專利名稱：：對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乙酰肝素酶(heparanase)抑制劑在治療與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的病癥例如胰島炎或自身免疫1型糖尿病中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及對(duì)治療胰島炎或1型糖尿病的移植效果的改良。
背景技術(shù)：
：l型糖尿病(T1D)是一種自身免疫疾病，其中胰島的產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞遭到破壞。在人類中，該疾病對(duì)生活方式產(chǎn)生了巨大影響，并且外源胰島素療法對(duì)高血糖的不完善控制不可避免地會(huì)導(dǎo)致微血管疾病。該并發(fā)癥可能最終會(huì)引起腎病、心臟病、失明以及導(dǎo)致壞疽和截肢的神經(jīng)病。臨床的胰島移植有可能提供一種改良的T1D療法，這是因?yàn)楫?dāng)機(jī)體需要胰島素時(shí)它可以被生理性地釋放。另外，該方法可避免與胰腺移植相關(guān)的手術(shù)并發(fā)癥。作為T1D療法的臨床胰島移植在最近幾年隨著埃德蒙頓方案(Edmontonprotocol)的實(shí)施已取得相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。雖然有這樣的進(jìn)展，但是大量使用阻止對(duì)胰島移植的排斥反應(yīng)所需的免疫抑制藥物已嚴(yán)重地將其應(yīng)用局限于僅糖尿病已難以控制的成年受試者。再者，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，胰島功能最終會(huì)喪失并再次需要胰島素治療。這種移植物失功很可能是由于用于阻止對(duì)移植物的免疫排斥的免疫抑制藥物的毒性以及/或者自身免疫疾病的復(fù)發(fā)。因此，有必要開發(fā)更好的抗移植物排斥/破壞的方法以消除對(duì)有毒的免疫抑制藥物的需求，從而保持受試者的健康狀態(tài)和移植物的完整性。由于對(duì)存在于胰臟胰島中的產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞的自身免疫破壞，5NOD(非肥胖糖尿病)小鼠可自發(fā)地發(fā)展出糖尿病。自身免疫反應(yīng)的病理最初涉及非侵入性MNC(單核細(xì)胞)例如T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在胰島周圍的積聚。隨著雌性NOD小鼠的成長(zhǎng)，這種良性或非破壞性胰島炎的病理轉(zhuǎn)變成侵入性胰島炎(即破壞性自身免疫)，而調(diào)控這種轉(zhuǎn)變的因子尚不清楚(l)。形態(tài)度量學(xué)研究已表明，當(dāng)宿主胰臟中超過50%的胰島具有侵入性胰島炎時(shí)就會(huì)出現(xiàn)對(duì)P細(xì)胞的破壞，并且當(dāng)胰臟胰島素含量小于正常小鼠的10%時(shí)會(huì)出現(xiàn)糖尿病。在清潔級(jí)NOD小鼠群體中，糖尿病在雌性小鼠中的發(fā)病率可達(dá)到80%,而在雄性小鼠中為20%(1)。在NOD小鼠中胰島周圍胰島炎的發(fā)生及隨后的糖尿病發(fā)作是依賴于T細(xì)胞的過程，并且過繼轉(zhuǎn)移研究已證明，同時(shí)需要CD4+和CD8+T細(xì)胞。這種自身免疫T細(xì)胞反應(yīng)與偏向Thl的細(xì)胞因子鐠相關(guān)，并且被認(rèn)為最初是針對(duì)有限數(shù)量的自身抗原而產(chǎn)生的，但通過細(xì)胞內(nèi)分子擴(kuò)散和細(xì)胞間分子擴(kuò)散來發(fā)展，從而使得最終涉及到多種P細(xì)胞自身抗原，即胰島素原/胰島素、GAD65、IA-2和熱休克蛋白65(HSP65)。已經(jīng)確定由效應(yīng)T細(xì)胞群和調(diào)節(jié)T細(xì)胞群之素。本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即胰臟中胰島周圍的基膜在良性或在非破壞性胰島炎階段作為免疫屏障，阻止白細(xì)胞侵入胰島內(nèi)。就此而言，破壞性MNC浸潤(rùn)的發(fā)生與源自MNC的活化乙酰肝素酶對(duì)胰島BM(基膜)串珠蛋白聚糖(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)的局部損傷有關(guān)。本發(fā)明還涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，即由同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生的破壞中起關(guān)鍵性的作用。本發(fā)明人還有這樣的重要發(fā)現(xiàn)，即胰島內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)富含硫酸乙酰肝素，其可發(fā)揮維持P細(xì)胞健康的功能。胰島內(nèi)的破壞性胰島炎和MNC浸潤(rùn)的發(fā)展與ECM中的胰島內(nèi)石克酸乙酰肝素的降解有關(guān)。因此，胰島內(nèi)硫酸乙酰肝素明顯是P細(xì)胞存活必需的。因此，需要進(jìn)行治療來對(duì)抗乙酰肝素酶對(duì)胰島BM/ECM(基膜/細(xì)胞外基質(zhì))硫酸乙酰肝素的破壞。再者，需要改良的方法來阻止患有1型糖尿病的受試者中的移植排斥反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種抑制與胰島P細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)降解的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞外基質(zhì)與有效量的乙酰肝素酶抑制劑相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)可選自基膜、胰島周嚢(peri-isletcapsule)、胰島內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)或它們的任一組合。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種抑制與胰島p細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞外基質(zhì)與有效量的乙酰肝素酶抑制劑相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可以為串珠蛋白聚糖、XVIII型膠原或聚集蛋白。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種治療受試者中自身免疫病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥可選自胰島炎、1型糖尿病、對(duì)胰島移植物的排斥反應(yīng)或它們的任一組合。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種治療受試者中胰島炎的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種治療或預(yù)防受試者中對(duì)移植物的排斥反應(yīng)的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移植物為胰島移植物。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了一種降低與移植相關(guān)的免疫抑制治療水平的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移植為胰島移植。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了一種治療受試者中糖尿病的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖尿病是最近發(fā)作的l型糖尿病。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了一種用于制備藥物組合物的方法，包括將乙酰肝素酶抑制劑與可藥用的載體相混合。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療胰島炎的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療糖尿病的藥劑中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖尿病是最近發(fā)作的l型糖尿病。根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療移植排斥反應(yīng)的藥劑中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述移植為胰島移植。根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制胰島細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素降解的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制對(duì)受試者中移植物的排斥反應(yīng)的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，提供了乙酰肝素酶抑制劑在制備用于降低與移植相關(guān)的免疫抑制治療水平的藥劑中的用途。在第一方面、第二方面或第十二方面的任一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞外基質(zhì)可選自基膜、胰島內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)、胰島周嚢或它們的任一組合。在第四方面至第七方面的任一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰肝素酶抑制劑的給藥可以是全身性的或局部的。給藥可通過腸胃外、腔內(nèi)、膀胱內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部或口服。可以以這樣的形式給予所述乙酰肝素酶抑制劑，所述形式即與一種或多種可藥用的載體、佐劑或稀釋劑的組合物形式。根據(jù)本發(fā)明的第十六方面，提供了一種用于治療或預(yù)防與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的病癥的組合物，其中所述組合物包含乙酰肝素酶抑制劑及一種或多種可藥用的栽體、稀釋劑或佐劑。根據(jù)本發(fā)明的第十七方面，提供了一種用于治療或預(yù)防細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的病癥的組合物，其中所述組合物包含乙酰肝素酶抑制劑及至少一種其他免疫抑制劑或抗炎劑，并任選地包含一種或多種可藥用的載體、稀釋劑或佐劑。所述抗炎劑可選自甾類、皮質(zhì)甾類、COX-2抑制劑、非甾類抗炎劑(NSAID)、阿司匹林或它們的《壬一組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非甾類抗炎癥劑可選自布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、芬布芬(fenbufen)、非諾洛芬(fenprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、右酮洛芬(dexketoprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenicacid)、阿扎丙宗(azapropazone)、雙氣芬酸(diclofenac)、醋氯芬酸(aceclofenac)、二氟尼柳(diflimasil)、依托度酸(etodolac)、吲咮美辛(indometacin)、酮咯酸(ketorolac)、氯諾昔康(lornoxicam)、曱芬那酸(mefanamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、p比羅昔康(piroxicam)、羅非昔布(rofecoxib)、塞來昔布(celecoxib)、舒林酸(sulindac)、替i若昔康(tenoxicam)、托芬那酸(tolfenamicacid)或它們的任一組合。所述免疫抑制劑可選自阿倫單抗(Alemtuzumab),硫唑噤呤(azathioprine)、環(huán)抱素(ciclosporin)、環(huán)褲酰胺(cyclophosphamide)、來氟米特(lefunomide)、曱氨喋呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、利妥昔單抗(rituximab)、柳氮磺p比咬(sulfasalazine)他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)或它們的任一組合。根據(jù)前述方面的任一方面，所述乙酰肝素酶抑制劑可選自硫酸多糖(sulfatedpolysaccharides)、硫代磷酸寡脫氧核脊酸(phosphorothioateoligodeoxynucleotides)、非碳水化合物肝素?cái)M聚合物(non-carbohydrateheparinmimeticpolymers)、硫酸麥芽低聚糖(sulfatedmalto-oligosaccharides)、辯酸疏代甘露聚糖(phosphosulfomannans)、^琉酸間隔的寸氐聚糖(sulfatedspacedoligosaccharides)、硫酸連接的環(huán)多醇(sulfatedlinkedcyclitols)、糖氨基酸的At酸^f氐聚物(sulfatedoligomersofglycaminoacids)、假二糖(pseudodisaccharides)、制唾酸酶素B的衍生物(siastatinBderivatives),糖醛酸型Ge附-二胺l-TV-亞胺基糖(G^/ff畫diaminel國(guó)N—iminosugars)、^#曰^(suramin)^4i曰^^^"^、真菌代謝產(chǎn)物、二苯醚、咔唑(carbazole)、吲哚、苯并-l，3-唑衍生物(benz-l，3-azolederivatives)、2，3-二氫-l,3-lH-異吲咮-5-羧酸衍生物、呋喃基-l，3-^唑-2-基、苯并噁唑-5-基乙酸、聚(N-丙烯基氨基酸)，它們的代謝物、衍生物或類似物或者它們的任一組合。所述乙酰肝素酶抑制劑可以是單克隆抗體。所述乙酰肝素酶抑制劑可以是PI-88。以下將參考附圖僅通過示例的方式對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，其中圖1:(a)新生NOD/Lt胰島和(b)成年前驅(qū)糖尿病NOD/Lt胰島的細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素的阿利新藍(lán)(Alcianblue)染色。注意在(a)中，胰島基膜中存在有硫酸乙酰肝素的阿利新藍(lán)染色。圖2:用(a)兔抗小鼠巢蛋白-l和(b)兔抗小鼠串珠蛋白聚糖進(jìn)行的免疫熒光染色顯示，在無破壞性胰島炎的NOD胰島的基膜(見白色指示線)中存在(a)巢蛋白和(b)串珠蛋白聚糖(一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖即HSPG)。圖3:PI-88處理阻止了NOD/Lt小鼠中的自身免疫糖尿病的發(fā)生。與用鹽水(以0.2ml/天腹膜內(nèi)注射(i.p.))處理的對(duì)照小鼠(n=25)相比，以乙酰肝素酶抑制劑PI-88(以10mg/kg/天腹膜內(nèi)注射；以250pg/0.2ml/天腹膜內(nèi)注射鹽水溶液)處理周齡始于10.5周的前驅(qū)糖尿病的成年雌性NOD/Lt小鼠(n=23)阻止了臨床糖尿病的發(fā)作，說明PI-88可預(yù)防破壞性胰島炎。本發(fā)明人飼養(yǎng)的雌性NOD/Lt小鼠群體中的糖尿病發(fā)病率為60%。圖4:(a)正常BALB/c胰島由于基膜(BM)而顯示了清晰的邊界。*指示基膜。(b)在正常BALB/c小鼠中經(jīng)胰管體內(nèi)給予10jtg人血小板來源的純化乙酰肝素酶/0.5mlPBS,在送遞后24-48小時(shí)獲得了缺乏基膜的胰島的組織學(xué)證據(jù)(*)(原位)，因此表明正常的胰島形態(tài)在體內(nèi)可被乙酰肝素酶破壞。圖5:(a)經(jīng)胰管注入體內(nèi)后，人血小板來源的純化乙酰肝素酶(H)在與BALB/c胰臟中的胰管相關(guān)聯(lián)的胰島周圍的免疫組織化學(xué)定位；兔抗人乙酰肝素酶的多克隆抗體。(b)對(duì)來自(a)中的BALB/c胰臟的背景染色，條件是不存在抗乙酰肝素酶一抗而存在褲酸鹽緩沖液(稀釋劑)和辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔Ig。圖6:(a)對(duì)照BALB/c胰島于10%CO2、卯％空氣中培養(yǎng)24小時(shí)后的宏觀外觀。(b)BALB/c胰島與人血小板來源的乙酰肝素酶(20jig/ml)孵育24小時(shí)后的外觀。與對(duì)照胰島不同，體外乙酰肝素酶處理10導(dǎo)致了對(duì)胰島的周圍損傷，以及在一些情況下的胰島降解(C)。圖7:(a)前驅(qū)糖尿病雌性NOD/Lt胰臟的蘇木精和伊紅染色證明了存在完整的胰島(i)以及具有非破壞性胰島炎的胰島(ii)和破壞性胰島炎的胰島(iii)。(b)以阿利新藍(lán)/0.65M氯化鎂/pH5.8對(duì)相同胰臟標(biāo)本進(jìn)行的組織學(xué)染色在完整的胰島(i)中以及胰島基膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ii)中檢測(cè)到了硫酸乙酰肝素；在破壞性胰島炎進(jìn)展至胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的過程中，ECM的HS組分被破壞，如余下的胰島細(xì)胞團(tuán)(iii)中不完整的藍(lán)染所示(iii)。圖8:(a)PI-88治療可預(yù)防胰島同基因移植物中的疾病復(fù)發(fā)。移植于糖尿病雌性NOD/Lt小鼠的腎包膜(kidneycapsule)下的450-500個(gè)雌性NODscid胰島的同基因移植物使非禁食血糖水平返回至正常范圍(由陰影區(qū)域表示正常范圍)。在對(duì)照受體(圓圈)中不再進(jìn)一步處理的情況下，高血糖從第3天開始恢復(fù)。相反，在從第3天開始以PI-88(10mg/kg/天腹膜內(nèi)注射)處理的糖尿病NOD小鼠中，NODscid胰島同基因移植物維持血糖量正常最長(zhǎng)至14天(方塊)。在收集時(shí)，所述對(duì)照同基因移植物(b)顯示了迅速蔓延的自身免疫破壞(單核細(xì)胞浸潤(rùn)物)和胰島殘余物(*)，而來自PI-88-處理小鼠的蘇木精和伊紅染色的同基因移植物(c)顯示了血管重建的胰島(卞)，并且在胰島周圍有MNC的積聚(*)。圖9:如免疫熒光法所確證的，被分散為單細(xì)胞的分離的胰島主要是產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞。與在2天培養(yǎng)期間仍保持完整的對(duì)照胰島細(xì)胞相比，以細(xì)菌類肝素酶(肝素酶)(I+II+III;0.25U/ml)處理1小時(shí)的p細(xì)胞會(huì)死亡(a)。將被處理的細(xì)胞置于ECM(通過細(xì)胞系在體外產(chǎn)生)上能夠在很大程度上從類肝素酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中拯救P細(xì)胞(a)。這些結(jié)果表明，胰島p細(xì)胞的存活需要細(xì)胞結(jié)合的HS。作為對(duì)該觀點(diǎn)的支持，通過對(duì)培養(yǎng)物提供5-50嗎/ml的肝素(一種高度硫酸化形式的硫酸乙酰肝素)，有效地拯救了細(xì)菌肝素酶處理的p細(xì)胞(*P<0.0001)(b)。圖10:與在移植后7天顯示出更嚴(yán)重的胰島破壞(卞)的相應(yīng)對(duì)照胰島同種異基因移植物(allograft)相比(b)，來自移植后7天的PI-88處理的受體CBA/H(H-2k)小鼠的BALB/c(H-2d)胰島同種異基因移植物顯示出單核細(xì)胞(*)在胰島周圍積聚(a)。因此，PI-88對(duì)宿主的處理使得被移植的同種異基因胰島得到更好的保持。定義本文使用的某些術(shù)語具有如下給出的含義。本文使用的術(shù)語"包含"是指"主要但不必是唯一地包括"。而且，單詞"包含"的變化形式，例如動(dòng)詞形式的"包含，，和第三人稱單數(shù)動(dòng)詞形式的"包含"具有作出相應(yīng)改變的意義。本文使用的術(shù)語"治療"和"療法"是指任何和所有的應(yīng)用，所述應(yīng)用可以任何可能的方式來治療病癥或癥狀，預(yù)防病癥或疾病形成或者預(yù)防、阻礙、延緩或逆轉(zhuǎn)病癥或疾病或者其他不良癥狀的進(jìn)程。本文使用的術(shù)語"有效量"的含義包括試劑或化合物的無毒性但足以提供所需效果的量。所需的精確量因受試者而異，這取決于諸如所治療的物種、受試者的年齡和總體狀況、所治療病癥的嚴(yán)重度、被給予的具體藥劑以及給藥模式等因素。因此，不可能指定精確的"有效量"。然而，對(duì)于任何給定病例，適當(dāng)?shù)?有效量，，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。本文使用的術(shù)語"與胰島P細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)"是指包圍或大體上包圍胰島P細(xì)胞或胰島本身但不一定與其接觸的任一細(xì)胞外組分。這些組分還包括硫酸乙酰肝素和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，例如串珠蛋白聚糖、XVIII型膠原或聚集蛋白。術(shù)語"細(xì)胞外基質(zhì)"的含義包括基膜。本文使用的術(shù)語"烷基"的含義包括，具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的單價(jià)的("烷基")和二價(jià)的("亞烷基")直鏈或支鏈飽和脂肪基團(tuán)。所述烷基基團(tuán)可以為d-6烷基。所述烷基基團(tuán)可以為d-4烷基。所述烷基基團(tuán)可以為c^烷基。因此，例如，術(shù)語烷基包括但不限于曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、1，2-二曱基丙基、l，l-二曱基丙基、戊基、異戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-曱基戊基、3-曱基戊基、2，2-二曱基丁基、3，3-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、1，2，2-三曱基丙基、1，1，2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、l-曱基己基、2，2-二曱基戊基、3，3-二甲基戊基、4，4-二曱基戊基、1，2-二甲基戊基、1，3-二甲基戊基、1，4-二曱基戊基、1，2，3-三曱基丁基、U，2-三曱基丁基、1，1，3-三甲基丁基、5-甲基庚基、l-曱基庚基、辛基、壬基、癸基等。12本文使用的術(shù)語"芳基"是指具有6-14個(gè)碳原子的單價(jià)的("芳基")和二價(jià)的("亞芳基")單環(huán)、多環(huán)、軛合和稠合的芳烴殘基。所述芳基基團(tuán)可以為Cwo芳基。芳基的實(shí)例包括苯基、萘基、菲基等。所述芳基基團(tuán)可以任選地被取代，例如被獨(dú)立地選自曱基、乙基、鹵素、CF3、CH2OH、OH、O-曱基和O-乙基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代。具體實(shí)施例方式首先應(yīng)理解，本文提供的附圖和實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明及其各實(shí)施方案進(jìn)行舉例說明而非對(duì)其進(jìn)行限定。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解的組合物、方法和試劑盒。所述方法通常包括使用包含至少一種乙酰肝素酶抑制劑的組合細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)由一個(gè)大分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，所述網(wǎng)絡(luò)填充組織中的細(xì)胞外空間并為不同器官中的細(xì)胞提供分子支架(3)。ECM由結(jié)構(gòu)蛋白(如膠原)、特化蛋白(如層粘連蛋白)和蛋白聚糖(如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，包括串珠蛋白聚糖、XVIII型膠原或聚集蛋白(2))構(gòu)成。通常，基膜(BM)為薄片形式的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),它包圍細(xì)胞群，從而提供了物理支持和細(xì)胞遷移的主要屏障(3)。它們一般由蛋白和多糖組分組成。硫酸乙酰肝素糖胺聚糖為BM的主要多糖組分(4，5)。本發(fā)明人已經(jīng)驗(yàn)明，胰島內(nèi)ECM富含硫酸乙酰肝素(參見圖1)，且包圍胰島的BM含有串珠蛋白聚糖(參見圖2(b))。因此，本發(fā)明人集中研究了作為一種關(guān)鍵的BM組分并作為MNC介導(dǎo)的乙酰肝素酶所致降解的初始靶標(biāo)的串珠蛋白聚糖。串珠蛋白聚糖是一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，由一個(gè)核心蛋白(400-470kDa)和三個(gè)與之連接的多糖(糖胺聚糖)硫酸乙酰肝素(HS)組成(6)。HSPG/串珠蛋白聚糖與IV型膠原和層粘連蛋白相互作用，從而穩(wěn)定了整個(gè)BM結(jié)構(gòu)。在血管的BM中，串珠蛋白聚糖主要促進(jìn)膜帶陰離子電荷(由于帶負(fù)電荷的硫酸根)和有選擇的通透性(6)。糖苷內(nèi)切酶(內(nèi)型-p-葡糖醛酸糖苷酶)——乙酰肝素酶(也被稱為肝素酶)是唯一已知的可剪切HSPG的硫酸乙酰肝素(HS)(也被稱為硫酸肝素)鏈的哺乳動(dòng)物酶。乙酰肝素酶以大約65kDa的酶原形式產(chǎn)生，為了形成有活性的酶需要被蛋白水解剪切成兩個(gè)較小的多肽(8kDa和50kDa)(7，8)。至少對(duì)于T細(xì)胞而言，乙酰肝素酶的表達(dá)似乎受促炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，并且該酶最終可以通過磷酸甘露糖受體結(jié)合于細(xì)胞表面上(3)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶在侵入細(xì)胞降解ECM所需的場(chǎng)所(armoury)、特別是在轉(zhuǎn)移性腫瘤和腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵功能(3)。乙應(yīng)，#錄考應(yīng)4磁^乙應(yīng)，#^犖庠及詳^/勿/^破銀^W^應(yīng)本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，胰島周嚢具有與包含串珠蛋白聚糖(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖即HSPG)的基板或基膜(BM)—致的性質(zhì)。再者，胰島內(nèi)浸潤(rùn)伴有對(duì)基膜的嚴(yán)重破壞。對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究已表明，由于降解性酶例如乙酰肝素酶對(duì)基本的BM和/或細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，可出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵入(3)。類似地，在NOD/Lt胰臟中，包圍胰島的BM在非破壞性胰島炎期間作為免疫屏障，阻止白細(xì)胞侵入胰島內(nèi)。破壞性MNC浸潤(rùn)的發(fā)生與源自MNC的活化乙酰肝素酶對(duì)胰島基膜的局部損傷有關(guān)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了下述獨(dú)特的事實(shí)，即一旦基膜屏障被打通，所述破壞性胰島炎的進(jìn)程就與乙酰肝素酶對(duì)胰島內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸乙酰肝素的破壞有關(guān)，并且與p細(xì)胞死亡有關(guān)。對(duì)胰島的體內(nèi)(圖4和5)和體外乙酰肝素酶處理可造成胰島損傷，并且在一些情況下會(huì)完全破壞胰島(圖6)。因此，p細(xì)胞的存活不僅依賴于胰島ECM-p細(xì)胞的完好關(guān)聯(lián)，而且依賴于完好BM和胰島內(nèi)ECM硫酸乙酰肝素的維持。就被移植到腎包膜下的胰島而言，所述移植物可由來源于宿主的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行血管重建，所述毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)來源于宿主腎實(shí)質(zhì)中的血管。在胰島移植排斥反應(yīng)和自身免疫破壞過程中活化白細(xì)胞所采用的路徑涉及從新形成的移植物內(nèi)血管的遷移，或者從移植物下的腎組織中鄰近原有腎血管的遷移。白細(xì)胞向炎癥部位的募集需要活化的T細(xì)胞穿過附近部位的血管內(nèi)皮并通過內(nèi)皮下的BM進(jìn)入相鄰組織。在白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上并滾動(dòng)以及與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的趨化因子相互作用后，它們會(huì)借助諸如MMP和乙酰肝素酶等多種酶的降解功能穿過內(nèi)皮細(xì)胞之間的血管內(nèi)皮，然后通過內(nèi)皮下的BM(9)。發(fā)u酸乙酰肝素?fù)?dān)當(dāng)趨化因子的血管粘附配體、粘合劑/固定劑/轉(zhuǎn)運(yùn)劑，并擔(dān)當(dāng)白細(xì)胞在內(nèi)皮下BM中遷移的屏障。乙酰肝素酶對(duì)BM石危酸乙酰肝素的降解是對(duì)白細(xì)胞遷移關(guān)鍵且重要的過程?；罨疶細(xì)胞/白細(xì)胞不是遷移自胰島內(nèi)毛細(xì)血管，而是從胰島周圍的移植物內(nèi)位點(diǎn)移動(dòng)，穿過胰島BM并進(jìn)入胰島細(xì)胞團(tuán)。這種MNC遷移需要乙酰肝素酶-介導(dǎo)的BMHSPG的降解?；罨陌准?xì)胞、受促炎性細(xì)胞因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板可產(chǎn)生乙酰肝素酶(10,11)。在嚙齒動(dòng)物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶活性的表達(dá)與T細(xì)胞通過血管BM的滲出以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥的發(fā)生有關(guān)(12)。同樣，在嚙齒動(dòng)物中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥已經(jīng)被乙酰肝素酶抑制劑PI-88的體內(nèi)處理所阻止。活體顯微術(shù)證明了白細(xì)胞的滾動(dòng)和與血管BM的粘附，但無滲出。這些結(jié)果表明，PI-88還能抑制活化的MNC進(jìn)入胰島移植物。^4移潛參Wf々,2瘦^4《發(fā)'^敏4'^雖然NOD小鼠中胰島炎的形成和糖尿病的發(fā)作是需要CD4+和CD8+T兩種細(xì)胞的依賴于T細(xì)胞的過程，但是移植至糖尿病NOD小鼠的NODscid胰島同基因移植物以及NOD小鼠中的疾病復(fù)發(fā)卻是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的，并且可通過耗盡或非耗盡的抗CD4單克隆抗體治療來阻止。因?yàn)橐葝uP細(xì)胞是II類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-ve,所以糖尿病相關(guān)的P細(xì)胞-特異性自身抗原似乎是由一種或多種移植物內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞(APC)群加工并且以與宿主II類MHC關(guān)聯(lián)方式呈遞，從而導(dǎo)致被自身反應(yīng)性CD4T細(xì)胞識(shí)別并對(duì)胰島P細(xì)胞造成間接損傷。與抗CD4單克隆抗體治療不同，用抗CD154單克隆抗體的共刺激阻斷方案沒有阻止胰島同基因移植物中的疾病復(fù)發(fā)或者僅使之延遲。雖然在采用非清髓條件處理的糖尿病NOD小鼠中混合型造血干細(xì)胞嵌合體的誘導(dǎo)可保護(hù)NOD胰島移植物使之免受自身免疫損傷，但是該實(shí)驗(yàn)方法不適合于臨床的胰島移植。一般而言，預(yù)防胰島移植物中的疾病復(fù)發(fā)是一個(gè)難以克服的障礙，并且仍然是現(xiàn)在臨床的胰島移植試驗(yàn)的主要關(guān)注點(diǎn)。自身反應(yīng)性T細(xì)胞穿過被移植的同基因胰島的基膜并通過胰島內(nèi)ECM侵入至移植物部位的過程也是乙酰肝素酶依賴的。因此，本發(fā)明涉及由乙酰肝素酶抑制劑例如PI-88來防止自身反應(yīng)性T細(xì)胞穿過被移植的同基因胰島的基膜侵入移植物位點(diǎn)。應(yīng)名付/^^Sf差西移控胰島同種異基因移植物的排斥反應(yīng)是由于移植物中被動(dòng)攜帶的供體型過客白細(xì)胞(passengerleukocyte)直接激活了抗供體的反應(yīng)性T細(xì)胞(13)。CD4+和CD8+T細(xì)胞對(duì)該排斥反應(yīng)過程的貢獻(xiàn)似乎受以下因素的影響供體/受體品系的組合、胰島組織的分化狀態(tài)以及在胰島移植物中存不存在II類MHC+ve管上皮。研究已經(jīng)證明，在以下處理之后，延長(zhǎng)了胰島同種異基因移植物存活，通常還伴有耐受誘導(dǎo)在體外以高氧預(yù)處理胰島組織或者以抗CD8單克隆抗體或抗CD4+抗CD8單克隆抗體短時(shí)間處理受體小鼠，用鼠科CTLA4-Fc或抗CD154單克隆抗體與供體特異性輸注或者與抗-ICOS單克隆抗體聯(lián)合的抗-CD154單克隆抗體共刺激阻斷。單獨(dú)使用免疫抑制藥物或者與其他試劑結(jié)合使用免疫抑制藥物的其他研究已證明，可誘導(dǎo)穩(wěn)定的胰島同種異基因移植物的存活。在許多這類模型中，已證明耐受性依賴于宿主的調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細(xì)胞，表明這是一個(gè)積極的免疫調(diào)節(jié)過程。然而，在患有自身免疫誘導(dǎo)的糖尿病的同種異基因宿主的情況下，在常規(guī)的無自身免疫的小鼠中可有效阻止同種異基因移植物排斥反應(yīng)的免疫治療通常不會(huì)成功，或者充其量是延遲排斥反應(yīng)(14-16)。這個(gè)問題的原因在于胰島同種異基因移植物也對(duì)自身免疫攻擊敏感(17)，并因此需要靶向兩個(gè)獨(dú)立的破壞機(jī)制自身免疫疾病的排斥反應(yīng)和復(fù)發(fā)。在NOD小鼠中使用重度免疫抑制方案或供體特異性造血干細(xì)胞嵌合體已經(jīng)克服了這些障礙，但對(duì)于臨床的胰島移植來說這種方法是有問題的(例如有害的副作用)或不切合實(shí)際的。由于該原因，白細(xì)胞遷移經(jīng)過BM及對(duì)胰島內(nèi)硫酸乙酰肝素的破壞的乙酰肝素酶-依賴性機(jī)制已成為干涉治療的目標(biāo)，這是因?yàn)樗且葝u移植物中胰島同種異基因移植物排斥反應(yīng)和自身免疫疾病復(fù)發(fā)的共同通路。實(shí)際上，用呈現(xiàn)幾分抑制乙酰肝素酶活性的肝素處理小鼠已經(jīng)延長(zhǎng)了小鼠中皮膚同種異基因移植物的存活。本發(fā)明涉及這樣的意外發(fā)現(xiàn)，即乙酰肝素酶在胰島同種異基因移植物排斥反應(yīng)中起到重要作用。此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，乙酰肝素酶抑制劑例如PI-88可以延遲常規(guī)小鼠中胰島同種異基因移植物的免疫破壞，并且可以保護(hù)自身免疫的糖尿病NOD宿主中的胰島同基因移植物。因此，乙酰肝素酶抑制劑可構(gòu)成一種用于臨床胰島移植的新治療劑，并且可最小化或者避免對(duì)有害的免疫抑制藥物的需求。16乙鷹，#凝#辦乙酰肝素酶是一種內(nèi)型-P-葡糖醛酸糖苷酶，它剪切出現(xiàn)于細(xì)胞表面的蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素側(cè)鏈并作為包圍細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的主要組分。已經(jīng)分離或者合成了多種乙酰肝素酶抑制劑，包括肝素及修飾的肝素衍生物、被認(rèn)為作為過渡態(tài)類似物的多種天然及合成的聚陰離子聚合物和較小分子。各類分子及它們的具體實(shí)例在下文中討論。本發(fā)明的乙酰肝素酶抑制劑選自硫酸多糖、硫代磷酸寡脫氧核苷酸、非碳水化合物肝素?cái)M聚合物、硫酸麥芽低聚糖、磷酸硫代甘露聚糖、硫酸間隔的低聚糖、硫酸連接的環(huán)多醇、糖氨基酸的硫酸低聚物、假二糖、制唾酸酶素B的衍生物、糖醛酸型Gew-二胺l-7V-亞胺基糖、蘇拉明和蘇拉明類似物、真菌代謝產(chǎn)物、二苯醚、咔唑、吲哚和苯并-l，3-唑衍生物。所述乙酰肝素酶抑制劑可以包括單克隆抗體。所述硫酸多糖可選自肝素、l-角叉菜膠、K-角叉菜膠、巖藻多糖、戊聚糖多硫酸酯、6-0-羧曱基曱殼質(zhì)IE、硫酸昆布多糖(laminarinsulfate)、螺旋藻含鈣藻膠(calciumspirulan)和硫酸葡聚糖。非碳水化合物肝素?cái)M聚合物的實(shí)例選自以下式1-式7所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在式l-7中，n小于或等于60。硫酸麥芽低聚糖的實(shí)例選自以下式8-式11所示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式Ri13eOBn13f0(CH2)7CH313gOPEG5000-OMe13hOPEG2000-OMe13iNHCOCH2OPh13jNH-LC-生物素硫酸"間隔的"低聚糖的實(shí)例由以下通式16表示,-0OXxoox化R-烷基或芳基間隔子在式16中，X可以為S03Na或H。另外，在式16中，R可以是烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基或烷基芳基芳基。硫酸"間隔的"低聚糖的其他實(shí)例可由下文所示的通式14和式15的化合物表示。式:_^_14間二甲苯基15(CH2)10在式14和15中，X可以為S03Na或H。硫酸連接的環(huán)多醇的實(shí)例選自式17和19表示的化合物。由式18表示的化合物是制備該環(huán)多醇的起始試劑。在式17和19中，X可以為S03Na或H。糖氨基酸的硫酸低聚物的實(shí)例選自以下式20、21和22的化合物。20202211在式20-22中，X可以為S03Na或H。假二糖的實(shí)例選自以下式23和24的化合物及其鹽。2324制唾酸酶素B的f汙生物的實(shí)例選自以下式25、26、27和28的化合物。HOOH、C02HHO^uV^NHHO^^NHHO^ONHHoX^NHNHAcOHNHAcNHAc25262728糖醛酸型Ge附-二胺l-2V-亞胺基糖的實(shí)例選自以下式29、30和31的化合物及其鹽。HO-HO-AcHNNHNHNH32Me33Et34tBu35真菌代謝產(chǎn)物的實(shí)例選自以下式36、37和38的化合物。r，HONHCOCF329HOHOC02HNHCOCF3H02CNHCOCF3HO"^^NH.HCI3031蘇拉明和蘇拉明類似物的實(shí)例選自以下式32、33、34和35的化合物。式32和35是相同化合物的不同表示。Na03SS03NaNa03SS03NaNHHNHN〕w、NHc22<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>二苯醚、吵唑、吲哚和苯并-1，3-唑衍生物的實(shí)例選自以下式39、39a、40、41和42的化合物及其鹽。S03H42H03S.所述乙酰肝素酶抑制劑還可選自以下的化合物<h2N\nhNHCOCF3HONaS03HNOOS03Na.OS03Na治^W逸合參;^,法用于本發(fā)明中的化合物可以以組合物的形式治療性地或預(yù)防性地給予。在一種治療應(yīng)用中，以足夠治愈或者至少部分地阻止疾病及其并發(fā)癥的量，將組合物給予已經(jīng)患有該疾病的受試者(例如疾病發(fā)作早期)。所述組合物提供的所述化合物或藥劑的量應(yīng)足以有效地治療所述受試24者。通常，合適的組合物可以依照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，因而可包括可藥用的載體、稀釋劑和/或佐劑。用于制備可給藥的組合物的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且更詳細(xì)i己栽于眾'j如/e附/wgto"jPA"/7flce"http://c"/iSc/e"ce，15thed"MackPublishingCompany,Easton，Pa.中，該出版物通過引用的方式納入本文。用于本發(fā)明的組合物可包括局部制劑(topicalformulation),并包含活性成分和一種或多種可用的載體、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑，以及可選的任一其他治療成分。適宜于局部給藥的制劑包括適宜于滲透過皮膚到達(dá)需要治療部位的液體或半液體制劑，例如搽劑、洗劑、乳膏、軟膏劑或糊劑，以及適宜給予眼、耳或鼻的滴劑。用于本發(fā)明的滴劑可以包含無菌水性或油性溶液或懸浮液。所述滴劑可以通過將所述活性成分溶解于含有殺細(xì)菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其他合適防腐劑的水溶液中制得，并且任選地包含表面活性劑。然后可以將所形成的溶液過濾使之澄清，轉(zhuǎn)移至合適的容器中并滅菌?？梢酝ㄟ^以下方式完成滅菌高壓滅菌即在卯。C-100。C下保持半小時(shí)，或者通過過濾，之后經(jīng)無菌操作將其轉(zhuǎn)移至容器內(nèi)?？砂谒龅蝿┲羞m合的殺細(xì)菌劑和殺真菌劑的實(shí)例有硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002%)、苯扎氯銨(0.01%)和醋酸氯己定(0.01%)。用于制備油性溶液的合適溶劑包括甘油、稀乙醇(dilutedalcohol)和丙二醇。用于本發(fā)明的洗劑包括那些適合應(yīng)用于皮膚或眼的洗劑。眼用洗劑可以包含任選地包含殺細(xì)菌劑的無菌水溶液，并且可以通過與上述關(guān)于滴劑制備的方法類似的方法制備。用于皮膚的洗劑或搽劑也可以包含速干并冷卻皮膚的試劑(例如乙醇或丙酮)和/或增濕劑，例如甘油或者油(如蓖麻油或花生油(arachisoil))。用于本發(fā)明的乳膏、軟膏劑或糊劑是所述活性成分的外用半固體制劑。它們可以通過如下方式制備將極細(xì)的或粉末形式的所述活性成分(單獨(dú)或者在水性流體或非水性流體的溶液或懸浮液中)與油脂性基質(zhì)(greasybasis)或非油脂性基質(zhì)(non-greasybasis)混合。該基質(zhì)可以包括烴類，例如硬石蠟、軟石蠟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂(metallicsoap);膠漿劑；天然來源的油，例如杏仁油、玉米油、花生油(arachisoil)、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸(例如硬脂酸或油酸)與醇(例如丙二醇或聚乙二醇(macrogol))。所述組合物可以摻入任何適合的表面活性劑，例如陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑或者例如山梨坦酯或其聚氧乙烯衍生物的非離子型表面活性劑。也可以包含助懸劑和例如羊毛脂的其他成分，所述助懸劑例如天然樹膠、纖維素衍生物或例如硅酸二氧化硅(silicaceoussilicas)的無4幾材料。所述組合物也可以以脂質(zhì)體的形式給藥。脂質(zhì)體通常來自于磷脂或其他脂質(zhì)物質(zhì)，并通過分散在水性介質(zhì)中的單層或多層水合液晶形成?？梢允褂萌魏螣o毒、生理可接受且可代謝的能夠形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。脂質(zhì)體形式的所述組合物可以包含穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等等。優(yōu)選的脂質(zhì)為磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，兩者可以是天然的，也可以是合成的。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域已知的，關(guān)于這方面具體可參見Prescott編著，MethodsinCellBiology,第XIV巻，AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，第33頁等，其內(nèi)容通過引用的方式納入本文。所述組合物還可以以適宜于通過吸入給藥(例如通過鼻內(nèi)吸入或口吸入)的氣霧劑形式(例如液體或粉末)給藥。結(jié)合方案通過結(jié)合方案可實(shí)現(xiàn)治療的優(yōu)勢(shì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，可將本文公開的乙酰肝素酶抑制劑作為治療胰島炎和/或1型糖尿病的結(jié)合治療方法的一部分給予。在結(jié)合治療中，各藥劑可以被同時(shí)給予，或者被以任一順序序貫給予。如果序貫給予，那么優(yōu)選以相同的途徑給予各組分?；蛘?，各組分可以配制為單劑量單位形式的結(jié)合產(chǎn)品。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知曉可用于與本發(fā)明的組合物結(jié)合的合適藥劑。本發(fā)明的治療方法可以與常規(guī)治療聯(lián)合應(yīng)用。常規(guī)治療可包括在移植之前處理胰島(例如以高氧)。常規(guī)治療還可包括抗炎性治療、免疫抑制治療、手術(shù)或其他形式的醫(yī)學(xué)介入?？寡讋┑膶?shí)例包括甾類、皮質(zhì)甾類、COX-2抑制劑、非甾類抗炎癥劑(NSAID)、阿司匹林或它們的任一組合。非甾類抗炎癥劑可選自布洛芬、萘普生、芬布芬、非諾洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、噻洛芬酸、阿扎丙宗、雙氯芬酸、醋氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、氯諾昔康、曱芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、羅非昔布、塞來昔布、舒林酸、替諾昔康、托芬那酸或它們的任一組合。免疫抑制劑的實(shí)例包括阿倫單抗、硫唑嘌呤、環(huán)孢素環(huán)磷酰胺、來氟米特、甲氨喋呤、霉酚酸酯、利妥昔單抗、柳氮磺吡啶、他克莫司、西羅莫司或它們的任一組合?？梢灾委熜缘鼗蝾A(yù)防性地給予本文公開的化合物和組合物。在一種治療應(yīng)用中，將化合物和組合物給予已經(jīng)患病的患者，給藥量足夠治愈或者至少部分地阻止所述病癥及其癥狀和/或并發(fā)癥。所述化合物或組合物提供的活性化合物的量應(yīng)足以有效地治療所述患者。浙量針對(duì)任何具體患者的有效治療劑量水平將依賴于多種因素，包括所治療障礙及該障礙的嚴(yán)重度；使用的化合物或藥劑的活性；使用的組合物；受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；給藥時(shí)間；給藥途徑；藥劑或化合物的滯留(s叫uestration)率；治療的持續(xù)時(shí)間；與治療結(jié)合使用或同時(shí)使用的藥物，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的其他相關(guān)因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定藥劑或化合物的治療可施用疾病所必需的有效且無毒的量。通常，預(yù)期的有效劑量范圍為每24小時(shí)每kg體重約0.01mg-約100mg;—般地，每24小時(shí)每kg體重約0.02mg-約卯mg;每24小時(shí)每kg體重約0.03mg-約80mg;每24小時(shí)每kg體重約0.04mg-約70mg;每24小時(shí)每kg體重約0.05mg-約60mg;每24小時(shí)每kg體重約0.06mg-約50mg。更一般地，預(yù)期的有效劑量范圍為每24小時(shí)每kg體重約0.07mg-約40mg;每24小時(shí)每kg體重約0.08mg-約30mg;每24小時(shí)每kg體重約0.09mg-約25mg;每24小時(shí)每kg體重約O.lmg-約20mg。或者，有效劑量的上限可以至約500mg/m2。通常，預(yù)期的有效劑量范圍為約25-約500mg/m2,優(yōu)選約25-約350mg/m2，更優(yōu)選約25-約300mg/m2,還更優(yōu)選約25-約250mg/m2,甚至更優(yōu)選約50-約250mg/m2，還甚至更優(yōu)選約75-約150mg/m2。在治療應(yīng)用中，治療通常貫穿于疾病狀態(tài)的持續(xù)期。而且，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，各次給藥的最佳量和給藥間隔將由以下因素決定所治療的疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度；給藥形式、途徑和部位；以及所治療的具體個(gè)體的情況。這種最佳條件也可以通過常規(guī)技術(shù)確定。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說還顯而易見的是，最佳療程(例如在確定的天數(shù)內(nèi)每天給予的組合物的劑量數(shù))可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)的療程確定試驗(yàn)來確定。發(fā)絲逸本發(fā)明的組合物可以是適宜于注射給藥的形式、適宜于口服攝入的制劑形式(例如膠嚢劑、片劑、膠嚢形片劑(caplet)、酏劑(elixir))、適宜于局部給藥的軟膏、乳膏或洗劑形式、適宜于作為滴眼劑送遞的形式、適宜于經(jīng)由肺吸入(例如鼻內(nèi)吸入或口腔吸入)給藥的氣霧劑形式(例如液體或粉末)、適宜腸胃外(例如靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi))給藥的形式，即皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射。4'#、孝#浙、腐多唐;^佐身載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑在以下方面必須是"可用的"，即與所述組合物的其他成分相容并對(duì)其受者無毒。這類載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑可用于增強(qiáng)本發(fā)明的組合物的完整性和半衰期。它們還可以用于增強(qiáng)或保護(hù)本發(fā)明的組合物的生物活性?？伤幱幂d體或稀釋劑的實(shí)例是去礦質(zhì)水或蒸餾水；鹽水溶液；植物油，例如花生油(peanutoil)、紅花油、橄才莧油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如曱基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和曱苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮(volatilesilicone);礦物油，例如液體石蠟、軟石蠟或角鯊?fù)?；纖維素衍生物，例如曱基纖維素、乙基纖維素、羧曱基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級(jí)烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級(jí)芳烷醇；低級(jí)聚烷撐二醇或低級(jí)烷撐二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，例如棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；西黃蓍膠或阿拉伯膠，和石油凝膠(petroleumjelly)。通常，所述一種或多種載體占所述組合物重量的10%-99.9%。28所述載體還可以包括與本發(fā)明的化合物共價(jià)結(jié)合的化合物或融合蛋白。這類生物載體和化學(xué)載體可用于增強(qiáng)所述化合物向靶標(biāo)的送遞，或者增強(qiáng)所述化合物的治療活性。用于產(chǎn)生融合蛋白的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且i己載于例如AusubelW(見CurrentProtocolsinMolecularBiology.WileyInterscience，ISBN047150338，1987)和SambrookCa/(見MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,ThirdEdition2001)中。本發(fā)明的組合物可以是適宜于注射給藥的形式、適宜口服攝入的制劑形式(例如膠嚢劑、片劑、膠嚢形片劑(caplet)、酏劑(elixir))、適宜于局部給藥的軟膏、乳膏或洗劑形式、適宜于作為滴眼劑送遞的形式、適宜于吸入(例如鼻內(nèi)吸入或口腔吸入)給藥的氣霧劑形式、適宜腸胃外給藥的形式(即皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射)。對(duì)于作為可注射的溶液或懸浮液給藥而言，無毒的可用于腸胃外的稀釋劑或載體可以包括林格氏溶液(Ringer'ssolution),等滲鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水、乙醇和l，2-丙二醇。一些適宜于口服的栽體、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑的實(shí)例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、藻酸鈉、阿拉伯膠、西黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服制劑可以包含合適的調(diào)味劑和著色劑。當(dāng)以膠嚢劑形式使用時(shí)，所述膠嚢劑可以用例如延緩膠嚢劑崩解的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的化合物作為包衣。供口服給藥的固體形式可以包含可用于人藥和獸藥實(shí)踐中的粘合劑、增甜劑、崩解劑、稀釋劑、調(diào)味劑、包衣劑(coatingagent)、防腐劑、潤(rùn)滑劑和/或時(shí)間延遲劑(timedelayagent)。合適的粘合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米淀粉、西黃蓍膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠、黃胞膠、膨潤(rùn)土、海藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高呤土、纖維素、碳酸鉤、硅酸4丐或磷酸二鈣。合適的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油(oilofwintergreen)、櫻桃、橙或覆盆子調(diào)味劑。合適的包衣劑包括丙烯酸和/或曱基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、蟲膠或谷蛋白。合適的防腐劑包括苯曱酸鈉、維生素E、29a-生育酚、抗壞血酸、對(duì)羥基苯曱酸曱酯、對(duì)鞋基苯曱酸丙酯或亞硫酸氫鈉。合適的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石粉。合適的時(shí)間延遲劑包括單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。供口服給藥的液體形式除包含上述試劑以外還可以包含液體載體。合適的液體載體包括水、油(例如橄欖油、花生油(peanutoil)、芝麻油、向曰葵油、紅花油、花生油(arachisoil)、椰子油)、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯，或它們的混合物。供口服給藥的懸浮劑還可以包含分散劑和/或助懸劑。合適的助懸劑包括羧甲基纖維素鈉、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉或乙醇(acetylalcohol)。合適的分散劑包括卵磷脂；脂肪酸(例如硬脂酸)的聚氧乙烯酯(polyoxyethyleneester);聚氧乙烯山梨糖醇(polyoxyethylenesorbitol)的單油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylenesorbitan)的單油酸酯或其二油酸酯或其硬脂酸酯或其月桂酸酯；諸如此類。供口服給藥的乳劑還可以包含一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上文給出的分散劑或者天然膠例如瓜爾膠、阿拉伯膠或西黃蓍膠。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，所述組合物可以作為單獨(dú)的藥劑或者作為結(jié)合治療方法的一部分給藥，用于在診斷階段或在該階段后治療自身免疫疾病(例如胰島炎和/或1型糖尿病)，例如作為后續(xù)治療或鞏固治療來補(bǔ)充現(xiàn)有的對(duì)這種疾病的治療。所述組合物還可以用于對(duì)在遺傳上或在環(huán)境上易發(fā)生這種疾病的受試者進(jìn)行預(yù)防性治療。下面將通過參考以下的具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)地描述，所述實(shí)施例不應(yīng)被以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1乙瘋躇^//發(fā)'破銀#腐^義及侈#潛尿病本發(fā)明人進(jìn)行的研究已經(jīng)表明，與新生NOD小鼠相比，前驅(qū)糖尿病及糖尿病發(fā)作NOD小鼠中的乙酰肝素酶轉(zhuǎn)錄物增加7倍；在正常CBA/H小鼠中僅檢測(cè)到了背景水平(見表1)。這些結(jié)果已經(jīng)被這樣的證據(jù)加強(qiáng)，即以乙酰肝素酶抑制劑PI-88(9)處理10-11周齡雌性NOD/Lt小鼠可在最長(zhǎng)至24周齡的小鼠中阻止臨床糖尿病的發(fā)作(見圖3)。此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)胰管將人血小板來源的純化乙酰肝素酶送遞至常規(guī)的(非自身免疫的)小鼠體內(nèi)，可導(dǎo)致胰島BM和胰島內(nèi)HS的原位破壞(見圖4)。這些結(jié)果與乙酰肝素酶在NOD小鼠中引發(fā)破壞性胰島炎的作用是一致的，并證明了PI-88保護(hù)NOD小鼠使之免于發(fā)作臨床糖尿病的能力。表1:實(shí)時(shí)RT-PCR分析顯示，來自前驅(qū)糖尿病雌性NOD/Lt小鼠及來自糖尿病發(fā)作的雌性NOD/Lt小鼠的胰島中的乙酰肝素酶mRNA比分離自雌性NOD/Lt新生鼠的胰島(參考樣品)上調(diào)7倍胰島樣品_乙酰肝素酶mRNA的相對(duì)表達(dá)*4-5周新生的NOD/Lt1.0前驅(qū)糖尿病的NOD/Lt7.06±2.61糖尿病發(fā)作的NOD/Lt6.85±0.58CBA/H(常規(guī)的小鼠品系)_1.24±0.78_來自常規(guī)CBA/H小鼠的胰島作為陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示為3個(gè)單獨(dú)系列的樣品的平均值士SE。實(shí)施例2乙翁開#爽附/7^4在4^尿^7VOZ)V、^丘4被《^i瘦破銀種應(yīng)4/^差^W參絲參^Mt這參力夢(mèng)通常，前驅(qū)糖尿病雌性NOD胰臟的組織病理學(xué)及對(duì)移植至糖尿病NOD小鼠的同基因胰島的自身免疫破壞的組織病理學(xué)表明，自身反應(yīng)性T細(xì)胞和其他MNC不是經(jīng)由胰島內(nèi)血管進(jìn)入胰島的。取而代之的是，在由活化白細(xì)胞在胰島BM接觸面局部產(chǎn)生的降解性酶例如乙酰肝素酶使胰島BM崩解后，侵入白血病便從胰島周圍位置移動(dòng)至胰島細(xì)胞團(tuán)中。此后，MNC浸潤(rùn)進(jìn)程可導(dǎo)致對(duì)胰島內(nèi)ECM硫酸乙酰肝素的降解及對(duì)胰島的破壞。對(duì)這種依賴于酶的白細(xì)胞侵入機(jī)制是否在糖尿病NOD小鼠的胰島同基因移植物的自身免疫破壞中發(fā)揮功能的研究包括一般性實(shí)驗(yàn)，例如檢查在移植后多個(gè)時(shí)間所收集的胰島同基因移植物中的乙酰肝素酶轉(zhuǎn)錄物的移植物內(nèi)表達(dá)情況。本發(fā)明人已經(jīng)使用導(dǎo)管內(nèi)膠原酶注入方法(4-5供體小鼠/胰島分離)，通過膠原酶消化從6-8周齡的雌性NODscid小鼠的胰臟中分離出了供體胰島。將新鮮分離的NODscid胰島以受體NOD/Lt品系血凝塊形式(50-100個(gè)胰島/凝塊)移植至雌性糖尿病NOD/Lt小鼠的腎包膜下(250個(gè)胰島/移植物)(22)。通過使用無免疫能力的NODscid供體小鼠而不是青年的雌性NOD/Lt小鼠來制備胰島，消除了將源自供體胰島炎的MNC或已經(jīng)被供體胰島炎損壞的胰島被動(dòng)地帶到移植部位的可能性。因此，在用于后續(xù)分析的移植部位僅產(chǎn)生源自宿主的免疫反應(yīng)。NODscid胎鼠皮膚(來自17日齡妊娠胎鼠供體)的同基因移植物或者移植于腎包膜下的成年NODscid曱狀腺作為完整的對(duì)照移植物(對(duì)自身免疫損傷不敏感),分離的NODscid胰島和正常NOD/Lt腎組織作為另外的陰性對(duì)照。在移植后第3、4、5、6、8、10和14天時(shí)收集移植物；將每個(gè)移植物的大部分冷凍于液氮中用于隨后的RNA提取，將剩下的移植物冷凍于液體氟利昂中用于免疫組織化學(xué)或者固定在10%的中性緩沖的福爾馬林中用于組織學(xué)。使用異硫氰酸胍/氯化銫方法提取RNA。所有用于比較的樣品都使用相同的反應(yīng)混合物以寡聚脫氧胸苷啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄。使用有效的引物/探針組(AppliedBiosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。定量地分析乙酰肝素酶mRNA在組織樣品中的表達(dá)。在本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中建立的實(shí)時(shí)RT-PCR使用Taqman熒光探針(6-FAM用于耙基因和內(nèi)源參考基因(泛素綴合酶E2D1(UBC))來測(cè)量PCR產(chǎn)物。依照標(biāo)準(zhǔn)步驟(使用測(cè)試基因和UBC的Cr值)計(jì)算靶基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量。首先通過用輸入cDNA的標(biāo)準(zhǔn)量測(cè)試引物/探針濃度的限制區(qū)間來優(yōu)化每種引物/探針組的擴(kuò)增效率。然后，使用整合在LinRegPCR程序中的線性回歸分析來計(jì)算PCR效率及擴(kuò)增曲線的最佳擬合線的相關(guān)系數(shù)；該信息可用于鑒定最佳引物/探針濃度。使用這些條件，以與測(cè)試cDNA相同的效率擴(kuò)增持家基因(UBC)和耙基因。這使得可彌補(bǔ)輸入cDNA的不同量，并且可使用比較CT方法在樣品之間確定測(cè)試PCR產(chǎn)物的相對(duì)量。本發(fā)明人的初步研究表明，在NODscid胰島同基因移植物的自身免疫破壞過程中，乙酰肝素酶mRNA的表達(dá)在峰值表達(dá)時(shí)(在移植后第5-6天)被上調(diào)大約4倍(見以下表2)。表2:實(shí)時(shí)RT-PCR分析顯示，乙酰肝素酶mRNA在糖尿病NOD/Lt小鼠正在被自身免疫破壞的NODscid胰島同基因移植物中上調(diào)*移植至糖尿病NOD的乙酰肝素酶mRNA的相對(duì)表達(dá)同基因移植物移植后的時(shí)間(天數(shù))**3天4天5天6天10天14天NODacid胰島1.542.474.534.542.161.89NODscid胎鼠皮膚*1.000.960.851.010.380.42*將NODscid胎鼠皮膚同基因移植物(對(duì)自身免疫疾病不敏感)移植到雌性糖尿病NOD/Lt小鼠的腎包膜下面，作為完整的背景對(duì)照同基因移植物。**這些數(shù)據(jù)代表兩個(gè)獨(dú)立系列的同基因移植物樣品。實(shí)施例3磁凝乙瘋##f^S^^7VOZ)腐4,W/^在或it^應(yīng)名^好X^破銀遂除了存在于胰島BM中的串珠蛋白聚糖/HS之外，HSPG也是更廣泛分布的ECM的組分。ECM由大分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，其功能是填充組織中的細(xì)胞外空間，并為特定組織的細(xì)胞提供侵入白細(xì)胞可在其上遷移的支架(3)。實(shí)際上，已經(jīng)證明p細(xì)胞的存活和功能依賴于它們與胰島內(nèi)ECM相互作用的保持(23，24)。因此，乙酰肝素酶可能不僅可促進(jìn)活化的MNC通過胰島BM的進(jìn)入，而且可降解胰島內(nèi)ECM，從而不但促進(jìn)侵入MNC的遷移而且降低鄰近p細(xì)胞的生存力。用于確證胰島相關(guān)的A泉酸乙酰肝素和乙酰肝素酶與胰島完整性關(guān)系的一般性實(shí)驗(yàn)不但包括從糖尿病NOD小鼠(±PI-88處理)身上收集NODscid胰島和Nodscid胰島同基因移植物，而且還包括從新生的、前驅(qū)糖尿病的(士PI-88處理)、糖尿病發(fā)作的和糖尿病的(發(fā)作后2-4周)NOD/Lt小鼠身上收集胰臟，用于在10%的中性緩沖的福爾馬林中固定。通過用阿利新藍(lán)/0.65M氯化鎂/pH5.8(限制HS特異性的條件)的組織學(xué)染色在福爾馬林固定的切片中定位硫酸乙酰肝素(HS)(25)(見第19頁，圖7)。該分析已經(jīng)證實(shí)，HS被局限于胰島BM中，分布于胰島內(nèi)33ECM中，并且在自身免疫損傷中被損壞。實(shí)施例4^#源乙翁##雜謬發(fā)'^#^源銀"及可以從人血小板中純化乙酰肝素酶(26,27);已經(jīng)證明血小板來源的乙酰肝素酶可快速剪切來自內(nèi)皮細(xì)胞的硫酸乙酰肝素(HS),并且該活性是pH依賴性的(26)。本發(fā)明人進(jìn)行的研究已經(jīng)表明，經(jīng)BALB/c小鼠的胰管將純化的人血小板乙酰肝素酶送遞至體內(nèi)可導(dǎo)致正常胰島形態(tài)的喪失(見圖4和圖5)。證實(shí)僅乙酰肝素酶是否能誘導(dǎo)BALB/c胰島損壞或NODscid胰島損壞的一般性實(shí)驗(yàn)包括，將分離的胰島與人血小板來源的純化乙酰肝素酶(10-20fig/ml;見圖6)孵育過夜。以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)處理對(duì)照胰島。然后，用顯微鏡/組織學(xué)方法檢查所迷胰島，以顯示乙酰肝素酶誘導(dǎo)的胰島損壞/破壞。實(shí)施例5乙應(yīng)，:^躇附及AC4^蛋冷^應(yīng)^^#;^差^移潛^#>^€^《在^^或由于本發(fā)明人進(jìn)行的研究可表明乙酰肝素酶在原位及移植后的胰島自身免疫損傷中起重要功能，因此需要研究乙酰肝素酶是否在胰島同種異基因移植的排斥反應(yīng)過程中在白細(xì)胞向移植部位的遷移/募集以及胰島內(nèi)侵入方面發(fā)揮作用。在胰島同種異基因移植物被移植于腎包膜下的情況下，乙酰肝素酶可在以下方面發(fā)揮基本的功能(i)同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞通過胰島BM向胰島細(xì)胞團(tuán)的浸潤(rùn)，(ii)活化的白細(xì)胞從腎血管并可能從一些源自宿主的移植物內(nèi)血管的滲出，以及(iii)對(duì)胰島內(nèi)硫酸乙酰肝素的破壞。一般性實(shí)驗(yàn)包括，分析從移植到CBA/H(H-2k)受體小鼠后3-14天時(shí)所收集的BALB/c(H-2d)胰島同種異基因移植物中乙酰肝素酶轉(zhuǎn)錄物的移植物內(nèi)表達(dá)(見表3)。在胰島同種異基因移植的排斥反應(yīng)過程中，乙酰肝素酶mRNA的表達(dá)在峰值表達(dá)時(shí)(在移植后第5-7天)上調(diào)大約3-4倍(見下表3)。表3:實(shí)時(shí)RT-PCR分析顯示，乙酰肝素酶mRNA在CBA/H(H-2k)小鼠正在發(fā)生排斥反應(yīng)的BALB/c(H-2d)胰島同種異基因移植物中上調(diào)2-8倍<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>A完整CBA/H胰島同基因移植物作為背景對(duì)照。實(shí)施例6"iV-M命斧/乙應(yīng)，;^癉^/"潛^病iW2)小扃^^^名^差忠移茲參存承前驅(qū)糖尿病NOD小鼠的PI-88處理可阻止臨床糖尿病的發(fā)作(見圖3)并因此阻止破壞性胰島炎的發(fā)作，該結(jié)果強(qiáng)烈地表明對(duì)乙酰肝素酶活性的抑制對(duì)胰島有原位免疫保護(hù)作用。因此，以PI-88對(duì)移植的小鼠進(jìn)行體內(nèi)處理應(yīng)該可阻止對(duì)胰島同種異基因移植物的排斥反應(yīng)、胰島同基因移植物中的疾病復(fù)發(fā)(見圖8),并可促進(jìn)糖尿病NOD/Lt小鼠中胰島同種異基因移植物的存活和功能。為了評(píng)估PI-88治療是否有移植物保護(hù)作用，將NODscid胰島以400-500個(gè)胰島/移植物的量移植至自身免疫的糖尿病NOD小鼠中。從移植后第3天(在移植物血管重建后)開始以腹膜內(nèi)注射PI-88(10mg/kg/天)來處理所述小鼠。以鹽水處理對(duì)照的移植小鼠。通過每周2-3次(2-3x)測(cè)量非禁食血糖水平(使用血糖儀(MediSense2))來監(jiān)測(cè)移植物功能。對(duì)受體小鼠的PI-88處理可阻止胰島同基因移植物中的疾病復(fù)發(fā)最長(zhǎng)至移植后2周，并使得這些移植物保持血糖量正常；相反，對(duì)照移植物受到迅速蔓延的自身免疫破壞并且受體動(dòng)物中的血糖水平經(jīng)2周返回至糖尿病范圍。本發(fā)明人進(jìn)行的研究已經(jīng)在原位證實(shí)了在胰島周圍存在基膜(BM),已經(jīng)將串珠蛋白聚糖(一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)鑒定為胰島BM的組分，已經(jīng)揭示出來自前驅(qū)糖尿病和糖尿病發(fā)作的NOD小鼠的胰島中的乙酰肝素酶轉(zhuǎn)錄物上調(diào)7倍，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用PI-88(3)抑制乙酰肝素酶可阻止NOD小鼠中的T1D。因此，由活化的胰島炎MNC產(chǎn)生的乙酰肝素酶似乎在以下過程中起到關(guān)鍵作用通過損壞胰島BM和胰島內(nèi)ECM將非破壞性胰島炎轉(zhuǎn)化成破壞性胰島炎，從而誘導(dǎo)p細(xì)胞損傷和T1D。類似地，胰島同基因移植物遭受到乙酰肝素酶誘導(dǎo)的免疫損傷；通過以PI-88進(jìn)行體內(nèi)處理可使在糖尿病NOD受體小鼠中的NODscid胰島同基因移植物免于疾病復(fù)發(fā)。實(shí)施例7勿^^##存;^5^#^^凝乙瘋>^#HSPG是胰島的BM和ECM的原位組分。前面的實(shí)施例已經(jīng)顯示，乙酰肝素酶不但降解胰島內(nèi)ECM，而且可促進(jìn)活化的MNC通過胰島BM的進(jìn)入。這種活性似乎不僅可促進(jìn)侵入MNC向胰島的遷移，而且由于p細(xì)胞似乎依賴于ECM石克酸乙酰肝素以維持其活性，所以這種活性可降低附近p細(xì)胞的生存力。進(jìn)行了體外研究來進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)。使用分散酶(Dispase，lmg/ml)分散成單細(xì)胞中的分離的BALB/c胰島主要由產(chǎn)生胰島素的P細(xì)胞組成，這一點(diǎn)被免疫熒光法所確證。與經(jīng)過2天培養(yǎng)期后保持完整的對(duì)照胰島p細(xì)胞不同，以細(xì)菌類肝素酶(肝素酶)(i+n+m;每種類肝素酶均為0.25U/ml)處理1小時(shí)的p細(xì)胞(該過程將完全破壞與胰島ECM和細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的HS)沒有存活(圖9(a))。將被處理的細(xì)胞置于ECM(由細(xì)胞系在體外產(chǎn)生)上能夠在很大程度上從類肝素酶-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中拯救出p細(xì)胞(PO.OOOl)(圖9(a))。這些發(fā)現(xiàn)表明，胰島p細(xì)胞的存活需要細(xì)胞相關(guān)的HS。作為對(duì)該觀點(diǎn)的支持，通過為培養(yǎng)物提供5-50照/ml肝素(一種高度硫酸化形式的硫酸乙酰肝素)可有效地拯救細(xì)菌類肝素酶處理的p細(xì)胞(*P<0.0001)(圖9(b))。因此，胰島p細(xì)胞需要細(xì)胞相關(guān)的HS來保持活力及健康。這些數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即胰島p細(xì)胞在細(xì)胞水平對(duì)于乙酰肝素酶的直接損傷是敏感的。實(shí)施例8#斧/乙應(yīng)##雜考<:^4/#V、扃尹^5y!LB/c應(yīng)4/^^^f^瘁移潛參存法W多禱HS在保持胰島和胰島(5細(xì)胞的完整性和存活中起到關(guān)鍵的作用。已經(jīng)證明乙酰肝素酶在NOD小鼠胰島的自身免疫破壞中起到主要作用，并且外源的人乙酰肝素酶在體外可破壞正常胰島(來自常規(guī)的小鼠)(見前面的實(shí)施例)。PI-88對(duì)乙酰肝素酶活性的抑制可短暫地拖延對(duì)糖尿病NOD/U小鼠中胰島同基因移植物的迅速蔓延的自身免疫破壞。因此，乙酰肝素酶還可能在胰島同種異基因移植物的免疫破壞中起到重要作用(甚至在沒有自身免疫攻擊的情況下)。與在移植后7天顯示出更嚴(yán)重的胰島破壞的相應(yīng)對(duì)照胰島同種異基因移植物相比(圖10(b)),來自移植后7天的PI-88處理的受體CBA/H(H-2k)小鼠的BALB/c(H-2d)胰島同種異基因移植物顯示出單核細(xì)胞在胰島周圍積累(圖l(a))。因此，對(duì)宿主的PI-88處理對(duì)被移植的同種異基因胰島有著更好的保持。因此，乙酰肝素酶抑制劑可代表一種用于同種異基因宿主中的胰島移植物的抗排斥反應(yīng)方法，并且具有保護(hù)被移植的胰島使其避免遭受異體免疫攻擊和自身免疫攻擊的能力。實(shí)施例9^f甜^邀合參根據(jù)本文提供的實(shí)施本發(fā)明的最佳模式，具體優(yōu)選的組合物在下文列出。以下組合物僅可被解釋為組合物的示例性實(shí)例，而不能被以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。"義應(yīng)f斧給秀的邀合參制備一種用于腸胃外注射的組合物在10ml-2升l。/。羧曱基纖維素中包含0.05mg-5g的本文公開的適當(dāng)藥劑或化合物。類似地，用于靜脈內(nèi)輸注的組合物可包含250ml無菌的林格氏溶液和0.05mg-5g的本文公開的適當(dāng)藥劑或化合物。^B義口應(yīng)辨邀合參膠嚢形式的適當(dāng)藥劑或化合物的組合物可通過用以下物質(zhì)填充標(biāo)準(zhǔn)的兩段式硬明膠膠嚢而制備500mg粉末形式的所述藥劑或化合物、100mg的乳糖、35mg的滑石及10mg的硬脂酸鎂。371.SolomonM,SarvetnickN.(2004)ThepathogenesisofdiabetesintheNODmouse.Adv，Lnmunol.84:239.2.Parish,CR(2006)Theroleofheparansulfateininflammation.NatRevImmunol6:633.3.ParishCR，F(xiàn)reemanC，HulettMD(2001)Heparanase:akeyenzymeinvolvedincellinvasion.Biochim.Biophys.Acta1471:M99.4.NoonaaDM,FulleA，ValentePetal,(1991)Thecompletesequenceofperlecan，abasementmembraneheparansulfateproteoglycanrevealsextensivesimilaritywitlilamininAchain，lowdensitylipoprotein-receptor，andtheneuralcelladhesionmolecule.J.Biol.Chem.266:22939.5.TimpiR，(1993)Proteoglycansofbasementmembranes.Experientia49:417.6.Conde-Knape，K.(2001)Heparansulfateproteoglycansinexperimentalmodelsofdiabetes:aroleforperiecanindiabetescomplications,Diab/MetabResandRev17:412.7，VlodavskyI，.FriedmannY，ElkinMetal(1999)Mammalianheparanase:genecloning，expression,andftmctionintumorprogressionandmetastasis.NatureMed5:793，8.HulettMD，F(xiàn)reemanC,HamdorfBJ,BakerRT,HarrisMJandParishCR(1999)Cloningofmammalianheparanase,animportantenzymeintumorinvasionandmetastasis.NatureMed5:803.9.ParishCR.(2005)Heparansulfateandinflammation.NatureImmunol.6:861,10.VlodavskyI，EldorA,Haimovitz-FriedmanAetal(1992)Expressionofheparanasebyplateletsandcirculatingcellsoftheimmunesystem:possibleinvolvementindiapedesisandextravasation.Invasionmetastasis12:112.11.ParishCR，HindmarshEJ,BartlettMRetal(1998)Treatmentofcentralnervoussysteminflammationwithinhibitorsofbasementmembranedegradation.ImmunolCellBiol76:104.12.NaparstekY,CohenIR，F(xiàn)uksZetal.(1984)ActivatedTlymphocytesproduceamatrix-degradingheparansulfateendoglycosidase.Nature310:241.13.LaffertyKJ,ProwseSJ，SimeonovicCJetal(1983)Immunobiologyoftissuetransplantation,Areturntothepassengerleucocyteconcept.Ann,Rev,Immunol,1143.14.MakhloufL,GreyST,DongVetal(2004)Depletinganti-CD4monoclonalantbodycuresnew-onsetdiabetes,preventsrecurrentautoinmumediabetesanddelaysallograftrejectioninnonobesediabeticmice.Transplantation77:990.15.DemirciG,StromTB,LiXC(2003)Isletallograftrejectioninnonobesediabeticmiceinvolvesthecommongamma-chainandCD28/CD154-dependentand-independentmechanisms.JImmunol171:3878.16.MolanoRD，PileggiA，BemeyTetal(2003)ProlongedisletallograftsurvivalindiabeticNODmicebytargetingCD45RBandCD154.Diabetes52:957,17.Wang，Y.,Hao,L.,Gill，R.G.andLafferty,K.J.(1987)AutoimnmnediabetesinNODmouseisL3T4T-lymphocytedependent.Diabetes36:535.18.MolanoRD,PileggiA,BerneyTetal.(2003)Long-termisletallograftsurvivalinnonobesediabeticmicetreatedwithtacriloirms，rapamycinandinterleukin-2antibody.Transplantation75:1812.19.GuoZ，WuT，SozenHetal(2003)Asubstantiallevelofdonorhematopoieticchimerismisrequiredtoprotectdonor-specificisletgraftsindiabeticNODmice.Transplantation75:909.20.Seung,E.，Iwakoshi,N.，Woda，B.A.(2000).Allogeneichematopoieicchimerisminmicetreatedwithsublethalmyeloablationandanti-CD154antibody.Blood95:217.21.LiderO,BaharavE,MekoriYAetal(1989)Suppressionofexperimentalautoimmunediseasesandprolongationofallograftsurvivalbytreatmentofanimalswithlowdosesofheparins.JClinInvest83:752.22.SimeonovicCJ，ZarbJC，GazdaLSetal(1998)Pancreaticisletandproislettransplantationinthemousemodel.In:Microsurgicalmethodsinratsandmicefortransplantationresearch.TimmermannW，UlrichsKandThiedeDA(eds).Springer-Verlag，Berlin,Heidelberg,ppl67.23.WangRN，RosenbergL(1999)Mainteneanceofbetacellfiinctionandsurvivalfollowingisletisolationrequiresre-establishmentoftheislet-matrixrelationship.JEndocrinol163:181.24.ThomasFT，ContrerasJL,BilbaoG，RicordiCetal(1999)Anoikis，extracellularmatrix,andapoptosisfactorsinisolatedcelltransplantation.Surgery126:299.25.CalvittiM,BaronUT，CalastriniCetal(2004)Bronchialbranchingcorrelateswithspecificglycosidaseactivity,extracellularglycos咖inoglycanaccumulation,TGFbeta2，andIL-1localizationduringchickembryodevelopment.JHistochemCytochem52:325,26.IhrckeNS,ParkerW，ReissnerKJetal(1998)Regulationofplateletheparan-aseduringinflammation:roleofpHandproteinases,JCellPhysiol175:255，27.FreemanC,ParishCR(1998)Humanplateletheparanase:purification^characterizationandcatalyticactivity.BiochemJ330:1341.39權(quán)利要求1.一種抑制與胰島β細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)降解的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞外基質(zhì)與有效量的乙酰肝素酶抑制劑相接觸。2.—種抑制與胰島p細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞外基質(zhì)與有效量的乙酰肝素酶相接觸。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖為串珠蛋白聚糖、XVIII型膠原或聚集蛋白。4.一種治療受試者中自身免疫病癥的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中自身免疫病癥選自胰島炎、l型糖尿病、對(duì)胰島移植物的排斥反應(yīng)或它們的任一組合。6.—種治療受試者中胰島炎的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。7.—種治療或預(yù)防受試者中對(duì)移植物的排斥反應(yīng)的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述移植物為胰島移植物。9.一種降低與移植相關(guān)的免疫抑制治療水平的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述移植為胰島移植。11.一種治療受試者中糖尿病的方法，其中所述方法包括給予受試者治療有效量的乙酰肝素酶抑制劑。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述糖尿病為最近發(fā)作的1型糖尿病。13.—種用于制備藥物組合物的方法，包括將乙酰肝素酶抑制劑與可藥用的栽體相混合。14.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療胰島炎的藥劑中的用途。15.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療糖尿病的藥劑中的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述糖尿病為最近發(fā)作的1型糖尿病。17.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于治療移植排斥反應(yīng)的藥劑中的用途。18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述移植為胰島移植。19.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制基膜、胰島內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)、胰島周嚢或它們的任一組合中的硫酸乙酰肝素降解的藥劑中的用途。20.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖降解的藥劑中的用途。21.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于抑制對(duì)受試者中移植物的排斥反應(yīng)的藥劑中的用途。22.乙酰肝素酶抑制劑在制備用于降低與移植相關(guān)的免疫抑制治療水平的藥劑中的用途。23.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述方法與結(jié)合方案聯(lián)合使用。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述常規(guī)治療包括對(duì)胰島的體外處理、單獨(dú)的或與其他試劑結(jié)合的免疫抑制藥物，或者免疫抑制治療。25.根據(jù)權(quán)利要求1-13或權(quán)利要求23或24任一項(xiàng)的方法或者根據(jù)權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)的用途，其中所述乙酰肝素酶抑制劑選自硫酸多糖、硫代磷酸寡脫氧核苷酸、非碳水化合物肝素?cái)M聚合物、硫酸麥芽低聚糖、磷酸硫代甘露聚糖、硫酸間隔的低聚糖、硫酸連接的環(huán)多醇、糖氨基酸的硫酸低聚物、假二糖、制唾酸酶素B的衍生物、糖醛酸型(e附-二胺l-2V-亞胺基糖、蘇拉明和蘇拉明類似物、真菌代謝產(chǎn)物、二苯醚、^t唑、吲哚和苯并-l，3-唑衍生物。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法或用途，其中所述乙酰肝素酶抑制劑為PI-88。27.根據(jù)權(quán)利要求1-13或權(quán)利要求23或24任一項(xiàng)的方法或者根據(jù)權(quán)利要求14-22任一項(xiàng)的用途，其中所述乙酰肝素酶抑制劑為單克隆抗體。28.權(quán)利要求4、6、9或11任一項(xiàng)的方法，其中所述乙酰肝素酶抑制劑的所述給藥是全身性的或局部的。29.權(quán)利要求4、6、9或11任一項(xiàng)的方法，其中所述乙酰肝素酶抑制劑的所述給藥可通過腸胃外、腔內(nèi)、膀胱內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部或口服。30.—種用于治療或預(yù)防與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的病癥的組合物，其中所述組合物包含乙酰肝素酶抑制劑和一種或多種可藥用的栽體、稀釋劑或佐劑。31.—種用于治療或預(yù)防與細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的病癥的組合物，其中所述組合物包含乙酰肝素酶抑制劑和至少一種其他免疫抑制劑或抗炎劑，并任選地包含一種或多種可藥用的載體、稀釋劑或佐劑。32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述抗炎劑選自甾類、皮質(zhì)甾類、COX-2抑制劑、非甾類抗炎癥劑(NSAID)、阿司匹林或它們的任一組合。33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述非甾類抗炎癥劑選自布洛芬、萘普生、芬布芬、非諾洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、右酮洛芬、噻洛芬酸、阿扎丙宗、雙氯芬酸、醋氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、氯諾昔康、曱芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、羅非昔布、塞來昔布、舒林酸、替諾昔康、托芬那酸或它們的任一組合。34.權(quán)利要求31的組合物，其中所述免疫抑制劑選自阿倫單抗、硫唑噤呤、環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、來氟米特、甲氨喋呤、霉酚酸酯、利妥昔單抗、柳氮磺吡啶、他克莫司、西羅莫司或它們的任一組合。全文摘要本申請(qǐng)涉及一種抑制與胰島β細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)降解的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞外基質(zhì)與有效量的乙酰肝素酶抑制劑相接觸。文檔編號(hào)A61K31/737GK101588808SQ200780042971公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2007年10月22日優(yōu)先權(quán)日2006年10月20日發(fā)明者A·齊奧考斯基,C·R·帕里什,C·西米恩維克申請(qǐng)人:澳大利亞國(guó)立大學(xué)