降解塑料，而且結(jié)構(gòu)單體上也存在著一定的相似性，但三種降解酶對(duì)聚羥基丁酸酯都沒有明顯的降解作用。8.蛋白酶抑制劑對(duì)聚乳酸降解酶的作用實(shí)驗(yàn)使用了Phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF)、Aprotinin、Chymostatin、Pepstatin和EDTA等蛋白酶抑制劑，其中PMSF屬于絲氨酸蛋白酶的典型抑制劑，Aprotinin屬于肽類抑制劑，能夠抑制絲氨酸蛋白酶的活性，Chymostatin為胰凝乳蛋白酶抑制劑，Pepstatin為酸性蛋白酶胃蛋白酶的抑制劑，EDTA為金屬蛋白酶的抑制劑。分別在工作濃度下測(cè)定各種抑制劑對(duì)三種聚乳酸降解酶聚乳酸降解活性及蛋白酶活性的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，三種酶均受PMSF的強(qiáng)烈抑制，進(jìn)一步縮小范圍測(cè)定PMSF對(duì)三種酶抑制作用的IC50值，推測(cè)其均在0.05-0.5mM之間。但這三種酶不論是聚乳酸降解活性還是蛋白降解活性都不受Chymostatin、Pepstatin和EDTA的抑制，這些結(jié)果顯示出我們所發(fā)現(xiàn)的這三種聚乳酸降解酶可能是屬于絲氨酸蛋白酶家族。另外，三種降解酶的PLA降解酶活性受Aprotinin的抑制，但蛋白酶活性卻不受Aprotinin的影響，這種差別可能反映了同一種聚乳酸降解酶對(duì)不同底物降解特異性的差異。實(shí)施例4本發(fā)明中所述基因的克隆方法1.東方擬無枝酸菌基因組的提取按照本領(lǐng)域內(nèi)人員熟知的提取技術(shù)進(jìn)行，參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的細(xì)菌基因組提取方法，優(yōu)選提取之前加入溶菌酶破壁。2.PCR擴(kuò)增基因的部分序列利用降解酶N端測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)兼并引物，作為上游引物；利用絲氨酸蛋白酶保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)下游兼并引物。聚乳酸降解酶n和聚乳酸降解酶m的上游兼并引物聚乳酸降解酶IIF1:GGYAACGCBACSCAGGT聚乳酸降解酶IIF2(嵌套引物)ACSCAGGTBTAYWSITT聚乳酸降解酶IIIF1:GGCGACGCSTAYTAYATCAA聚乳酸降解酶IIIF2AG(嵌套引物)GACGCSTAYTAYATCAACAACAG聚乳酸降解酶IIIF2TC(嵌套引物)GACGCSTAYTAYATCAACAACTC根據(jù)絲氨酸保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)下游兼并引物(聚乳酸降解酶ii和聚乳酸降解酶in通用)Rser:GGRCCRCCISWRTCRCCPCR反應(yīng)體系為GCbufferI25nllOmMdNTP:1^1lOpM上游引物2nl10pM下游引物2nl8基因組模板0.5^1pfu酶0.5^1ddH20:19|J總體積50^1兼并引物的使用濃度與兼并度有關(guān)，一般要高于正常引物的濃度，本實(shí)驗(yàn)中摸索的合適引物濃度為2-4^M。普通PCR擴(kuò)增程序(聚乳酸降解酶II適用)94°C，1min預(yù)變性后；94°C，30sec;60°C，30sec;72°C，1min;重復(fù)30個(gè)循環(huán)后，72'C延伸10min。同時(shí)做只加上游引物或下游引物的單引物對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，取3pl反應(yīng)液在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢、TouchdownPCR擴(kuò)增程序(聚乳酸降解酶III適用)94'C，Imin預(yù)變性后；94°C，30sec;62°C，30sec;72°C，1min;重復(fù)5個(gè)循環(huán)后退火溫度降低2'C再進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，依次下降，一直下降到50'C退火，結(jié)束循環(huán)，72'C延伸10min。嵌套PCR:以上一步的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后為模板，使用嵌套引物進(jìn)行相應(yīng)的PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增得到的DNA片段先經(jīng)過凝膠回收，然后使用T4多聚核苷酸激酶對(duì)其進(jìn)行磷酸化處理；同時(shí)用限制性內(nèi)切酶SmaI酶切載體pUC19，酶切后使用堿性磷酸酶對(duì)其進(jìn)行去磷處理。之后將片段和載體分別純化，16'C連接。其中涉及的回收純化等步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行，酶的使用參照TaKaRa相應(yīng)的使用說明。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，使用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5ct的感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至DH5a的感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐抗性的麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)。挑選白色重組子，進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒電泳檢測(cè)，對(duì)明顯滯后的質(zhì)粒進(jìn)行酶切及PCR驗(yàn)證，確認(rèn)無誤后，進(jìn)行序列測(cè)定。3.SEFA-PCR法擴(kuò)增全基因序列結(jié)合已經(jīng)獲得的聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III中間部分基因序列，分別設(shè)計(jì)引物如下聚乳酸降解酶II:3'方向2Fspl:GTCCGGGGCCGTCGGCACCG2Fsp2:ACGCGGATCATCGGCTGGGG2Fsp3:AGGGTGGCTGTGGCGNNNNNNNNNCCCTGC5，方向2Rspl:AGTCGCCGTAGCAGGCGCCCGAG2Rsp2:GGGGTTGTTGGTGCAGATCTCG2Rsp3:GCCGCTGATGCCGAGNNNNNNNNNGTCGGA聚乳酸降解酶III:3'方向3Fspl:GCGCCTCGATCTGCAAGTCGGG3Fsp2:TTCGACCACCGGCTGGACCTGC3Fsp3:CCAAGAACCAGACCGNNNNNNNNNCCGAGG5，方向3Rsp1:GGGTGCCGTTGTTGATGATGCC3Rsp2:GGCACCCAGTTGCTGTTGACCC3Rsp3:GTGGCCGTAGTCGTTNNNNNNNNNACTGGCSEFA-PCR程序<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>挑選特異且較長的SEFA-PCR片段，回收，與pMD19-T載體連接，pMD19-T帶有LacZ，因此可以在IPTG+X-gal的抗性平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，酶切和PCR驗(yàn)證后進(jìn)行序列測(cè)定。分析SEFA-PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，通過各自下游已確定序列的比對(duì)來驗(yàn)證獲得的序列正確與否，將正確的序列拼接后進(jìn)行閱讀框分析，找到終止密碼子，同時(shí)分析上游序列獲得成熟肽基因的5'端以及信號(hào)肽，設(shè)計(jì)上下游引物以基因組為模板獲得全長基因，測(cè)序后與拼接的序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證基因的正確性。從而得到了SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的基因序列。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一類來源于無枝酸菌屬和擬無枝酸菌屬的菌種通過菌株發(fā)酵或來源于該類菌種的基因在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)而獲得的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶。2.如權(quán)利要求1所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是該酶為所述產(chǎn)酶菌株或由重組菌所產(chǎn)的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶的任一蛋白組分。3.如權(quán)利要求1或2所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是所述酶包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III;其中聚乳酸降解酶I包含具有N-末端氨基酸序列為IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶II包含具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶III包含具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)。4.如權(quán)利要求3所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是所述酶在SDS-PAGE測(cè)定時(shí)，為分子量在18.0-35.0kDa之間的任一聚乳酸降解酶組分。5.如權(quán)利要求3所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是所述酶為等電點(diǎn)蕓9.1-10.0的堿性蛋白質(zhì)。6.如權(quán)利要求3所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是所述酶對(duì)聚乳酸、蛋白質(zhì)或小肽底物如:N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide、N-succinyi-Gly-Gly-Phe-p-nitroanilide或N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroaniiide均有活性，但在N-succinyl-Gly-Gly-Gly-p-nitroanilide上沒有活性。7.如權(quán)利要求3所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，其特征是所述酶的蛋白酶活性和聚乳酸降解活性均受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的強(qiáng)烈抑制，但不受胃蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑的抑制。8.權(quán)利要求1所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶在聚乳酸產(chǎn)品循環(huán)利用及其垃圾處理中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是降解聚乳酸的酶反應(yīng)溫度為5(TC-6(TC，酶反應(yīng)pH為pH9.5-10.5。10.—種具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶制劑，其特征在于所述酶制劑含有有效量的權(quán)利要求1所述的具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶和制劑上可接受的載體或輔料；其中所述具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶是指具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶單一組分或多組分的純酶制品和/或粗酶制品，和/或任一具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶組分的發(fā)酵液。全文摘要本發(fā)明公開了一類具有蛋白質(zhì)降解活性的聚乳酸降解酶，由無枝酸菌屬和擬無枝酸菌屬的菌種發(fā)酵純化制得；所述酶包括聚乳酸降解酶I、聚乳酸降解酶II和聚乳酸降解酶III；其中所述聚乳酸降解酶I包含具有N-末端氨基酸序列為IVGGGTAPTVSWGAQ的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶II包含具有SEQIDNO3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)；聚乳酸降解酶III包含具有SEQIDNO4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其突變體變異蛋白質(zhì)。本發(fā)明的降解酶具有蛋白質(zhì)水解活性，同時(shí)對(duì)可降解塑料聚乳酸具有高效的降解能力，不但應(yīng)用于去污劑、化妝品、皮革加工等傳統(tǒng)蛋白酶工業(yè)，而且在聚乳酸產(chǎn)品的循環(huán)利用、及含有可降解塑料、毛發(fā)、角質(zhì)等混合垃圾的處理上也具有應(yīng)用潛力。文檔編號(hào)C12N9/50GK101457218SQ20081023828公開日2009年6月17日申請(qǐng)日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者劉巍峰,凡李,莎王,陳冠軍申請(qǐng)人:山東大學(xué)