專利名稱：：番紅花病毒檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，具體涉及番紅花病毒檢測方法。
背景技術(shù)：
：番紅花(CrocussativusL.)又名藏紅花、西紅花，系鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬多年生草本植物。原產(chǎn)南歐各國及伊朗等地，后經(jīng)印度轉(zhuǎn)入西藏再傳入中國，引種栽培成功，故又名藏紅花或西紅花。由于番紅花只是柱頭入藥，產(chǎn)量極低，采收耗時費力；同時種源少，適宜栽培地區(qū)有限、條件苛刻等因素致使其價格昂貴，在我國被列為珍惜名貴的中藥材，并被譽(yù)為"植物黃金"。其雌蕊柱頭是名貴中藥，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神之功效，是傳統(tǒng)的婦科、傷科良藥。臨床上還主要用于胃病、調(diào)經(jīng)、麻疹、發(fā)熱、肝脾腫大等的治療。尤其是近年來在治療心腦血管疾病方面取得了較好的療效。中國藏紅花的栽培品種主要來自于德國和日本，在田間種植23年后均嚴(yán)重退化，葉片出現(xiàn)黃色條斑，整株矮化、黃化，頂端枯死，提前倒苗，球莖畸小，柱頭產(chǎn)量大大降低。國內(nèi)外報道其病源為蕪菁花葉病毒(turnipmosaicvirus,TuMV)、鳶尾花葉病毒(irismosaicvirus,IMV)、菜豆黃花口十病毒(beamyellowmosaicvirus,ByMV)、黃瓜花口十病毒(cu2固bermosaicvirus,CMV)及煙草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)，其中T薩、MV和ByMV屬于馬鈴薯Y病毒(potyvirus)。經(jīng)田間調(diào)查和病毒學(xué)鑒定，導(dǎo)致藏紅花花品質(zhì)衰退、產(chǎn)量遞減的植物病源是TuMV，這種病毒對藏紅花的危害巨大，發(fā)生面積大，田間發(fā)病率為70%97%。因而檢測和發(fā)現(xiàn)番紅花病毒很重要，但現(xiàn)有檢測方法不太方便，例如指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和總核酸提取法等，有一定局限性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，提供一種快速、靈敏、特異的檢測番紅花病毒的方法。本發(fā)明提供了一種番紅花病毒檢測方法，根據(jù)番紅花易感CMV(黃瓜花葉病毒)，TuMV(蕪菁花葉病毒)，PVY(馬鈴薯Y病毒)，TRV(煙草脆裂病毒)病毒核苷酸序列設(shè)計的特異性引物，提取植物組織的總RNA后，采用RT-PCR的方法，檢測番紅花病毒。該方法包括下列步驟1、引物設(shè)計根據(jù)番紅花病毒的核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增番紅花病毒外殼蛋白的特異性引物。根據(jù)已報道的病毒的CMV、PVY、TuMV、TRV核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物，引物序列如下表1番紅花病毒檢測用弓I物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、總RNA提取1)處理取O.2g發(fā)病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5ml離心管中，然后加入1ml的Trizol試劑，劇烈振蕩搖勻；2)RNA分離4t:，12000rpm離心10min以除去不溶的成分，將上清液轉(zhuǎn)入一新的1.5ml離心管中；3)RNA提取室溫下保持5min，加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持10min后，4。C，12000rpm離心15min;4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置15min。4°C，12000rpm離心15min，RNA就會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；5)RNA洗滌棄去上清液，加入75%的乙醇洗滌；混勻，4°C，12000rpm離心5min;6)棄去乙醇，沉淀于室溫下自然晾干，RNA溶于40uldH20中，保存于-70°〇備用。3、RT-PCR擴(kuò)增l)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄以植物總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其反應(yīng)體系為3.OuLRNA、2.OuL5XRT緩沖液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLRNA酶抑制劑(40U/uL)、0.5uL反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(5U/uL)、0.5uL引物禾口2.5uLdH20。混合均勻后，室溫放置10min，45。C水浴lh。2)PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用表1中的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其反應(yīng)體系如下。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系為2.0uL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2.5uLlOXTaq緩沖液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uL叫0，其反應(yīng)條件見表2。表2PCR擴(kuò)增的條件病毒擴(kuò)增條件TuMV(蕪菁花葉病毒)94°C5min,l個循環(huán);94。C30s,48°C30s，72°Clmin,3個循環(huán);94。C30s，51。C30s,72。Clmin，30個循環(huán);72。C10min,l個循環(huán);4。C保溫TRV(煙草脆裂病毒)94°C5min,l個循環(huán);94。C30s，48。C30s，72。Clmin，3個循環(huán);94。C30s，49。C30s，72。Clmin,30個循環(huán);72。C10min，l個循環(huán)；4'C保溫CMV(黃瓜花葉病毒)94°C5min，l個循環(huán);94。C30s，50。C30s,72。Clmin,3個循環(huán)；94。C30s,53。C30s,72。Clmin，30個循環(huán);72。ClOmin,l個循環(huán)；4i:保溫Potyvirus(馬鈴薯Y病毒)94°C5min,l個循環(huán)；94°C30s，50°Clmin,72。Clmin，3個循環(huán)；94。C30s，53。Clmin，72。Clmin,30個循環(huán);72'C10min，l個循環(huán)；4'C保溫4、電泳檢測取5uLPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%-1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，其反應(yīng)體系為4.5uL標(biāo)物，2.0uLlOXloadingbuffer,7.OuLPCR產(chǎn)物，120V電壓。電泳結(jié)束后將凝膠于10ug/uL溴化乙錠中染色15min，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。本發(fā)明能有效克服指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和總核酸提取法的缺點，方便、特異、靈敏的檢測番紅花病毒。具體實施例方式實施例1:以已知的感染番紅花病毒的植株為檢測材料，并以未感染病毒的健康材料為陰性對照。1.引物設(shè)計和合成根據(jù)已報道的病毒的CMV、PVY、TuMV、TRV核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物，引物序列如下表1番紅花病毒檢測用弓I物<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.總RNA的提取1)處理取O.2g發(fā)病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5ml離心管中，然后加入1ml的Trizol試劑，劇烈振蕩搖勻；2)RNA分離4°C，12000rpm離心lOmin以除去不溶的成分，將上清液轉(zhuǎn)入一新的1.5ml離心管中；3)RNA提取室溫下保持5min，加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持lOmin后，4。C，12000rpm離心15min;4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置15min。4°C，12000rpm離心15min，RNA就會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；5)RNA洗滌棄去上清液，加入75%的乙醇洗滌；混勻，4°C，12000rpm離心5min;6)棄去乙醇，沉淀于室溫下自然晾干，RNA溶于40uldH20中，保存于-70°〇備用。3.RT-PCR擴(kuò)增方法的建立1)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄以植物總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其反應(yīng)體系為3.OuLRNA、2.OuL5XRT緩沖液、1.OuLdNTP/10mM每、0.5uLRNA酶抑制劑(40U/uL)、0.5uL反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(5U/uL)、0.5uL引物禾口2.5uLdH20?；旌暇鶆蚝螅覝胤胖?0min，45。C水浴lh。2)PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用表3中的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其反應(yīng)體系如下。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系為2.0uL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2.5uLlOXTaq緩沖液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uLdH20。4.電泳檢測取5uLPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%-1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，其反應(yīng)體系為4.5uL標(biāo)物，2.OuL10Xloadingbuffer,7.OuLPCRproducts,120V電壓。電泳結(jié)束后將凝膠于10ug/uL溴化乙錠中染色15min，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。權(quán)利要求一種番紅花病毒檢測方法，其特征在于該檢測方法包括下列步驟(1)引物設(shè)計根據(jù)番紅花病毒的核苷酸序列設(shè)計擴(kuò)增番紅花病毒外殼蛋白的特異性引物，引物序列；(2)總RNA提?、偬幚砣?.2g發(fā)病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5ml離心管中，然后加入1ml的Trizol試劑，劇烈振蕩搖勻；②RNA分離4℃，12000rpm離心10min以除去不溶的成分，將上清液轉(zhuǎn)入一新的1.5ml離心管中；③RNA提取室溫下保持5min，加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持10min后，4℃，12000rpm離心15min；④將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置15min。4℃，12000rpm離心15min，RNA就會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀；⑤RNA洗滌棄去上清液，加入75％的乙醇洗滌；混勻，4℃，12000rpm離心5min；⑥棄去乙醇，沉淀于室溫下自然晾干，RNA溶于40uldH2O中，保存于-70℃?zhèn)溆茫?3)RT-PCR擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄以植物總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其反應(yīng)體系為3.0uLRNA、2.0uL5×RT緩沖液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uLRNA酶抑制劑40U/uL、0.5uL反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)5U/uL、0.5uL引物和2.5uLdH2O，混合均勻后，室溫放置10min，45℃水浴1h；②PCR擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用步驟(1)設(shè)計的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其反應(yīng)體系如下，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系為2.0uL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、2.5uL10×Taq緩沖液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uLdH2O；(4)電泳檢測取5uLPCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％-1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，其反應(yīng)體系為4.5uL標(biāo)物，2.0uL10×loadingbuffer，7.0uLPCR產(chǎn)物，120V電壓，電泳結(jié)束后將凝膠于10ug/uL溴化乙錠中染色15min，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據(jù)番紅花病毒的CMV核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物為CMV(+)ATGGACAAATCTGAATCACCC;CMV(-)TAAGCTGGATGGACAACCCGT。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據(jù)番紅花病毒的PVY核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物為PVY(+)GGNAAYAAYAGYGGNCARCC;PVY(-)CAGGATCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據(jù)番紅花病毒的TuMV核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物為TuMV(+)GTGGCTTTAAACCTCGATCA;TuMV(-)ACGCCAAGTAAGTTATGCAT。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據(jù)番紅花病毒的TRV核苷酸序列設(shè)計了擴(kuò)增病毒的特異性引物為TRV(+)GCTATGAAATTTGCGTTACA;TRV(-)TTATGATACGCAGTAGAAGC。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(3)PCR擴(kuò)增中的循環(huán)次數(shù)為30-35次；PCR擴(kuò)增的條件為病毒擴(kuò)增條件TuMV(蕪菁花葉病毒)94°C5min，1個循環(huán)；94。C30s，48°C30s，72°Clmin，3個循環(huán)；94°C30s，51。C30s，72。Clmin，30個循環(huán)；72。C10min，1個循環(huán)；4。C保溫；TRV(煙草脆裂病毒)94°C5min，1個循環(huán)；94。C30s，48°C30s，72°Clmin，3個循環(huán)；94°C30s，49。C30s，72。Clmin，30個循環(huán)；72。C10min，1個循環(huán)；4。C保溫；CMV(黃瓜花葉病毒)94°C5min，1個循環(huán)；94。C30s，50。C30s，72。Clmin，3個循環(huán);94°C30s，53。C30s，72。Clmin，30個循環(huán)；72。C10min，1個循環(huán)；4。C保溫；Potyvirus(馬鈴薯Y病毒)94°C5min，1個循環(huán)；94。C30s，50。Clmin，72。Clmin，3個循環(huán)；94。C30s，53。Clmin，72。Clmin，30個循環(huán)；72。C10min，1個循環(huán)；4。C保溫。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(4)電泳檢測時所用的瓊脂糖凝膠濃度為0.8-1.0%。全文摘要本發(fā)明公開了一種番紅花病毒檢測方法，根據(jù)CMV，TuMV，PVY，TRV病毒核苷酸序列設(shè)計了特異性引物，提取番紅花組織的總RNA后，采用RT-PCR的方法，檢測番紅花病毒。本發(fā)明能有效克服指示植物法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和總核酸提取法的缺點，方便、特異、靈敏的檢測番紅花病毒。文檔編號C12Q1/70GK101724710SQ200810201020公開日2010年6月9日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者吳威巍,楊弘,秦路平,韓婷申請人:上海華宇藥業(yè)有限公司