專利名稱：特異識別腫瘤細胞的寡核苷酸配基bc15的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及特異識別上皮源性腫瘤細胞的寡核苷酸配基BC15的序列和修飾，以及 修飾后的BC15在識別上皮源性腫瘤細胞方面的應用，包括用于臨床腫瘤組織切片標本 的輔助診斷、基礎研究中腫瘤細胞株的分離、鑒定以及腫瘤生物導向治療。
背景技術：
目前，應用特異性抗體檢測相關標志物的的免疫組織化學或免疫熒光方法還是臨 床病理診斷的"金標準"。就上皮源性的腫瘤而言，已有多種標志物抗體在臨床應用。
如角蛋白(Keratin，Ker)、細胞角蛋白(Cytokeratin，CK)、上皮細胞膜抗原(印ithelial membrane antigen, EMA)及癌胚抗原(carci,mbryonic antigen, CEA)等都是重 要的腫瘤相關抗原，廣泛存在于各種上皮性腫瘤，多種類型的糖蛋白類腫瘤相關抗原 (carbohydrate antigen, CA)也相繼被發(fā)現在上皮性腫瘤組織中表達增加，如80% 以上的人體腺癌可在其細胞膜上檢出CA72-4,而非上皮性的惡性腫瘤及良性增殖性病 變均無該抗原表達。但總的看來，這些腫瘤相關抗原的特異性和敏感性都不高，臨床 上常常通過聯合檢測多種相關抗原來實現對腫瘤患者的臨床輔助診斷、預后評價、療 效指導、復發(fā)與轉移監(jiān)測等。因此，更多的腫瘤標志物及其抗體亟待發(fā)現和制備應用。 高通量的生物技術方法為腫瘤標泰物的鑒定及其探針的獲得提供了便利途徑。通 常應用蛋白質組學的方法來鑒定新的，中瘤標志物，也有學者應用腫瘤細胞膜成分免疫 動物直接獲得識別腫瘤細胞的特異性抗體，進而利用抗體鑒定相應靶抗原，即腫瘤標 志物。近年來，應用SELEX (Systematic Evolut ion of Ligands by Exponential Enrichment)技術獲得識別腫瘤細胞的特異寡核苷酸分子探針備受關注。SELEX技術原 理是單鏈隨機寡核苷酸(包括單鏈DNA和RNA)三維結構靈活易變，理論上能與各種 靶標分子結合，形成具有很強結合力的復合物。根據這一原理，利用分子生物學技術， 構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，將隨機寡核苷酸文庫與耙分子相互作用，保 留特異寡核苷酸配基(aptamer)，經反復擴增、篩選數個循環(huán)，即可篩選出能與該靶 子特異結合的寡核苷酸片段。從最初的單一靶標的篩選到后來的從:混合體系中篩選某 一類已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，SELEX顯示出了其獨特的應用價值。最近我們 在以細胞為靶子的SELEX技術(Wang C, et al. J Biotechnol; 2003:102: 15-22)基 礎上建立了腫瘤組織切片-SELEX技術，該技術的優(yōu)點是，研究者能夠在不知道腫瘤細 胞靶分子的性質的情況下篩選獲得特異識別腫瘤細胞的配基，而且所篩選腫瘤細胞來 源于臨床腫瘤患者腫瘤病理標本，篩選獲得的配基更具有實用性。本發(fā)明是通過臨床腫瘤病理組織切片-SELEX技術獲得了一個aptamer BC15。經鑒 定，BC15能夠特異識別多種腫瘤細胞株，包括乳腺癌細胞株MCF7、 MDA-MB-231， 肺癌細胞株A549，結腸癌細胞株HT29，子宮頸癌Hela，而不結合乳腺纖維囊性病上 皮細胞MCF10A; BC15還能夠特異識別受試的9例臨床乳腺癌患者的癌組織切片中的 異型癌細胞，而與癌旁組織切片中的細胞無結合。對照核酸序列與上述細胞及組織均 無結合。尤其重要的;l， BC15能夠識別冰凍切片中的癌細胞，這對于術中切除組織是 否癌變的快速判斷具有重要輔助診斷意義。另外，許多突破基底膜的癌細胞團也被BC15 特異染色，因此，BC15有助于少數早期病例的輔助診斷。BC15識別的靶分子是hnRNP Al，已有報道證實hnRNP Al在多種腫瘤組織包括肺癌、結腸直腸癌等過度表達，可能 作為一種新的腫瘤標志物用于臨床。由于BC15經FITC標記修飾后可直接用于熒光方 法檢測腫瘤細胞，操作較傳統(tǒng)免疫學方法更簡單。該發(fā)明可以在臨床醫(yī)學及基礎醫(yī)學 中得到廣泛應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提出特異識別腫瘤細胞的寡核苷酸配基BC15的序列及其應用領 域，包括在臨床腫瘤組織切片標本的輔助診斷、基礎研究以及腫瘤生物導向治療中的 應用。
本發(fā)明通過以下技術方案實現..
首先由Invi加gen公司合成BC15序列，并在5'端或3'端修飾、標記(如FITC、 生物素或者地高辛)；
然后進行應用研究組織化學或熒光方法檢測BC15識別的腫瘤細胞。
本發(fā)明優(yōu)點
1) 與蛋白類的抗體相比，單鏈的寡核苷酸更加穩(wěn)定；aptamer可直接體外合成、標記， 因此不需要標記的二抗，使得操作更為簡單、迅速；aptamer的合成成本較抗體制備 成本低，周期短。
2) BC15能夠識別乳腺癌石蠟切片、冰凍切片中的癌細胞胞核以及少數的侵襲性癌細 胞團胞核，因此具有重要的輔助診斷價值。 -
3) 本發(fā)明證實BC15能夠特異識別多種上皮源性腫瘤細胞。因此，BC15序列在臨床醫(yī) 學與基礎醫(yī)學的腫瘤研究相關領域中均具有廣泛的應用價值和廣闊的市場前景。


圖1 BC15特異結合乳腺導管癌病例石蠟及冰凍組織切片中的異型癌細胞的胞核。圖2 BC15識別多種病理類型的乳腺癌病例組織切片中的癌細胞。 圖3 BC15識別多種上皮源性腫瘤細胞株。
具體實施例方式
下面通過BC15對多種上皮性腫瘤細胞株以及臨床乳腺癌患者組織切片標本中的 癌細胞的識別來進一步描述本發(fā)明。
1. 合成BC15序列及對照GP30核酸序列，均在5'端標記FITC (Invitrogen公司完成)。 FITC-BC15:
CTAA-3' FITC-GP30:
CTAA-3'
注N代表A、 T、 G、 C任意一種。
2. 制備細胞爬片、準備組織切片
1) 細胞爬片分別收集乳腺癌細胞株MCF7、 MDA-MB-231及永生化乳腺纖維囊性病 上皮細胞MCF10A，調整細胞濃度至2X105/ml，接種預先放置蓋玻片的6孔板，爬 片過夜。甲醇-2(TC固定2hr, PBS沖洗。
2) 組織切片石蠟包埋的癌組織切#;友癌旁組織切片分別經二甲苯脫蠟30min，梯度 酒精入水(無水乙醇，10min; 95%乙醇，5min; 90%乙醇，5min; 80%乙醇，3min; 70%乙醇，lmin;雙蒸水，2min; PBS， 5min)，置預熱的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波 爐中低火(保持95'C，但不沸騰)照射20min，室溫放置緩慢冷卻進行抗原修復。 冰凍切片室溫平衡30min，甲醇固定10min, PBS沖洗。
3) 封閉上述處理后的細胞爬片或組織切片上滴加50ul封閉液(lyg/ultRNA，lu g/ul鮭魚精DNA， 1%BSA， 0.02%Tween20， PBS)，室溫封閉20min。
3. 孵育、結合、共聚焦留圖
1) FITC-BC15或FITC-GP30對照用PBS稀釋成40 u g/ml， 50 u 1滴加于細胞爬片或處 理后的組織切片上，濕盒內37'C孵育1.5hr。
2) PBS沖洗3遍，洗去未結合的配基。
3) 0.25%伊文氏蘭襯染，RT， 10min。同上PBS沖洗，抗熒光衰減封片劑封片。
4) 熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察、留圖(圖l，圖2，圖3)。實驗結果
BC15特異識別多種腫瘤細胞株及臨床乳腺癌病理組織切片中的癌細胞，結合部 位主要位于胞核。
由圖1可以得到結論BC15特異識別乳腺導管癌石蠟切片及冰凍切片中的癌細
胞，與癌旁組織無明顯結合，GP30對照與癌組織及癌旁組織均不結合。
由圖2可以得到結論BC15特異識別多種乳腺癌(包括粉刺癌、小葉癌及淋巴
結轉移灶)石蠟切片;的癌細胞，對照無結合。
由圖3可以得出結論BC15特異結合多種上皮源性腫瘤細胞株，與乳腺纖維囊
性病上皮細胞MCF10A無明顯結合。GP30對照與上述細胞無結合。
總之，BC15能夠識別多種腫瘤細胞，具有廣泛臨床應用和基礎應用前景。序列表
<110> 軍事醫(yī)學科學院醫(yī)學基礎所
<120>特異識別腫瘤細胞的寡核苷酸配基BC15的應用
<130>
〈160>1
〈210>1
〈211〉74
〈212>腿
<213>人工序列
<220>
<223>由組織切片SELEX篩選獲得的寡核苷酸配基序列 〈400> 1
gcaatggtac ggtacttcct gtggcgaggt鄰gtggggtg tgtgtgtatc caaaagtgca 60 cgctactttg ctaa 7權利要求
1.特異識別腫瘤細胞的寡核苷酸配基BC15在腫瘤鑒別診斷中的應用。其特征在于寡核苷酸配基BC15為序列表所示的74個堿基長的單鏈DNA。
2. 據權利要求1中所述方法，寡核苷酸配基BC15可以是體外化學合成的，也可 以是通過PCR或其他分子生物學方法制備的。
3. 據權利要求l中所述方法，寡核苷酸配基BC15的5'端或3'端可以經FITC、 生物素、地高i等標記。
4. 據權利要求l中所述方法，寡核苷酸配基BC15可識別多種上皮源性腫瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及特異識別上皮源性腫瘤細胞的寡核苷酸配基BC15的序列和應用。通過針對癌組織切片的SELEX技術獲得了BC15單鏈DNA寡核苷酸配基，標記FITC后，經熒光染色證明該配基能夠特異識別多種上皮源性的腫瘤細胞株和臨床乳腺癌病理切片中的癌細胞胞核。因此，BC15序列在腫瘤研究領域和臨床輔助診斷領域具有廣泛應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101619347SQ200810132910
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月1日 優(yōu)先權日2008年7月1日
發(fā)明者丁紅梅, 華 徐, 曹曉曉, 李少華, 沈倍奮, 芳 王, 邵寧生, 黃艷萍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所