專利名稱：一種ev71病毒熒光rt-pcr檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，可在非常短的時間內(nèi)完成臨床標本中EV71病毒含量的測定，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(enterovirus 71， EV71)是小RNA病毒科腸道病毒屬成員。1969年首次從美國加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒的糞便標本中分離到EV71病毒此后，EV71病毒的流行范圍遍及全球。據(jù)報道，EV71在世界范圍內(nèi)已引起十多次大的爆發(fā)與流行。目前，人類是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通過人群間的密切接觸傳播，病毒經(jīng)過被感染者的口鼻分泌物、糞便和飛沫等傳播。近年來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢，2008年在中國大陸爆發(fā)的手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)便是因EV71病毒引起的。中國大陸EV71的分子流行病學(xué)資料還不完整，EV71的采樣標本主要來源于手足口病患者。中國大陸已報道的io例病毒株均為c基因型。
目前診斷方法包括
( — )病毒分離和培養(yǎng) 常使用RD細胞(來源于人橫紋肌肉瘤細胞)來進行病毒培養(yǎng)，得到初步結(jié)果需要至少一周的時間。 從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標本中分離出病毒有診斷價值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復(fù)分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠高于正常人群，則有診斷的參考價值。
( 二 )測定人雙份血清標本的中和抗體滴度 對于HFMD的雙份血清中和實驗結(jié)果來說，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于l : 256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為l : 128判定為可疑陽性。[ooog](三)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 或通過電泳進行檢測，或通過熒光進行檢測，但因使用兩步RT-PCR，操作較為復(fù)雜，而且需要的時間比較長(通常完成全部檢測需要3個小時)，電泳的方法容易導(dǎo)致污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，用于快速、簡便的檢測標本中EV71病毒的含量。 1.為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是將EV71病毒C基因型序列和coxsackievirus A16(CA16)病毒等其他腸道病毒序列進行比對，選擇EV71病毒的特異、保守區(qū)設(shè)計多套PCR檢測引物和探針，通過篩選來確定最佳的方案，最終確定為如下序列。
引物1 :5—-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3— (Seq No. 1)
引物2 :5—-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3—(Seq No. 2)
探針1 :5—-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3— (Seq No. 3)
或者與上述序列同源性大于75 %的序列、或者上述所有序列的堿基互補序列。
其中標記探針的熒光發(fā)光基團可以為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、Acridine orange或R0X中任意一禾中;3—端熒光淬滅基團為DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團中的任意一種。 2.考慮到陽性臨床標本的獲取受到國家法規(guī)的管制，設(shè)計合成人工RNA序列用于標準品或陽性對照品等的制備。序列如下 3.通過實驗優(yōu)化，實現(xiàn)了一步法熒光RT-PCR檢測，RT-PCR反應(yīng)組分(終濃度)包括10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM d證、3mM MgC12、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1、0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT禾口 1. 5U Taq酶。 RT-PCR運行程序可以為先在50°C反應(yīng)5分鐘，然后95 °C保溫5分鐘，再按94°C 10秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光信號)。4.通過上述設(shè)計，可制備熒光定:量RT-PCR檢測試劑盒，試劑盒組成包括組成成分(20人份/盒)體積One st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液380 ii 1混合酶60 ii 1RNA標準百^ 120 ii 1RNA標準百20 ii 1RNA標準百20 ii 1RNA標準百20 ii 1DEPC水lml其中，Onest印PCR反應(yīng)組分(終濃度)包括10mM Tris-HC1(PH 8.3)、50mM
KCl、300uM d證、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探針1?；旌厦傅慕M成成份(終濃度)包括0.5U AMV酶、0. 5URNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶。其中，探針1的5—端標記的發(fā)光基團為FAM，在3—端標記的淬滅基團為Eclipse。
操作步驟如下 PCR反應(yīng)液的配制按每人份One st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量提取好的總RNA并補充DEPC水(RNA標準品直接取8ul)，使反應(yīng)總體積為30ul，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95"C保溫5分鐘，再按94°C 10秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。
本發(fā)明與現(xiàn)有EV71病毒核酸PCR檢測方法相比，具有以下有益的技術(shù)效果 (1)通過序列比對及引物和探針的篩選，能對中國大陸最常見的C基因型進行檢
測，而對于同源性較高的其他腸道病毒(如CA16)不能進行PCR擴增。 (2)使用一步法RT-PCR完成檢測，快速(僅需1.5小時)、操作簡便，而且盡可能
的減少了污染的發(fā)生。
具體實施例方式
設(shè)計和制備引物、探針序列以及人工合成RNA序列(針對Human enterovirus71病毒的保守基因polyprotein基因〈GeneBank序列號為AF302996>序列)
引物1 :5—-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3— (Seq No. 2)探針1 :5—-FAM-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-Eclipse-3— (Seq No. 3)人工合成RNA序列(Seq No. 4)
上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。 根據(jù)人工合成RNA序列的0D值和分子質(zhì)量，計算RNA的原始濃度，將該人工合成RNA序列用DEPC處理過的水溶解并稀釋成1E+7copies/ml、lE+6copies/ml、lE+5copies/ml和1E+4copies/ml，依次作為RNA標準品1-4。 按如下配方配制0ne st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液(終濃度)10mM Tris-HC1(PH8. 3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探針1。
按如下配方配制混合酶(終濃度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。
試劑盒組成為 組成成分(20人份/盒) 體積
380 ii 160 ii 120 ii 120 ii 120 ii 120 ii 1lml
本發(fā)明提供的方法形成的試劑盒未提供mRNA提取試劑，用戶可根據(jù)自身要求使用傳統(tǒng)的酚_氯仿提取方法或購買商業(yè)化的RNA提取試劑盒。
檢測步驟 PCR反應(yīng)液的配制按每人份One st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22u1/管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的RNA并補充DEPC水(RNA標準品直接取8ul)，使反應(yīng)總體積為30ul。 按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95。C保溫
盒)
One st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液
混合酶
RNA標準品1
RNA標準品2
RNA標準品3
RNA標準品4
DEPC水
65分鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。
設(shè)置好標準品的定量值，儀器可直接讀取檢測標本的定量結(jié)果。
SEQUENCE LISTING 〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司 〈120> —種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù) 〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400〉 1 agagatagcc ctccctcttg aag 23 〈210>2 〈211>25 〈212>DNA 〈213〉人工序列 <400>2 aagcgcatgt cggtgaatag ctcca 25 〈210>3 〈211>27 〈212>DNA 〈213〉人工序列 <400〉3 agatataacg ggttacgcgc aaatgcg 27 〈210>4 〈211>120 〈212>RNA 〈213〉人工序列 〈400〉4 3g3gaimgcc cucccuc皿g朋ggcacacc imacccaaau gguuaugcim acugggaimu 60 agaimimacg gguimcgcgc朋肌gcguag朋agguggag cim皿caccg ac肌gcgc皿 120

上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司
劍軍，何
懿，夏
權(quán)利要求
一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于包含一對引物和一條探針，擴增目標片段長度為120bp，引物和探針序列為引物15`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`(Seq No.1)引物25`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`(Seq No.2)探針15`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(S eq No.3)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于標記探針5—端 的熒光發(fā)光基團為可以FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5. 5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或R0X中任意一禾中； 3—端熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2、BHQ-3或MGB基團中 的任意一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于使用一步法 RT-PCR熒光檢測技術(shù)，能快速、準確的對臨床標本中的EV71病毒含量進行定性或定量分 析。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于，使用人工合成 的RNA序列作為RNA陽性對照品，序列如下(Seq No. 4)AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACACCGACAUGCGCUU(120bp)將此人工合成序列稀釋至適當濃度梯度，作為EV71病毒RNA的標準品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于，RT-PCR反應(yīng) 組分包括10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mMMgCl2、200nM引物l、200nM 引物2、200nM探針1、0. 5U AMV酶、0. 5U RNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT和1. 5U Taq酶，RT-PCR運行程序可以為先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95。C保溫5分鐘，再按94°C 10 秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光信號)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)，其特征在于，可制備熒光定 量RT-PCR檢測試劑盒，試劑盒組成包括組成成分(20人份/盒) 體積 One st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液 380 ii 1 混合酶 60 ii 1RNA標準品 120 illRNA標準品 220 illRNA標準品 320 illRNA標準品 420 illDEPC水 1ml其中，One st印PCR反應(yīng)組分(終濃度)包括10mM Tris-HC1(PH 8.3)、50mM KCl、 300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2和200nM探針1 。混合酶的組成成份(終 濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1. 5U Taq酶。其 中，探針1的5—端標記的發(fā)光基團為FAM，在3—端標記的淬滅基團為Eclipse。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，操作步驟如下PCR反應(yīng)液的配制按每人份0ne st印RT-PCR反應(yīng)緩沖液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應(yīng)液，并按22ul/管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量提取好的總RNA并補充DEPC水(RNA標準品直接取8ul)，使反應(yīng)總體積為30ul，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應(yīng)管先在5(TC反應(yīng)5分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94°C 10秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術(shù)。本發(fā)明針對EV71(enterovirus 71)病毒基因組RNA與其他腸道病毒RNA的差異，篩選到了一套與EV71的polyprotein基因保守區(qū)結(jié)合，而與其他腸道病毒(如CA16)不發(fā)生結(jié)合的引物和探針，通過優(yōu)化實驗方案，實現(xiàn)了一步法熒光RT-PCR對EV71病毒的定量檢測。具有較高的特異性和靈敏性。
文檔編號C12Q1/68GK101760561SQ200810201650
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者何劍軍, 夏懿 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司