熒光pcr技術(shù)檢測(cè)pds基因ivs7-2a>g突變的方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)耳聾基因PDS?IVS7-2A＞G突變的方法及試劑盒。針對(duì)PDS?IVS7-2A＞G突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性突變型探針和野生型探針并分別標(biāo)記不同顏色的熒光，突變位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。對(duì)一個(gè)待測(cè)樣本用含野生型探針、突變型探針及擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)與質(zhì)控品比較熒光曲線模式判斷樣本是否存在PDS基因IVS7-2A＞G突變。本發(fā)明能為耳聾患者尤其是伴大前庭水管綜合征的病因診斷提供臨床參考，也能篩查新生兒、孕期夫婦是否為攜帶者，為耳聾的產(chǎn)前診斷、新生兒先天耳聾病因診斷提供幫助。試劑盒具有閉管高通量自動(dòng)化操作及分析的特點(diǎn)，尤其適合臨床實(shí)驗(yàn)室使用。
【專利說(shuō)明】熒光PCR技術(shù)檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A〉G突變的方法及其試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種探針特異性的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)耳 聾基因 ros IVS7-2A > G突變的方法及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是造成語(yǔ)言交流障礙最常見(jiàn)的疾病，新生兒耳聾的發(fā)病率為0. 1 %?0. 3%。 我國(guó)聽(tīng)力語(yǔ)言殘疾者甚眾，并以每年新生3萬(wàn)聾兒的速度增長(zhǎng)，我國(guó)累計(jì)約有30萬(wàn)對(duì)生育 至少一個(gè)聾兒的育齡夫婦面臨再次生育的選擇。耳聾發(fā)生的原因、是否具有遺傳性、下一 次生育是否安全是耳聾家庭極為關(guān)心的問(wèn)題。大前庭水管綜合征（Enlarge vestibular aqueduct syndrome. EVAS)是一種發(fā)病率較高的常染色體隱性遺傳性聽(tīng)力障礙性疾病。影 像學(xué)檢查資料表明在兒童感音神經(jīng)性聾患者中，大前庭水管是最常見(jiàn)的一種內(nèi)耳畸形，在 遺傳性聾人群中發(fā)病率約為1%?1.3%，在某些地區(qū)甚至可達(dá)7%。SLC26A4基因定位于 7q31，其mRNA全長(zhǎng)4930bp，共有21個(gè)外顯子.開(kāi)放閱讀框架2343bp，貫穿于外顯子2和外 顯子21，編碼780個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離 子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，研究表明其功能主要與碘氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)突變的特點(diǎn)。在EVAS患者中最常 見(jiàn)的SLC26A4基因突變是IVS7-2A > G。對(duì)中國(guó)人群進(jìn)行IVS7-2A > G突變的普遍篩查，可 降低大前庭水管患兒的出生率。
[0003] 目前進(jìn)行基因突變檢測(cè)的方法有數(shù)十種。金標(biāo)準(zhǔn)法為PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法。PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法是目前應(yīng)用最廣泛、較準(zhǔn)確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設(shè)備 和專業(yè)的人員進(jìn)行操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在臨床上很難進(jìn)行推廣?；蛐酒ň哂锌焖俑咄康?優(yōu)點(diǎn)，但是操作上復(fù)雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP) 檢測(cè)基因突變的方法具有成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，但是過(guò)程煩瑣，時(shí)間長(zhǎng)也不適合普及。公開(kāi)的專 利（專利號(hào)200610058282. 6)依據(jù)PDS基因 IVS7-2突變位點(diǎn)A > G，設(shè)計(jì)了能包括該位點(diǎn) 在內(nèi)的上下游1-13個(gè)堿基范圍內(nèi)引入任意一個(gè)堿基替換突變的引物對(duì)，從而在擴(kuò)增產(chǎn)物 中能獲得可鑒別A >G位點(diǎn)的新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，該方法需要后續(xù)酶切及電泳等過(guò)程， 不適合臨床推廣。專利201010599385. X，采用特異性引物及探針，通過(guò)單核苷酸延伸技術(shù)結(jié) 合微陣列芯片技術(shù)進(jìn)行突變檢測(cè)，該方法操作上復(fù)雜，儀器昂貴，也不易普及推廣。
[0004] 本方法采用一種實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（FQ-PCR)檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A > G突變的方法，針對(duì)PDS基因 IVS7-2A > G位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性野生型探針及突變型探針，野生 型及突變型探針?lè)謩e被標(biāo)記上不同顏色的熒光，同時(shí)在PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)兩側(cè)翼序列 區(qū)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，對(duì)于檢測(cè)樣本，依據(jù)野生型與突變型探針在PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的熒 光顏色不同來(lái)判斷樣本是否存在突變。該方法具有時(shí)間短、高通量、閉管自動(dòng)化操作、結(jié)果 分析簡(jiǎn)單，檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)突變需要1個(gè)PCR反應(yīng)管實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。適合臨床實(shí)驗(yàn)室使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種PDS基因 IVS7-2A > G突變的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法 和試劑盒，可用于臨床樣本的檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)路線為：
[0007] 1)PDS基因外顯子7-8區(qū)域（SEQ ID N0:5)的第7個(gè)內(nèi)含子倒數(shù)第2個(gè)堿基 (IVS7-2A>G)位點(diǎn)處設(shè)計(jì)野生型探針及突變型探針，其長(zhǎng)度均為10-30bp之間的核苷酸序 列。兩種探針均覆蓋PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)，其中野生型探針（SEQ ID NO :3)針對(duì)PDS基因 IVS7-2野生型位點(diǎn)，突變型探針（SEQ ID N0:4)針對(duì)PDS基因 IVS7-2突變位點(diǎn)。
[0008] 2)探針5'端標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)FAM或HEX等類似發(fā)光基團(tuán)，3'端標(biāo)記熒光淬滅 基團(tuán)TAMRA或BHQ1等類似淬滅基團(tuán)。探針序列并不局限于本說(shuō)明書(shū)中的具體核苷酸序列， 可以是覆蓋PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)的任意一段符合探針要求的核苷酸序列。探針5'端標(biāo)記 的熒光發(fā)生基團(tuán)及其相應(yīng)的3'端熒光淬滅基團(tuán)可以是目前本領(lǐng)域中任何可用的熒光基團(tuán)， 如FAM，HEX可以由其他熒光基團(tuán)或染料代替，如VIC，JOE，CY5等?？梢允褂媚壳俺Ｓ玫?Taqman探針，也可以是在普通Taqman探針基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)修飾的LNA-Taqman探針，MGB-Taqman 探針或現(xiàn)有技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)的在Taqman探針基礎(chǔ)上改良修飾的相關(guān)探針。
[0009] 3) PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)上游設(shè)計(jì)正向擴(kuò)增引物，在下游設(shè)計(jì)反向擴(kuò)增引物，其 長(zhǎng)度均為l〇_3〇bp之間的核苷酸序列，能夠擴(kuò)增出含有PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)的長(zhǎng)度為 50-700bp的核苷酸片段，優(yōu)選地，正向引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)為 能擴(kuò)增出含有PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)的60-150bp片段的特異性核苷酸序列。
[0010] 4)配制適宜于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：耐熱DNA聚合酶、 dNTP、UNG酶、含有Mg離子的緩沖液，正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)， 野生型探針（SEQ ID NO :3)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0011] 5)從待測(cè)樣本中提取DNA，加入反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。
[0012] 6)依據(jù)野生型、突變型探針標(biāo)記的不同顏色顯示確定樣本的基因型。只有野生型 探針的顏色顯示時(shí)，樣本為野生型，反之為突變型，如果兩種顏色都存在，則樣本為雜合型。
[0013] 本發(fā)明提供的PDS基因 IVS7-2A > G突變檢測(cè)試劑盒主要包括以下組分：PCR反 應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品，DNA裂解液，紅細(xì)胞裂解液和分隔并集中包裝這些試劑瓶或 管的包裝盒。
[0014] 本發(fā)明依據(jù)下述原理來(lái)實(shí)現(xiàn)，為了檢測(cè)roS(SEQ ID NO :5)基因 IVS7-2A > G位 點(diǎn)，設(shè)計(jì)覆蓋IVS7-2A > G位點(diǎn)的突變型探針與野生型探針，野生型探針只能與野生型樣本 模板完全匹配，突變型探針只能與突變型樣本模板完全匹配，由于突變型探針與野生型探 針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)不同，即二者發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光，在熒光PCR儀上被分別記 錄并在分析軟件中以不同顏色或不同的標(biāo)記反映出來(lái)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，試劑盒中PCR反應(yīng)液含有1XPCR Buffer、 dNTPs、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID N0:2)，野生型 探針（SEQ ID NO :3)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0016] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -GAATTATTAAAACCAATGGAGTTT-3'
[0017] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -GCATTCATTAAAAAAACCAGGTTGG-3，
[0018] 野生型熒光探針（SEQ ID NO :3) :5' FAM-TTGTTTTATTTCAGACGATAATT-BHQ13'
[0019] 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4) :5' HEX-TTGTTTTATTTCGGACGATAATT-BHQ13'
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中也可以僅加入突變型探針，當(dāng)模板是 突變型時(shí)，則最終可檢測(cè)到突變型探針發(fā)射出的熒光，因而確定樣本含有突變位點(diǎn)，當(dāng)模板 是野生型時(shí)，則最終不能檢測(cè)到突變型探針發(fā)射出的熒光，因而確定樣本不含有突變位點(diǎn)。 理論上，一個(gè)體系中可以僅加入突變型探針，但是當(dāng)同時(shí)加入野生型探針時(shí)，可以起到反向 校正的雙保險(xiǎn)作用，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。僅加入突變型探針的試劑盒中PCR反應(yīng)液含有 lXPCRBuffer、dNTPs、Mg2+、Taq 酶、去離子水、正向引物（SEQ ID N0:1)，反向引物（SEQ ID NO :2)，突變型探針（SEQ ID NO :4)。
[0021] 正向引物（SEQ ID NO :1) :5' -GAATTATTAAAACCAATGGAGTTT-3，
[0022] 反向引物（SEQ ID NO :2) :5' -GCATTCATTAAAAAAACCAGGTTGG-3，
[0023] 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4) :5' HEX-TTGTTTTATTTCGGACGATAATT-BHQ13'
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中的陽(yáng)性質(zhì)控品為經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)結(jié)果為 PDS基因 IVS7-2A > G純合突變型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或相應(yīng)的PCR產(chǎn)物或 質(zhì)粒載體；陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水、生理鹽水或鮭魚(yú)精子DNA，也可以為經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn) 結(jié)果為PDS基因 IVS7-2A > G野生型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或相應(yīng)的PCR產(chǎn)物 或相應(yīng)的質(zhì)粒載體；
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中待檢測(cè)靶核酸樣品來(lái)自從各種途徑獲 取的被檢測(cè)者的血液、唾液、羊水細(xì)胞或其它人體組織等等。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中的DNA提取液主要包含Chelex-100。 也可以使用其它試劑盒或方法提取的DNA作為進(jìn)行熒光PCR的模板。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中用于判定檢測(cè)方法有效性的標(biāo)準(zhǔn)是： 每次檢測(cè)都使用PCR反應(yīng)液分別檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，對(duì)于陽(yáng)性質(zhì)控品，依據(jù)突 變型探針產(chǎn)生的顏色熒光曲線作為陽(yáng)性質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性質(zhì)控品的Ct值應(yīng)小于30。對(duì)于 以經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)結(jié)果為GJB2 235位點(diǎn)野生純合型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或相 應(yīng)的PCR產(chǎn)物或相應(yīng)的質(zhì)粒載體陰性質(zhì)控品，依據(jù)野生型探針產(chǎn)生的顏色熒光曲線作為陰 性質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，陰性質(zhì)控品的Ct值應(yīng)小于30 ;對(duì)于以蒸餾水、純水、生理鹽水或鮭魚(yú)精子 DNA的陰性質(zhì)控品，野生型和突變型探針產(chǎn)生的顏色熒光曲線的Ct值均應(yīng)大于35。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以根據(jù)所擴(kuò)增序列的特殊情況，在試劑盒的 PCR緩沖液中加入甲酰胺或二甲基亞砜等PCR反應(yīng)添加劑減少高GC含量或二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR 反應(yīng)的影響。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1顯示試劑盒陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光 強(qiáng)度，'S'型曲線是突變型探針顏色熒光曲線，野生型探針顏色熒光曲線無(wú)擴(kuò)增。
[0030] 圖2顯示陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強(qiáng)度， 'S'型曲線是野生型探針顏色熒光曲線，突變型探針顏色熒光曲線無(wú)擴(kuò)增。該陰性質(zhì)控品為 經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)結(jié)果為PDS基因 IVS7-2位點(diǎn)突變純合型的質(zhì)粒載體。
[0031] 圖3顯示陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強(qiáng)度， 野生型與突變型探針顏色熒光曲線Ct值均無(wú)擴(kuò)增。該陰性質(zhì)控品為鮭魚(yú)精子DNA。
[0032] 圖4顯示試劑盒檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A > G純合突變型人外周血組織標(biāo)本的擴(kuò)增 曲線。結(jié)果同圖1。
[0033] 圖5顯示試劑盒檢測(cè)H)S基因 IVS7_2A>G野生型人外周血組織標(biāo)本的擴(kuò)增曲線。 結(jié)果同圖2。
[0034] 圖6顯示試劑盒檢測(cè)ros基因 IVS7_2A>G雜合型人外周血組織標(biāo)本的擴(kuò)增曲線。 橫軸表示循環(huán)數(shù)（Ct值），縱軸表示熒光強(qiáng)度，兩條'S'型曲線分別表示野生型與突變型探 針顏色熒光曲線，可見(jiàn)2條曲線的Ct值接近。
[0035] 圖7顯示DNA提取失敗的人外周血組織的擴(kuò)增曲線，結(jié)果同圖3。野生型及突變型 探針顏色熒光曲線均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明DNA提取失敗。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
[0037] 實(shí)施例1 :PDS基因 IVS7-2A > G突變檢測(cè)試劑盒及其使用
[0038] 試劑盒的組成
[0039] PCR反應(yīng)液1管（500ul)、陽(yáng)性質(zhì)控品1管（20ul)，陰性質(zhì)控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶（15ml)。
[0040] PCR反應(yīng)液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID N0:1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID N0:2)、0. 2uM 野生型熒光探針（SEQ ID N0:3)，0. 2uM 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4)。
[0041] 操作步驟：
[0042] 1)基因提?。喝OOul EDTA抗凝外周血，加入600ul紅細(xì)胞裂解液，室溫放置 5-10分鐘，期間混勻數(shù)次，5000rpm離心5分鐘，棄上清，然后加入DNA裂解液100ul，混勻， 99度10分鐘，離心，取上清作為DNA摸板進(jìn)行后續(xù)工作。也可以使用商業(yè)化的DNA提取試 劑盒進(jìn)行基因提取，提取過(guò)程按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
[0043] 2)PCR檢測(cè)：取PCR反應(yīng)液23ul置入PCR管中，加入2ul樣品DNA，混勻后置于熒 光定量PCR儀中。
[0044] 陽(yáng)性質(zhì)控：分別取陽(yáng)性質(zhì)控品2ul加入PCR反應(yīng)液中，余同樣品操作。
[0045] 陰性質(zhì)控：分別取陰性質(zhì)控品2ul加入PCR反應(yīng)液中，余同樣品操作。
[0046] PCR 擴(kuò)增參數(shù)：50°C 2min，95°C 2min，然后進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)：95°C 30sec -61°C 20sec，反應(yīng)結(jié)束后將結(jié)果保存待進(jìn)一步分析。
[0047] 3)結(jié)果分析：依據(jù)陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品熒光顏色曲線對(duì)樣本進(jìn)行分析。如果 存在2條不同顏色的熒光曲線，則樣本為雜合型。
[0048] 實(shí)施例2 :PDS基因 IVS7-2A > G突變檢測(cè)試劑盒及其使用
[0049] 試劑盒的組成
[0050] PCR反應(yīng)液1管（500ul)、陽(yáng)性質(zhì)控品1管（20ul)，陰性質(zhì)控品1管（20ul)，DNA提 取液1管（3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶（15ml)。
[0051] PCR反應(yīng)液包括：1XPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq酶25U/ml、0. 2uM正向引物（SEQ ID NO :1)、0. 2uM 反向引物（SEQ ID NO :2)、0. 2uM 突變型熒光探針（SEQ ID NO :4)。
[0052] 操作步驟同實(shí)施例1。
[0053] 結(jié)果分析：依據(jù)陽(yáng)性質(zhì)控品熒光顏色曲線對(duì)樣本進(jìn)行分析。如果存在與陽(yáng)性質(zhì)控 品熒光顏色相同的曲線，則樣本存在PDS基因 IVS7-2A > G突變，不能區(qū)分雜合還是純合突 變。如果不存在熒光曲線，則樣本判定為野生型。
[0001] 序列表 <110〉王寶恒 <120〉熒光PCR技術(shù)檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A>G突變的方法及其試劑盒 <130> 0 <160> 5 <170> Patentln version 3.5 <210〉 1 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1).. (24) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，用以作PCR擴(kuò)增的引物 <400> 1 gaattattaa aaccaatgga gttt 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> primer-bind <222> (1)..(25) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，用以作PCR擴(kuò)增的引物 <400> 2 gcattcatta aaaaaaccag gttgg 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA
[0002] <213〉人工序列 <220〉 <221〉 probe-bind <222> (1).. (23) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，用以作PCR擴(kuò)增的探針 <400〉 3 ttgttttatt tcagacgata att 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221> probe-bind <222> (1).. (23) <223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，用以作PCR擴(kuò)增的探針 <400> 4 ttgttttatt tcggacgata att 23 <210> 5 <211〉 336 <212> DNA <213〉智人（Homo Sapiens) <220〉 <221> gene <222〉 (1).. (336) <223>人？05基因外顯子7至8之間的核酸序列 <400> 5 acgctggttg agatttttca aaatattggt gataccaatc ttgctgattt cactgctgga 60 ttgctcacca ttgtcgtctg tatggcagtt aaggaattaa atgatcggtt tagacacaaa 120 atcccagtcc ctattcctat agaagtaatt gtggtaagta gaatatgtag ttagaaagtt 180
[0003] cagcattatt tggttgacaa acaaggaatt attaaaacca atggagtttt taacatcttt 240 tgttttattt cagacgataa ttgctactgc catttcatat ggagccaacc tggaaaaaaa 300 ttacaatgct ggcattgtta aatccatccc aagggg 336
【權(quán)利要求】
1. 一種采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（FQ-PCR)檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A > G突變的 方法，其特征在于以PDS基因第7內(nèi)含子倒數(shù)第2個(gè)堿基（IVS7-2A > G)設(shè)計(jì)特異性野生 型探針及突變型探針，野生型及突變型探針?lè)謩e被標(biāo)記上不同顏色的熒光，同時(shí)在PDS基 因 IVS7-2A > G堿基兩側(cè)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，對(duì)于檢測(cè)樣本，依據(jù)野生型與突變型探針在 PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的熒光顏色不同來(lái)判斷樣本是否存在突變。
2. -種用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)PDS基因 IVS7-2A > G突變的試劑盒，其特征在于試 劑盒主要包括：PCR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，陽(yáng)性質(zhì)控品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PDS基因 IVS7-2A>G堿基 上游設(shè)計(jì)正向擴(kuò)增引物，在下游設(shè)計(jì)反向擴(kuò)增引物，其長(zhǎng)度均為10_30bp之間的核苷酸序 列，能夠擴(kuò)增出含有PDS基因 IVS7-2A > G區(qū)域的長(zhǎng)度為50-700bp的核苷酸片段，優(yōu)選地， 正向引物（SEQ ID N0:1)及反向引物（SEQ ID N0:2)為能擴(kuò)增出含有PDS基因 IVS7-2區(qū) 域60-150bp片段的特異性核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PDS基因 IVS7-2A>G區(qū)域 設(shè)計(jì)野生型探針及突變型探針，其長(zhǎng)度均為10_30bp之間的核苷酸序列。兩種探針均覆蓋 PDS基因 IVS7-2區(qū)域，其中野生型探針（SEQ ID NO :3)針對(duì)PDS基因 IVS7-2A > G野生型 位點(diǎn)，突變型探針（SEQ ID NO :4)針對(duì)PDS基因 IVS7-2A > G突變位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)液中包含熒光 檢測(cè)物質(zhì)。熒光檢測(cè)物質(zhì)為熒光探針，其中探針5'端標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)，3'端標(biāo)記熒光淬 滅基團(tuán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述的方法和試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi) 容：PCR反應(yīng)液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向型引物、反向型引物、 野生型熒光探針、突變型熒光探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及權(quán)利6所述的試劑盒，其特征在于待檢測(cè)靶核酸樣 品來(lái)自被檢測(cè)者的血液、唾液、羊水細(xì)胞或其它人體組織；陽(yáng)性質(zhì)控品為經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)結(jié)果 為PDS基因 IVS7-2A > G純合突變型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或含有相應(yīng)序列 的PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒載體；陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水、生理鹽水、鮭魚(yú)精子DNA ;陰性質(zhì)控品 也可以為經(jīng)過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)結(jié)果為PDS基因 IVS7-2A>G野生型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的 DNA或含有相應(yīng)序列的PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒載體。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104120167SQ201310142823
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】王寶恒, 史桂芝 申請(qǐng)人:王寶恒