專利名稱：靶向細(xì)胞外基質(zhì)的造影劑的制作方法
靶向細(xì)胞外基質(zhì)的造影劑 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的造影劑和其在診斷成像技術(shù)中的用途。更具體 地說本發(fā)明涉及包含靶向載體的造影劑，該載體結(jié)合膠原形成區(qū)域和細(xì)胞外基質(zhì)ECM。這種造影劑可用于活性纖維化(膠原沉積)的把 向和許多疾病病癥的診斷，病癥例如心衰、肝和肺纖維化、腹力菱后 纖維化、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癌癥和皮膚病癥。這種造影劑可 進(jìn)一步用于顯示慢性結(jié)瘢性炎性疾病、癜痕組織和粘連，觀察梗死 大小，顯示早期梗死和診斷充血性心衰。發(fā)明背景膠原是動物界最豐富的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)已知25種不同類型。其基本 結(jié)構(gòu)單元是三股螺旋，在膠原I中，螺旋由三種多肽組成，各自含有 1050個氨基酸。膠原纖維由三股螺旋間的側(cè)向相互作用形成。某些 膠原，特別^吏原IV,形成二維片層。膠原分子的氨基酸序列是高度重復(fù)的，這種規(guī)律反映在膠原纖 維結(jié)構(gòu)中。膠原I的氨基酸序列含有約20個18-氨基酸基序的拷貝， 基序中的每第三氨基酸是甘氨酸。各種膠原由成纖維細(xì)胞和某些上皮細(xì)胞產(chǎn)生。原始轉(zhuǎn)錄物是包 含用于從細(xì)胞輸出的信號序列的前膠原多肽，也是阻止締合形成三 股螺旋的前肽。在前膠原鏈中約50%的脯氨酸殘基和15-20%的賴氨 酸經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)加工形成羥脯氨酸和羥賴氨酸。這些4奮飾對膠原的枳^ 械性能是必須的。在細(xì)胞外，前肽被切割，開始自我組裝的過程。一般而言膠原是如骨、腱的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。例 如，膠原IV形成基底膜基本網(wǎng)絡(luò)，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞附著在其上。
部分膠原多樣性由不同類型膠原解釋，但也有大量各種膠原相關(guān)分 子。膠原纖維經(jīng)常締合至蛋白聚糖。這些蛋白由核心多肽和一種或 多種葡糖胺聚糖側(cè)鏈組成，也是非常多樣化的家族。在基底膜中， 層粘連蛋白和觸覺蛋白(巢蛋白)是重要成分。纖蛋白是一類有幾種基底膜蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白。粗纖維調(diào)節(jié)素(undulin)是纖維形成蛋 白，發(fā)現(xiàn)其在正常肝中少量與膠原締合，而在纖維化肝中大量締合。結(jié)締組織中的膠原和其它蛋白包含Arg-Gly-Asp氨基酸序列， 該序列賦予與細(xì)胞粘附分子整聯(lián)蛋白家族的結(jié)合。其它氨基酸序列 也可組成核心結(jié)合基序，配體其它部分提供了親和性以及特異性。P, 整聯(lián)蛋白在膠原蛋白結(jié)合中很重要。其它膠原-結(jié)合蛋白包括盤基菌 蛋白區(qū)域受體，通過活化酪氨酸激酶應(yīng)答于膠原。膠原纖維是橫向柔韌的，但既無彈性也無可壓縮性。結(jié)締組織 的彈性特性由彈性蛋白和其相關(guān)蛋白耐酸纖維蛋白(oxytalan)和彈性 纖維蛋白(elaunin)提供。纖蛋白1和2是其它蛋白，所述蛋白形成締 合彈性蛋白和其它結(jié)構(gòu)成分微纖維相關(guān)糖蛋白的彈性纖維。異常彈 性纖維發(fā)現(xiàn)于肝纖維化區(qū)域。膠原沉積是損傷愈合的常見過程，導(dǎo)致常見的"癜痕組織"形 成。膠原沉積是降低組織功能性的過程。這在組織的彈性重要時是 明顯的，突出的實例是心肌梗塞愈合中形成的癜痕組織。在肝中， 硬質(zhì)纖維的作用較不明顯。肝纖維化部分過程是肝細(xì)胞和肝竇有孔 內(nèi)皮間的細(xì)胞外基質(zhì)物質(zhì)的沉積，伴有竇狀隙向有普通基底膜的毛 細(xì)血管的轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化通過阻止血液和肝細(xì)胞間溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移降低肝功能。肝纖維化開始于導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷或死亡的損傷。該損傷啟動炎 癥反應(yīng)。細(xì)胞因子、趨化因子和ECM基質(zhì)蛋白(膠原和纖連蛋白)片 段的釋放導(dǎo)致肝細(xì)胞的活化和炎性細(xì)胞如粒細(xì)胞的募集。炎癥，包 括氧化應(yīng)激，是大多數(shù)肝纖維化起因的常見因素。重要事件是星形 細(xì)胞(aka酔脂細(xì)胞或Ito細(xì)胞)的活化。正常肝中這些細(xì)胞的最已知功 能是貯存維生素A?；罨瘯r，它們失去其維生素A,分化成肌成纖維 細(xì)胞。這些細(xì)胞是產(chǎn)膠原細(xì)胞。肝纖維化致病因子有多種乙醇、肝炎病毒、膽管炎、血色病、 Wilson氏病和schizostomiasis。在試驗動物(通常大鼠)中，纖維化可 由四氯化碳或硫代乙酰胺誘導(dǎo)。這些試劑多數(shù)產(chǎn)生特殊模式的肝損 傷，包括膠原沉積。炎癥反應(yīng)的作用是多樣的，在某些病癥例如血 色病中，氧化應(yīng)激很重要。如果限制損傷的程度和時間，所致纖維化是可逆的。在肝臟， 持續(xù)應(yīng)激可導(dǎo)致肝硬化，其特征在于普遍損傷，再生結(jié)節(jié)形成和使 肝結(jié)構(gòu)變形的纖維化。在大鼠中，I型膠原的半衰期為30天，III型 半衰期為15天。當(dāng)肝硬化由四氯化碳誘導(dǎo)時，兩種膠原的半衰期減 少50%。膠原的量達(dá)到高于正常值的5-10倍(但不超過30-35 mg/g)。肝纖維化的診斷和治療要點(diǎn)是預(yù)防不可逆的肝損傷和其后的功 能降低。膠原沉積的量增加和模式轉(zhuǎn)變指示肝纖維化。陽性組織活 檢認(rèn)為是確定答案。組織活檢是侵入性方法，有1-5%頻率的嚴(yán)重并 發(fā)癥。單次未導(dǎo)向的組織活檢將漏掉10-30%病例中的肝硬化。如果 檢測三份樣品，正確的診斷可增加到100%。由于并發(fā)癥發(fā)生率隨著 組織活檢進(jìn)行的次數(shù)而增加，似乎三次組織活檢可增加并發(fā)癥發(fā)生 率到10%水平。此外，組織活檢的評價遠(yuǎn)非直截了當(dāng)?shù)?。在肝病任何階段中，纖維化區(qū)域中最多有四倍變異；而且，不 同階段間的纖維化區(qū)域有大量重疊。因此，膠原量，如通過計算機(jī) 輔助成像分析計算的，在確定纖維化階段中具有極小價值。有經(jīng)驗 的觀察者使用標(biāo)準(zhǔn)化評分方法確實提供可信的階段信息。實際上， 這些系統(tǒng)工作如此好，以至只有極小動機(jī)去進(jìn)一步尋找月交原以外的 組織學(xué)標(biāo)記。然而，ECM基質(zhì)蛋白生腱蛋白在早期損傷時沉積，且 在經(jīng)常不存在于成熟的癜痕組織，而玻連蛋白是成熟纖維組織的標(biāo) 記。使用至今的肝纖維化的血清學(xué)標(biāo)記可分為兩種肝功能改變標(biāo) 記(平板計數(shù)，肝轉(zhuǎn)氨酶)和ECM反轉(zhuǎn)標(biāo)記。后者可包括膠原沉積(例 如循環(huán)的膠原前肽)和/或膠原降解(例如膠原IV循環(huán)片段)的標(biāo)記。謹(jǐn) 慎選擇的標(biāo)記組合可比單標(biāo)記得到更精確的結(jié)果，但關(guān)于此問題沒 有廣泛的認(rèn)可。明確需求可在早期階段、不可逆損傷發(fā)生前診斷纖維化的可信 試驗。將來試驗的非常期待的特征是定量ECM變化的能力。如上所述，膠原過度沉積減少組織彈性。這也包括在心肌梗塞 愈合中形成癜痕組織。在心臟損傷或心壁壓力持續(xù)增加后，心臟試 圖由重建補(bǔ)償。這種過程意味著心室腔大小和形狀的進(jìn)行性改變， 伴隨心肌組成的改變。典型的反應(yīng)包括存活心肌細(xì)胞的擴(kuò)大和膠原 類型、交聯(lián)和濃度的改變。似乎開始時細(xì)胞外基質(zhì)部分退化，伴隨 心肌細(xì)胞肥大。隨后是慢性補(bǔ)償階段，膠原濃度回復(fù)正常。但是， 如果心臟不能補(bǔ)償，除顯著纖維化外重構(gòu)導(dǎo)致顯著的心室擴(kuò)張。心 衰最后階段的特征在于細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)一步重構(gòu)，伴隨肌原纖維瓦 解和肌細(xì)胞減少。膠原持續(xù)累積，但膠原纖維以不規(guī)則方式堆積。纖維化是超過200種肺病的構(gòu)成成分。重復(fù)損傷或持續(xù)應(yīng)激例 如炎癥和/或吸入的顆粒，與改變結(jié)締組織沉積方向平衡的遺傳因素 一起，是常見的病因?qū)W成分。 一個實例是&蛋白酶抑制劑的缺乏， 該蛋白的活性也可作為吸煙的后果而減低。其主要功能是抑制嗜中 性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。如在其它器官的纖維化中，合成和降解之間 的不平衡可啟動實際上損傷功能的修復(fù)過程。如在心臟或肝的纖維 化中，肌成纖維細(xì)胞在病理學(xué)中顯著出現(xiàn)。它們最初作為成纖維細(xì) 胞募集，隨后分化。似乎"修復(fù)過程"可在沒有可察覺炎癥時持續(xù)， 導(dǎo)致進(jìn)行性的功能缺失。相關(guān)技術(shù)描述WO 89/10758描述了結(jié)合生物顆粒表面膜的化合物。這些化合 物包括生物-影響物質(zhì)，選擇至少一種烴取代基以使化合物有足夠非
極性，以賦予化合物脂質(zhì)結(jié)合能力，其中生物-影響物質(zhì)可以是菁染料。WO 93/11120描述了結(jié)合含脂質(zhì)生物相容性顆粒如細(xì)胞和病毒 的化合物。選擇這些化合物，以使化合物有足夠的非極性以賦予化 合物脂質(zhì)結(jié)合能力。發(fā)明概述本發(fā)明提供新造影劑，用于診斷和監(jiān)測治療涉及膠原過度形成 的疾病。膠原過度沉積相關(guān)疾病和適應(yīng)癥為例如心衰、肺和肝纖維 化、動脈粥樣-更化、關(guān)節(jié)炎和皮膚疾病。因此，本發(fā)明提供造影劑，用于診斷心衰和涉及膠原過度沉積 的其它疾病，例如上述疾病，該造影劑包含結(jié)合一個或多個可成傢— 部分的靶向部分?？沙上癫糠挚梢允墙o予對象時可產(chǎn)生所述造影劑 分布的至少部分所述對象的圖像的任何可成像部分，例如通過放射 成像、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像(SPECT)、正電子發(fā)射斷層成像 (PET)、磁共振成像(MRI)、 X射線、光學(xué)成像(OI)、超聲(US)、電阻 抗或》茲強(qiáng)成像才莫式。本發(fā)明進(jìn)一步提供所述疾病的成像方法和監(jiān)測這種疾病治療進(jìn) 程的方法。本發(fā)明也提供新的藥物組合物和制備診斷性造影劑的前 體。提供造影劑試劑盒，特別是制備放射藥物造影劑的試劑盒。本發(fā)明造影劑用通式(I)描述Z廣L-V-Z2 (I) 通式(I)將進(jìn)一步描述于下文中。發(fā)明詳述從一個方面看,本發(fā)明提供如權(quán)利要求中定義的式(I)的造影劑。在通式(I)的造影劑中Z廣L-V-Z2 (I)至少Z,和Z2之一存在，是在人和動物體體內(nèi)成像中相同或不同的可
檢測指示部分，V是與膠原形成區(qū)域有結(jié)合親和力的耙向部分，L是共價鍵、生物修飾物或連接部分。Z在下文中用于表示Z,和Z2之一或全部。Z可以是任何可成像 部分。對用于診斷、具體地說是體內(nèi)診斷的造影劑，Z部分包含一個 或多個可成像部分。當(dāng)可成像部分自身不能直接結(jié)合到V或L (當(dāng)存 在時)時，例如當(dāng)可成像部分是金屬顆?；蛳挛闹袠?biāo)注為M的金屬離 子時，那么Z包含YM部分，其中Y,是可結(jié)合到V或L(當(dāng)存在時) 并同時帶有M的部分。帶有是指在Y,和M部分之間任何形式的締 合例如化學(xué)鍵，如共價鍵或電價鍵或離子鍵或通過吸附或任何其它 類型的締合。當(dāng)M是金屬顆?；蚪饘匐x子時，Y,表示螯合劑。 Z和/或Y,M的性質(zhì)將依賴于應(yīng)用于診斷的成像模式。在體內(nèi)診 斷成像方法中Z和/或必須可直接或間接檢測，例如發(fā)射或可被 引起發(fā)射可檢測輻射(例如通過放射性衰變、熒光激發(fā)、自旋共振激 發(fā)等)的部分、影響局部電磁場(例如順磁性、超順磁性、亞鐵^茲性或 鐵磁性類)的部分、吸收或散射射線能量(例如生色團(tuán)、顆粒(包括含 有氣體或液體的小泡)、重元素和其化合物等)的部分和產(chǎn)生可檢測物 質(zhì)(例如微氣泡發(fā)生器)的部分。特別優(yōu)選下文中式(n)和(in)的螯合劑。合適的可成像部分的寬范圍從例如WO 98/18496中已知，其內(nèi) 容通過引用整體結(jié)合到本文中。成像模式和可成像部分Z和M詳述于下文中。在第一個實施方案中，在式(I)化合物中Z部分包含帶有一個或 多個可成像M部分的Yi部分，M用于輻射和SPECT成像模式。優(yōu) 選M是低或無a-和f3-發(fā)射的Y發(fā)射器，半衰期超過1小時。優(yōu)選基 團(tuán)M是放射性核素67Ga、 lllIn、 123I、 125I、 131I、 81mKr、 "Mo、 99mTc、 201TI和133Xe。最優(yōu)選為99mTc。M可進(jìn)一步由下列同位素或同位素對表示，其用于成像和治療 而不需要改變放射標(biāo)記方法或螯合劑47Sc2l; 141Ce58; 188Re75; 177Lu71; 199Au79; 47Sc21; 131I53; 67Cu29; 131I53和123I53; 188Re75和99mTc43; 9°￥39和87Y39; 47Sc21和,。21;卯Y39和123I53; 146Sm6》153Sm62;9°Y3> min,當(dāng)M表示金屬放射性核素時，Y,表示適合于與M形成穩(wěn)定螯 合物的螯合劑。這種螯合劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，這種螯合劑 的典型實例描述于WO 01/77145的表I中。特別優(yōu)選式(II)的螯合劑Y1:其中R,、 R2、 R3和R4各自獨(dú)立表示H、 Cw。烷基、C，烷芳基、C2. H)烷氧基烷基、Cw。羥烷基、C^。烷基氨基、,。氟烷基，或2個或 更多個R基團(tuán)與其連接的原子一起形成飽和或不飽和的碳環(huán)或雜環(huán)。 更特別優(yōu)選式(II)的螯合劑、，其中R,、 112和113是氫或甲基， R4是烷基氨基，最具體為式(III)化合物，在下文中標(biāo)注為cPN216。最優(yōu)選Z是cPN216與99mTc的螯合物。 式(n)和(III)的螯合劑的合成描述于WO 03/006070。 非金屬放射性核素z基團(tuán)如1231、 1251和1311可通過本領(lǐng)域技術(shù)式(III)
人員已知的取代或加成反應(yīng)共價結(jié)合到V和L (當(dāng)存在時)部分。在笫二個實施方案中，包含Z部分的式(I)化合物用于PET成像 模式。Z此時表示正電子發(fā)射性質(zhì)的放射發(fā)射物。優(yōu)選基團(tuán)Z是放 射性核素"C、 18F、 68Ga、 13N、 150和82Rb。特別優(yōu)選18F。也優(yōu)選與 螯合劑Y,螯合的金屬放射性核素82Rb和68Ga。硫醇偶聯(lián)化學(xué)、"F-合成子和使用硫醇偶聯(lián)化學(xué)制備的標(biāo)記肽描 述于WO 03/080544，其內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。使用硫醇偶聯(lián)化學(xué)標(biāo)記的肽的描述可見于WO2005/01235,其內(nèi) 容通過引用整體結(jié)合到本文中。在另一個優(yōu)選實施方案中Y,表示DOTA螯合劑，M是可使用 微波化學(xué)容易地導(dǎo)入螯合劑中的68Ga。非金屬放射性核素Z基團(tuán)例如18F可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 取代或加成反應(yīng)共價結(jié)合到V和L (當(dāng)存在時)部分，也描述于如WO 03/080544,其內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。在第三個實施方案中，式(I)化合物的Z部分包含帶有一個或多 個可成像部分M的Yi部分，M用于MR(磁共振)成像模式。此處M 指順磁性金屬離子，如美國專利4 647 447中提及的。特別優(yōu)選順磁 性金屬離子Gd3+、 Dy3+、 Fe"和Mn2+。、表示螯合劑，特別是螯合 劑如無環(huán)或環(huán)狀聚氨基羧酸酯(例如DTPA、 DTPA-BMA、 DOTA和 D03A)，例如美國專利4 647 447和WO 86/02841中所述。在MR成像中，M也可表示金屬氧化物例如超順磁性、亞鐵磁 性或鐵磁性物類，其被Z吸附，例如Z作為金屬氧化物的包衣。用 作MR造影劑的金屬氧化物描述于如美國專利4 647 447，其內(nèi)容通 過引用整體結(jié)合到本文中。在第四個實施方案中，式(I)化合物的Z部分包括帶有一個或多 個可成像部分M的Y,部分，M用于X射線成像模式。此處M表示 重金屬如W、 Au和Bi,其可為吸附到Z的氧化物形式或為金屬實 體(氧化價為O)形式。Z也可表示碘化芳基衍生物，具體地說是已知
的碘化X射線造影劑，例如商標(biāo)名為IopamidolTM和OmnipaqueTM的已知造影劑。這些試劑可通過其酰胺或氨基功能度連接到式(I)的V 和L(當(dāng)存在時)部分。
在另一個實施方案中式(I)化合物包含充氣微嚢形式的Z部分。 這種超聲成像劑可應(yīng)用于受體成像，例如當(dāng)將它們功能化以結(jié)合肽 時，如本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)例如WO98/18500中的描述。
在本發(fā)明的第六個實施方案中，式(I)化合物的Z部分可以是任 何在光學(xué)成像方法中可直接或間接檢測的部分。可檢測部分可以是 光散射體(例如有色或無色粒子)、光吸收體或光發(fā)射體。更優(yōu)選Z由 染料表示，例如生色團(tuán)或熒光化合物。Z部分可以是任何染料，該染 料與波長從紫外到近紅外的電磁譜內(nèi)的光相互作用。優(yōu)選形式的Z 有熒光特征。優(yōu)選的有機(jī)染料部分包括具有廣泛的不定域電子系統(tǒng)的基團(tuán)， 例如菁、份菁、吲哚菁、酞菁、萘菁(naphthalocyanine)、三苯基曱川、 p卜啉、吡啶菁(pyrilium )染料、硫代吡啶菁(thiapyrilium)染料、方酸 菁(squarylium)染料、克酮酸菁(croconium)染料、奧菁(azulenium)染泮牛、 靛苯胺、苯并吩噁嗪染料、苯并硫代吩噻。秦染料、蒽醌、萘醌、靛 蒽酮(indathrene)、鄰苯二曱酰吖啶酮、三(苯酚合苯醌)、偶氮染料、 分子內(nèi)和分子間電荷轉(zhuǎn)移染料和染料復(fù)合物、環(huán)庚三烯酮、四溱、 二(二硫雜環(huán)戊烯)復(fù)合物、二(苯二硫酚)復(fù)合物、碘苯胺染料、二(S,O-二硫雜環(huán)戊烯)復(fù)合物。熒光蛋白，例如具有不同吸收/發(fā)射特征的綠 色熒光蛋白(GFP)和GFP修飾物也是有用的。某些稀土金屬(例如銪、 釤、鋱或鏑)的復(fù)合物在某些情況下使用，例如為熒光納米晶體(量子 點(diǎn))。
優(yōu)選光學(xué)成像部分的實例是菁染料(CyDyeTM)。菁染料定義為 含有奇數(shù)個碳原子的多烯鏈化合物，所述碳原子由交替的單個和多 個(優(yōu)選兩個)碳-碳鍵連接，兩端均結(jié)束于氨基，其中一個氨基季銨 化。菁和類似的芳基-連接基團(tuán)-芳基生色團(tuán)任選帶有側(cè)鏈或稠環(huán)取代
式VI:碳雜菁式VII:氧雜菁基。菁染料的一般描述和其合成描述于美國專利6,048,982、 5,268,486 和歐洲專利1 037 947,它們均通過引用結(jié)合到本文中。菁染料因為 寬范圍光譜特征和可獲得的結(jié)構(gòu)變異而特別有用。 一 系列菁染料是 已知并測試過的，它們具有4氐毒性，可市售獲得(GE Healthcare,原 為Amersham Biosciences)。菁染料是有良好水溶性的高強(qiáng)度染料的 單一家族。它們在pH 3-10之間pH不敏感，顯示出低的非特異性結(jié) 合，比熒光素更耐光。菁染料優(yōu)選選自碳雜菁、氧雜菁、硫雜菁和氮雜菁，由下列通 式表示。<formula>formula see original document page 15</formula>式vni.硫雜菁<formula>formula see original document page 15</formula>式ix.氮雜菁在這些結(jié)構(gòu)中Ji基團(tuán)相同或不同，是取代或未取代的烷基，優(yōu)選Cl-C6烷基，可含有醚或-N-CO-N-基團(tuán)。烷基任選由羧基、磺酸 基團(tuán)、氨基、銨基或酯基取代。Jl基團(tuán)可與任何多烯鏈的碳原子形 成橋，例如通過-N-CO-N-基團(tuán)或醚基。J2基團(tuán)也相同或不同，是取 代或未取代的烷基。烷基任選由羧基或磺酸基團(tuán)取代，但優(yōu)選J2基 團(tuán)是低級烷基，例如Cl-C6烷基，最優(yōu)選曱基。任選的芳基以虛線 指示，以包括含有稠合苯并環(huán)或稠合萘并環(huán)兩者的結(jié)構(gòu)。環(huán)是取代 或未取代的。環(huán)可以由磺酸基團(tuán)、羧基、雍基、烷基(磺基烷基)氨基、
二(磺基烷基)氨基、磺基烷氧基、磺基烷基磺?；⑼榛蛉〈榛?或磺基烷基氨基取代。烷基基團(tuán)優(yōu)選為低級烷基如具有1-6個碳原 子。Y選自氫、囟素、氨基或磺酰基，優(yōu)選氫。菁染料多烯鏈也可 含有一個或多個環(huán)狀化學(xué)基團(tuán)，在多烯鏈的兩個或更多個碳原子之間形成橋，例如通過包括在鏈的兩個碳原子間的-co-基團(tuán)，如在squaraine染料中，或通過包括烷基橋。這些橋可用來增加染津十的化 學(xué)穩(wěn)定性或耐光性。在式VI-IX中，I是正整數(shù)1、 2、 3或4得到有三碳原子碳橋的 三曱川菁、五甲川菁、七曱川菁或九曱川菁染料。優(yōu)選地，菁染料 分別是具有3、 5或7碳原子碳橋的染料。Jl和J2是連接染料到靶向部分V的潛在連接點(diǎn)，任選通過連接 物部分L，優(yōu)選J1。在優(yōu)選方面中一個Jl連接到靶向部分V，而其 它Rl基團(tuán)是任選取代的Cl-C6烷基。適合光學(xué)成像方法的部分的進(jìn)一步描述見于WO 2005/003166， 其內(nèi)容通過引用整體結(jié)合到本文中。式(I)的化合物的V部分含有對膠原形成區(qū)域有親和力的氨基酸 序列X3-G-D?；衔飪?yōu)選含有其它氨基酸和任選的其它部分，其中 序列X3-G-D是肽載體結(jié)合位點(diǎn)，肽載體功能是作為載體結(jié)合到膠原 形成區(qū)i或。可約束(constrain)本發(fā)明的式(I)化合物，如通過在狀載體部分中 形成一個或多個環(huán)化橋。單環(huán)肽化合物可通過在氨基酸之間形成二 硫鍵或硫醚鍵得到。式(I)化合物優(yōu)選包含化合物的不同氨基酸之間 的兩個環(huán)化橋。術(shù)語"環(huán)化橋"指允許導(dǎo)入橋的氨基酸或氨基酸與 與帶有功能基團(tuán)的-(CH2)n-或-(CH2VQH4-基團(tuán)的任何組合。n表示 從1到10的正整數(shù)。優(yōu)選實例是二硫化物、二硫化物模擬物例如-(CH2)4-碳橋、硫代乙縮醛、硫醚橋(胱辟u醚或羊毛碌^氨酸)和含酯和醚 的橋。優(yōu)選地， 一個橋形成二硫鍵，第二個橋含有碌u醚(錄u化物)鍵。在另一個實施方案中，式(I)的載體V由式(VI)表示<formula>formula see original document page 17</formula>(VI)含有兩個環(huán)化橋，其中，X,表示共價鍵或l、 2、 3、 4或5個氨基酸殘基，其中一個氛基 酸殘基任選用連接部分L功能化，優(yōu)選所述氨基酸殘基擁有功能側(cè) 鏈例如酸或胺基團(tuán)，優(yōu)選選自天冬氨酸或谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、 二氨基丁酸或二氨基丙酸；乂2和乂4獨(dú)立表示能形成環(huán)化橋的氨基酸殘基，例如形成二硫鍵或硫醚鍵的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基，或其它能形成環(huán)化橋的氨 基酸殘基如天冬氨酸和賴氨酸，優(yōu)選X2和X4表示半胱氨酸或高半胱 氨酸殘基；Xg表示精氨酸、N-曱基精氨酸或精氨酸模擬物； Xs表示疏水氨基酸或其衍生物，優(yōu)選表示酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸殘基，更優(yōu)選苯丙氨酸或3-碘-酪氨酸殘基； X6表示能形成環(huán)化橋的氨基酸殘基，優(yōu)選含巰基氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸或高半胱氨酸殘基；R,表示能形成橋至X2、 乂4或X6之一的-(CH2)n-或-(CH2VC6lV部分；n表示從1到10的正整數(shù)。在本發(fā)明一個方面中，式(I)的L部分表示優(yōu)選基于單分散PEG 構(gòu)件的同系生物修飾物部分，含有1-10個所述構(gòu)件，所述生物^f奮飾 物有改變所述造影劑藥代動力學(xué)和血液清除率的功能。另外，L也可 表示1-10個氨基酸殘基，優(yōu)選甘氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或絲氨酸。 在一個優(yōu)選實施方案中，L表示含有單分散PEG樣結(jié)構(gòu)的生物修飾 物單元，式(V)的17-氨基-5-氧代-6-氮雜-3，9,12,15-四氧雜十七烷酸。
其中m等于l-10整數(shù)，C末端單元是酰胺部分。如上所注明，生物修飾物L(fēng)改變化合物的藥代動力學(xué)和血液清 除率。生物修飾物有效降低化合物在組織即肌肉、肝等中的才聶取， 由此作為更少背景干擾的結(jié)果得到更好的診斷成像。主要通過腎分 泌，這為生物修飾物增加了其它優(yōu)點(diǎn)。L可進(jìn)一步表示優(yōu)選從戊二酸和/或丁二酸和/或聚乙烯二醇基礎(chǔ) 單元和/或如上說明的式(V)單元衍生的部分。其它代表性L成分包括結(jié)構(gòu)型多糖、儲存型多糖、聚氨基酸和 其曱酯和乙酯、多肽、低聚糖和寡核苷酸，它們可含有或不含酶切 位點(diǎn)。本發(fā)明肽可使用所有已知的化學(xué)合成方法合成，但特別有用的 是使用自動肽合成儀的Merrifield固相方法(J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964))。合成策略的標(biāo)準(zhǔn)方法描述于E. Atherton & R.C. Sheppard, "Solid phase peptide synthesis: a practical approach", 1989, IRL出版-土， Oxford 。使用合成樹脂與酸敏感連接基團(tuán)，希望的受保護(hù)C末端氨基酸 殘基通過酰胺鍵形成與其連接。例如，可應(yīng)用所謂的Rink酰胺AM 樹脂與(二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基-衍生的連接基團(tuán)(Rink, H. (1987), Tetrahedron Lett. 30, p.3787)。肽從這種樹脂上酸解斷裂將產(chǎn) 生肽酰胺?；蛘?，可使用O-二-(氨基乙基)乙二醇三苯曱基樹脂(K. Barlos et al (1988), Liebigs Ann. Chem, p. 1079)，其在酸解斷裂時產(chǎn)生 有伯胺末端(handle)的肽。肽酰樹脂從C末端到N末端方向組裝。首先除去C末端氨基酸 的N-氨基-保護(hù)基，使用合適的縮合劑偶聯(lián)序列中的第二個氨基酸。 然后在交替步驟中重復(fù)N-氨基-去保護(hù)和偶聯(lián)環(huán)，直至組裝完期望的 序列。一般地，肽合成中所有存在的反應(yīng)基團(tuán)都被保護(hù)。已知寬范圍 的氨基酸保護(hù)基(見，如Greene, T.W. & Wuts， P.G.M. (1991) Protective groups in organic synthesis , John Wiley & Sons, New York)。 可使用正 交保護(hù)基策略(Barany, G. et al (1977), J. Am. Chem. Soc, 99, p. 7363)。 因此，例如，組合不同氨基保護(hù)基例如對哌啶敏感的9-藥基曱氧基-羰基(Fmoc)基團(tuán)和對酸高度敏感的4-曱基三苯甲基(Mtt)基團(tuán)，對肼 敏感的2-乙?；趸h(huán)己二酮(Dde)基團(tuán)和對酸敏感的叔-丁氧基羰 基(Boc)基團(tuán)，可在不同氨基位點(diǎn)選擇性導(dǎo)入不同部分。更進(jìn)一步， 通過組合Cys側(cè)鏈的對酸敏感的三苯曱基(Trt)保護(hù)基和其它Cys殘 基的叔丁基保護(hù)(在酸性氧化性條件如TFA-2。/。二曱基亞砜下敏感)， 得到選擇性二硫化物形成。完全肽酰樹脂可在N末端氯乙酰化，在N末端和Cys殘基之間 導(dǎo)入硫醚橋。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，通過在氮?dú)夥障掠肧n-MDP和Na""Tc04 溶液處理溶于蒸餾無氧緩沖溶液(pH約9)的化合物，以99mTc標(biāo)記肽。本發(fā)明通過非限制性實施例1-4進(jìn)一步說明。實施例描述了具 有兩種不同Z和/或Y,M部分的化合物的合成。也描述了化合物用 99mTc的標(biāo)記。肽中各種氨基酸的位置通過上標(biāo)數(shù)字而可見(如Cys2)。實施例實施例1iv^-cy^- g/w/c尸"""-tw^ w和其衡rc螯合物pa)
Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Rink酰氨MBHA樹脂1的固相合成對應(yīng)上述序列的肽酰樹脂通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽化學(xué)(Bamny, G; Kneib-Cordonier, N; Mullenm D.G. (1987) Int. J, Peptide Protein Research 30, 705-739)在Rink酰氨MBHA樹脂(0.73 mmol/g;自NovaBiochem)上 組裝。使用Applied Biosystems (Perkin Elmer) 433A型肽合成4義。殘 基(從羧基末端)以0.25 mmol規(guī)模在N-曱基吡咯烷酮(NMP)中用4倍 摩爾過量的N"-Fmoc-保護(hù)的氨基酸(1 mmol筒)和2-(lH-苯并三唑-l-基)-l,l,3,3-四曱基脲鏡-六氟磷酸鹽(HBTU)/l-羥基-苯并三唑(HOBt)/ 二異丙基乙基-胺(DIEA)使用單偶聯(lián)組裝，使用2.5小時偶聯(lián)循環(huán)。 使用NMP中的20%哌啶電導(dǎo)監(jiān)測完成Fmoc去保護(hù)。使用的氨基酸 側(cè)鏈保護(hù)基對Lys'是4-曱基三苯曱基(Mtt),對Cys2、 Cys6和Asp 是叔丁基(tBu),對Arg是2,2，5,7,8-五曱基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)，對Cys8是三苯甲基(Trt),對Lys"是叔丁氧基，絲(Boc)。組裝的肽酰樹脂然后轉(zhuǎn)移到手動氮?dú)馄鹋萜餮b置(Wellings, D.A., Atherton, E. (1997) in Methods in Enzymology (Fields, G. ed), 289, p. 53-54, Academic Presss， New York)。 N末端脫Fmoc J呆護(hù)，然后在二曱基曱酰胺(DMF)中氯乙?；褂?0倍摩爾過量的對稱酐，該酐通 過在二氯曱烷(DCM)中反應(yīng)氯醋酸(20 eq)和N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC) (10eq)形成。通過用含5%三異丙基硅烷(TIS)和1%三氟乙酸 (TFA)的DCM處理肽酰樹脂5 x 2分鐘，或直至濾液變成無色，選擇 性除去N、Lys1的Mtt-保護(hù)基。完整的肽酰樹脂ClCH2CO-Lys-Cys(tBu)國Arg(Pmc)-Gly-Asp(tBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Rink酰胺MBHA樹脂1用DMF中的5% DIEA中和，最后以DMF和DCM洗滌，在真空下干燥。Cys2-6; c[CH2CO-Lys(N-(5-磺基-萘基-2-基)-Succ)-Cys-Arg-Gly-Asp-6-氨基-l-萘磺酸(Dahl氏酸)(1 eq, 0.5 mmol)溶于含有N-曱基嗎 啉(NMM) (2 eq)的DMF中，然后加入丁二酸酐(10 eq)。反應(yīng)過j復(fù)后， 減壓下除去溶劑，產(chǎn)物以制備型RP-HPLC (反相HPLC)純化。柱 (Phenomenex Luna CI8 10, 22 x 250 mm)用在40分鐘內(nèi)0.1% TFA水 溶液中5-15。/。乙腈(ACN)的梯度以10 ml/min洗脫?；旌蠌?次連續(xù) 運(yùn)行收集的期望峰級分并凍千，得到l46 mg純的>|-(-5-磺基-萘_2-基)-琥珀酰胺酸2。分析型RP-HPLC: tR = 16.7分鐘，(Phenomenex Luna 5， 4.6 x 250 mm, 20分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中5-15% ACN, 1 ml/min, X=214 nm)。電噴霧MS:產(chǎn)物的期望[M+H]+是324.0 m/z，實測值是 324.0 m/z。向肽酰樹脂1中加入含有NMM (15 eq)的N-(-5-磺基-萘-2-基)-琥珀酰胺酸2 (5 eq)和N-[(二甲基氨基)-m-l，2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-l-基亞曱基]-N-曱基曱銨六氟磷酸鹽N-氧化物(HATU) (5 eq)的DMF溶 液。反應(yīng)在手動氮?dú)馄鹋菅b置中反應(yīng)過夜。得到的肽酰樹脂然后以含有2.5% TIS和2.5%水的TFA處理2 小時，以從樹脂上切下Cys"叔丁基保護(hù)的肽，同時從肽除去所有其 它側(cè)鏈保護(hù)基。過濾出樹脂殘留物，以少量純TFA洗滌。合并的濾 液和洗液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后以乙醚研磨，得到粗肽。沉淀 通過離心分離，以醚洗滌，然后從50% ACN-0.1% TFA水溶液凍干， 收得60 mg粗產(chǎn)物。然后環(huán)化線性肽，首先在室溫下將肽以0.5 mg/ml在pH 7.5 (以 液氨調(diào)節(jié))的50%乙腈-水中攪拌60分鐘，通過形成;e危醚橋進(jìn)^f亍。環(huán) 化產(chǎn)物凍干分離。其次，通過在室溫下60分鐘內(nèi)以0.5 mg/ml于 TFA-2。/。二甲亞砜中同時脫叔丁基保護(hù)和形成二硫化物，形成內(nèi)二硫 橋。在減壓下除去TFA,從醚中分離肽，如上所述干燥，收得62mg 環(huán)狀產(chǎn)物。粗肽通過制備型RP-HPLC純化。柱(PhenomenexLunaC18 10p, 50 x 250 mm)用60分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中5-15% ACN的梯 度以50 ml/分鐘洗脫。混合期望的峰級分并凍干，得到12 mg純的產(chǎn) 物3。分析型RP-HPLC: tR = 12.9分鐘，(Phenomenex Luna 5|li, 4.6 x 250 mm, 20分鐘內(nèi)0.P/oTFA水溶液中的15-25% ACN， 1 ml/min， X=214 nm)。電噴霧MS:產(chǎn)物期望的[M+H]+為M58.5 m/z，測定值為1458.2 m/z。cPN216-戊二?；Y合至肽3cPN216-戊二酰基-四氟苯硫基酯(2 eq)的DMF溶液加入到肽3 (1 eq, 0.008 mmol))的DMF溶液中，隨后是NMM (6 eq)。在攪拌過巧復(fù) 后，反應(yīng)混合物以減壓下除去溶劑，隨后用制備型RP-HPLC處理。 柱(Phenomenex Luna C18 lOp, 22 x 250 mm)用60分鐘內(nèi)0.1% TFA水 溶液中13-20% ACN的梯度以10ml/分鐘洗脫。混合期望的峰級分并 凍干，得到8 mg純的化合物4。分析型RP-HPLC: tR = 18.4分鐘, (Phenomenex Luna 4.6 x 250 mm, 20分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中 15-25%ACN， lml/min， X=214nm)。電噴霧MS:產(chǎn)物的期望[M+Hr
為949.4 m/z,測定《直為949.5 m/z。肽4的99mTc標(biāo)記肽4 (O.lmg)在鹽水或曱醇(O.l ml)中重構(gòu)，轉(zhuǎn)移至賦形劑的冷凍 干燥工具試劑盒。所述工具試劑盒設(shè)計為為基于氨基的螯合物提供 一般的放射標(biāo)記條件，含有無水氯化亞錫(16昭)、亞甲基二磷酸(25 嗎)、碳酸氫鈉(4500叫)、碳酸鈉(600叫)、對氨基苯曱酸鈉(200叫), 試劑盒pH- 9.2。然后加入鹽水(3 ml)中的高锝酸鈉("m丁c)注射液(2.1 GBq),反轉(zhuǎn)試劑盒幾次以溶解內(nèi)含物，然后放置于室溫下醉育15-20 分鐘。立即以HPLC和ITLC分析樣品，在試劑盒重構(gòu)后1-3小時之 間給予試驗對象99mTc標(biāo)記的肽。實施例2qyW-6; 6^// 5-磁-#差-2省-3鮮-丄，附5-鄉(xiāng)-#差-(力和其W"Tc螯合物^^
<formula>formula see original document page 23</formula><formula>formula see original document page 24</formula> Cys2曙6; c『CHzCO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysl-Gly-Lys(Glut-以上實施例1中描述的肽酰樹脂1是N、Lys'-保護(hù)的，通過使用 手動氮?dú)馄鹋菅b置用2-乙?；趸h(huán)己二酮(Dde-OH)的DMF溶液 處理2小時。部分保護(hù)的肽通過與包含2.5% TIS和2.5%水的TFA 處理2小時從樹脂上切下。處理反應(yīng)混合物，從醚分離肽，如實施 例1所述凍干，收得70 mg的ClCH2CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-Lys-NH2 5 。線性肽5通過如實施例1描述形成的硫醚橋環(huán)化，粗產(chǎn)物(78 mg) 以制備型RP-HPLC純化。柱(Phenomenex Luna C18 10^， 50 x 250 mm) 用60分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中20-45% ACN的梯度以50 ml/分鐘 洗脫?；旌掀谕姆寮壏植龈?，得到26 mg純的c[CH2CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys]-Gly-Lys-NH2 6。分析型RP-HPLC: tR = 16.35分鐘，(Phenomenex Lima 4.6 x 250 mm, 20分鐘內(nèi) 0.1% TFA水溶液中20-50% ACN, 1 ml/min, X=214nm)。電噴霧MS: 產(chǎn)物的期望[M+H]+為716.8 m/z，測定值為716.7 m/z。
然后將DMF中的cPN216-戊二?；?四氟苯硫基酯螯合物(2 eq) 加入到肽6 (1 eq, 0.009 mmol)，隨后是NMM (3 eq)，混合物攪拌過 夜。然后N、Lys1的Dde-基團(tuán)通過加入足夠的肼到反應(yīng)混合物中產(chǎn)生 2%溶液而除去。30分鐘后在減壓下除去溶劑，產(chǎn)物通過沉淀分離并 如上所述凍干。最后如實施例1所述完成肽的脫叔丁基保護(hù)和形成 二碌"匕物，收得18 mg肽7 。在肽7的N、Lys1位導(dǎo)入支鏈Dahl氏酸部分N-(Na'e-二-Boc-賴氨酰氧基)琥珀酰亞胺(3 eq)的DMF溶液加入 到肽7(1 eq, 0.006 mmol),隨后是NMM(5eq)。 18小時后，反應(yīng)完成， 在減壓下除去溶劑。肽殘基以含2.5% TIS和2.5%水的TFA處理15 分鐘，得到Cys2-6; c[CH2CO-Lys(N-Lys)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-Gly-Lys(Glut-cPn216)-NH2 8,通過沉淀分離，如上所述凍干。N-(-5-磺基-萘-2-基)-琥珀酰胺酸3 (10 eq)由DMF中含NMM (30 eq)的HATU(10eq)活化。30分鐘后，混合物加入到肽8(leq)的DMF 溶液中，允許反應(yīng)進(jìn)行24小時?；旌衔锶缟纤鎏幚恚瑑龈傻碾漠a(chǎn) 物以制備型RP-HPLC純化。柱(Phenomenex Luna C18 10^, 10 x 250 mm)用40分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中10-30% ACN的梯度以5 ml/分 鐘洗脫?；旌掀谕姆寮壏植龈桑玫? mg純的肽9。分析型 RP-HPLC: tR = 17.4分鐘，(Phenomenex L麗5p, 4.6 x 250 mm, 20分鐘 內(nèi)0.1。/oTFA水溶液中5-30% ACN， 1 ml/min,人=214 nm)。 MALDI-TOFMS:產(chǎn)物的期望[M+H]+為2330.95 m/z，測定值為2330.27 m/z。肽9的99mTc標(biāo)記肽9在如實施例1中標(biāo)記肽4的條件下用99mTc標(biāo)記。實施例3C2-6; c/C7/2C(9-iX_v5."-C，勿-G(y卻-C，-尸/2e-C"7,-<formula>formula see original document page 26</formula> 偶聯(lián)Cy5.5至肽7
Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯(2 eq)溶于NMP中，溶液中加入肽7 (1 e.q. 0.005 mmol)中，^是NMM (5 eq)。反應(yīng)允許在暗處進(jìn)行2天。 反應(yīng)混合物然后在45度通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后以0.1% TFA水 溶液稀釋，以制備型RP-HPLC純化。柱(PhenomenexLunaC18 10|i, 22 x250mm)用60分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中15-30% CAN的梯度以10 ml/分鐘洗脫。混合期望的峰級分并凍干，得到3.2 mg純的肽10。分 析型RP-HPLC: tR = 20.9分鐘，(Phenomenex Luna 5p, 4.6 x 250 mm, 20 14aCys2-6T c[CH:CO-Lys-CyS-Arg-Glv-Asp-CySPhe-Cvs]-Gly-BAFrT-rT1ut-cPN216 13的合成上述序列對應(yīng)的肽基樹脂以類似實施例1中肽基樹脂的方式在 O-二-(氨基乙基)乙二醇(BAEG)三苯曱基樹脂(0.44 mmol/g;自 NovaBiochem)上組裝。使用的N、Lys1保護(hù)基是l-(4,4-二曱基-2,6-二分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中15-30% ACN, 1 ml/min， X=214 nm)。電 噴霧MS:產(chǎn)物的期望[M+H]+為1245.97 m/z，測定值為1246.1 m/z。肽10的99mTc標(biāo)記肽IO在如實施例1中標(biāo)記肽4的條件下用""Tc標(biāo)記。實施例4<formula>formula see original document page 27</formula>
氧代環(huán)己-1 -亞基)乙基(Dde)。組裝的肽基樹脂然后轉(zhuǎn)移到手動氮?dú)馄?泡裝置，N末端脫Fmoc保護(hù)，然后使用DMF中IO倍摩爾過量的對 稱酐氯乙?；瑢ΨQ酐通過在DCM中反應(yīng)氯乙酸(20 eq)和DIC (10 eq) 形成。通過用含2.5% TIS和2.5%水的TFA處理肽基樹脂2小時， 進(jìn)行從樹脂切下部分保護(hù)的肽。處理反應(yīng)混合物，肽ClCH2CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-Gly-DEG-NH2 11 從醚分離，如上實施例l所述凍干。如實施例1所述通過形成硫醚橋環(huán)化線性肽11 (30 mg)，粗產(chǎn)物 以制備型RP-HPLC純化。C-18柱(Vydac 218TP1022, 10p, 22 x 250 mm) 用60分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中25-40% ACN的梯度以10 ml/分鐘 洗脫。混合期望的峰級分并凍干，得到15 mg純的肽c[CH2CO-Lys(Dde)-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys〗-Gly-DEG-NH2 12。分析型RP-HPLC: tR = 19.2分鐘，(Phenomenex Luna 4.6 x 250mm， 20分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中25-40% ACN, 1 ml/min， X=214 nm)。電噴霧MS:產(chǎn)物的期望[M+H]+為1434 m/z，測定值為1434.6 m/z。肽12 (1 eq, 15 mg)溶于DMF,加入cPN216-戊二酰基-四氟苯硫 基酯(2eq),隨后是NMM(3eq)，混合物攪拌過夜。然后通過加入足 夠的肼到反應(yīng)混合物產(chǎn)生2%溶液除去N、Lys1的Dde-基團(tuán)。30分鐘 后，在減壓下除去溶劑，以沉淀分離產(chǎn)物，如上所述凍干。最后如 實施例1所述進(jìn)行肽的脫叔丁基保護(hù)和形成二硫化物。收得18 mg 完全環(huán)化的肽13。偶聯(lián)8-異硫氰酰芘-l,3,6-三磺酸到肽13肽13 (1 eq, 5 mg)溶于DMF,加入少量等^f分的NMM調(diào)節(jié)pH至 8。然后加入DMF中的8-異硫氰酰芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(5 eq)，反 應(yīng)混合物攪拌過夜。反應(yīng)以RP-HPLC和MS分析監(jiān)測，產(chǎn)物以制備 型RP-HPLC純化。柱(Phenomenex Luna CI8 10 n, 22 x 250 mm)用60
分鐘內(nèi)0.1% TFA水溶液中5-60% ACN的梯度以10 ml/分鐘洗脫。 混合期望的峰級分并凍干，得到0.8 mg純的肽14。分析型RP-HPLC: tR = 2.04分鐘(寬峰)，(Phenomenex Luna 3[i, 4.6 x 5 mm, 10分4中內(nèi) 0.P/oTFA水溶液中10-80% ACN, 2ml/min， X=214 nm)。電噴霧MS: 產(chǎn)物的期望[M+H]+為1047.8m/z,測定值為1048.2 m/z。肽14的99mTc標(biāo)記肽14在如實施例1中標(biāo)記肽4的條件下用99mTc標(biāo)記。 <110>Amersham Health AS〈120〉造影劑〈130>PN0466〈160>3<170>Patentln version 3. 1<210>1<211>10<212〉PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<220〉<221>THI0ETH<222>(8)<223>殘基1和8之間的硫醚橋<220><221>DISULFID<222>(2)…(6)<223>殘基2和6之間的二硫橋<400>1Lys Cyi3 Arg Gly Asp Cys Phe C515<210〉2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>〈223>合成肽<220><221>THI0ETH〈222〉(D…(9)<223>殘基1和9之間的硫醚橋<220><221〉DISULFID<222〉(2)…(6)<223>殘基2和6之間的二硫橋 <400> 2Lys Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Lys1 5 10<210> 3<211> 9<212> PRT<213>人工序列<220><223>合成肽 <220><221〉 THIOETH<222> (1),. (8)<223>殘基1和8之間的硫醚橋<220><221> DISULFID<222> (2).. (6)<223〉殘基2和6之間的二硫橋<400〉 3Lys Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly 1 權(quán)利要求
1.一種通式(I)的造影劑Z1-L-V-Z2(I)其中至少Z1和Z2之一存在，它們是在人和動物體體內(nèi)成像中相同或不同的可檢測指示部分，V是結(jié)合膠原形成區(qū)域和細(xì)胞外基質(zhì)的靶向部分，L是共價鍵、生物修飾物或連接部分。
2. 權(quán)利要求1的造影劑，其中V包含氨基酸序列-X3-G-D-,其 中X3表示精氨酸、N-曱基精氨酸或精氨酸模擬物。
3. 權(quán)利要求1和2中任一項的造影劑，其中V是式(VI)的部分Ra-C (=0) -X廣X2-X3-G-D_X4-X5_X6 (VI)包含2個環(huán)化橋，其中Xj表示共價鍵或l、 2、 3、 4或5個氨基酸殘基； X:和乂4獨(dú)立表示能形成環(huán)化橋的氨基酸殘基； Xs表示精氨酸、N-曱基精氨酸或精氨酸模擬物； X5表示疏水氨基酸或其衍生物， X6表示能形成環(huán)化橋的氨基酸殘基，Ra表示能形成橋至X2、 乂4或X6之一的-(CH2)r或-(CH2)n-C6H4-部分；n表示1-10的正整數(shù)。
4. 權(quán)利要求3的造影劑，其中^表示1、 2、 3、 4或5個氨基酸殘基，其中至少一個氨基酸殘 基具有功能側(cè)鏈如酸或胺基團(tuán)，優(yōu)選選自天冬氨酸或谷氨酸、賴氨 酸、鳥氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。
5. 權(quán)利要求3-4中任一項的造影劑，其中X2和X4獨(dú)立表示形成二硫鍵或硫醚鍵的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基，或能形成環(huán)化橋的氨基酸殘基如天冬氨酸和賴氨酸。
6. 權(quán)利要求3-5中任一項的造影劑，其中 x2和x4獨(dú)立表示半胱氨酸或高半胱氨酸殘基。
7. 權(quán)利要求3-6中任一項的造影劑，其中 Xs表示酪氨酸、苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸或萘丙氨酸殘基。
8. 權(quán)利要求3-7中任一項的造影劑，其中 X6表示含巰基氨基酸殘基。
9. 權(quán)利要求3-8中任一項的造影劑，其中 又6表示半胱氨酸或高半胱氨酸殘基。
10. 前述權(quán)利要求中任一項的造影劑，其中L表示含有1-10個 氨基酸殘基的肽。
11. 前述權(quán)利要求中任一項的造影劑，其中L表示甘氨酸、賴 氨酸、天冬氨酸或絲氨酸殘基。
12. 權(quán)利要求1-9中任一項的造影劑，其中L含有一個或多個二 羧酸單元、乙二醇單元或PEG樣成分或其組合。
13. 權(quán)利要求1-9和12中任一項的造影劑，其中L含有一個或 多個diclycolyl、羥乙?；蜱牾；鶈卧蚱浣M合。
14. 權(quán)利要求1-9和12-13中任一項的造影劑，其中L表示生物 修飾物單元，所述單元含有式(V)的n-氨基巧-氧代-6-氮雜-3,9,12,15-四氧雜十七烷酸的單分散PEG樣結(jié)構(gòu)，<formula>formula see original document page 3</formula>其中m等于1-10的整數(shù)，C末端單元是酰胺部分。
15. 前述權(quán)利要求中任一項的造影劑，其中Z,和Z2表示相同或 不同的發(fā)射輻射和/或影響局部電磁場和/或吸收或散射輻射能量的指 示部分。
16. 權(quán)利要求15的造影劑，其中Z!和Z2表示在SPECT、 PET或光學(xué)成像模式中可成像的指示部分。
17. 權(quán)利要求15和16中任一項的造影劑，其中至少Z,和Z2之 一包含共價連接到V和/或L部分的非金屬放射性核素。
18. 權(quán)利要求17的造影劑，其中至少Zt和Z2之一包含"C、 18F、 1231、 1251和/或1311。
19. 權(quán)利要求18的造影劑，其中至少^和Z2之一表示式、M 的指示部分，其中M是金屬實體，優(yōu)選金屬離子實體，Yt是能結(jié)合 V和/或L和帶有M的螯合劑。
20. 權(quán)利要求19的造影劑，其中Y!是式(n)的螯合劑，<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rp R2、 R3和R4各自獨(dú)立表示H、 C!-,o烷基、q-,。烷芳基、C2-10 烷氧基烷基、Cw。羥烷基、CV,Q烷基氨基、Cw。氟烷基，或2個或更 多個R基團(tuán)與其連接的原子一起形成飽和或不飽和的碳環(huán)或雜環(huán)。
21.權(quán)利要求20的造影劑，其中所述螯合劑具有式(III)<formula>formula see original document page 4</formula>
22. 權(quán)利要求19-21中任一項的造影劑，其中M部分表示金屬 放射性核素、順磁性金屬離子、熒光金屬離子、重金屬離子或簇離 子。
23. 權(quán)利要求19-22中任一項的造影劑，其中M部分選自90Y、 99mTc、 mIn、 47Sc、 67Ga、 51Cr、 177mSn、 67Cu、 167Tm、 97Ru、 188Re、 177Lu、 '"Au、 2Q3Pb、 141Ce或18F。
24. 權(quán)利要求15-23中任一項的造影劑，其中Z,和Z2部分之一 是包含2個或更多個磺酸部分的菁染料，其它的Z,和Z2部分是用輻射發(fā)射物標(biāo)記的式(m)部分。
25. 權(quán)利要求19的造影劑，其中螯合劑Y,是DOTA。
26. 前述權(quán)利要求中任一項的造影劑，其中指示部分是用于 SPECT成像的99mTc或碘同位素，或用于PET成像方法的"C、 18F 或68Ga同位素，或用于MR成像的Gd3+。
27. —種藥物組合物，所述組合物包含有效量的式(I)造影劑或其 鹽，以及一種或多種藥物可接受輔料、賦形劑或稀釋劑，用于增強(qiáng) 在體內(nèi)成像中的圖像對比。
28. 式I造影劑用于制備造影劑的用途，所述造影劑用于膠原形 成相關(guān)疾病的i貪斷方法。
29. —種產(chǎn)生人或動物體的增強(qiáng)圖像的方法，所述人或動物體給 予了包含式(I)定義造影劑的造影劑組合物，所述方法包括產(chǎn)生至少 部分所述機(jī)體的圖像。
30. —種生產(chǎn)人或動物體的增強(qiáng)圖像的方法，所述人或動物體預(yù) 先給予了包含式(I)定義造影劑的造影劑組合物，所述方法包括產(chǎn)生 至少部分所述機(jī)體的圖像。
31. —種用于制備式I的放射性藥物組合物的試劑盒，所述組合 物包含配體-螯合劑綴合物和還原劑。
32. 權(quán)利要求31的試劑盒，其中所迷還原劑是亞錫鹽。
33. 權(quán)利要求31和32中任一項的試劑盒，所述試劑盒另外包含 一種或多種用于凍干的穩(wěn)定劑、抗氧化劑、填充劑和增溶劑。
全文摘要
一種通式(I)的造影劑Z₁-L-V-Z₂(I)其中存在至少Z₁和Z₂之一，它們是在人或動物體體內(nèi)成像中相同或不同的可檢測指示部分，V是與膠原形成區(qū)域有結(jié)合親和力的靶向部分，L是共價鍵、生物修飾物或連接部分。
文檔編號A61K49/00GK101107016SQ200580047072
公開日2008年1月16日 申請日期2005年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者A·赫利, D·洛夫豪格, H·B·菲耶丁斯塔, M·埃里克森 申請人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)股份有限公司