專利名稱：一種利用蛋白質(zhì)等電點提高硫酸軟骨素質(zhì)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化制藥領(lǐng)域,具體涉及一種硫酸軟骨素的制備方法。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素是廣泛存在于人和動物軟骨組織中的一類黏多糖，它作為結(jié) 締組織的重要組成部分，具有多種藥理作用與生理功能。在我國硫酸軟骨素 用于治療神經(jīng)痛、神經(jīng)性偏頭痛、關(guān)節(jié)炎、肩關(guān)節(jié)痛和腹腔手術(shù)后疼痛等， 預(yù)防和治療鏈霉素引起的聽覺障礙及各種噪聲引起的聽覺困難、耳鳴癥等， 效果顯著。在西方發(fā)達國家，硫酸軟骨素作為保健品長期應(yīng)用于防治冠心病、 心絞痛、心肌梗塞、冠狀動脈機能不全、心肌缺血等疾病，無明顯的毒副作 用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率。長期的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，在動 脈和靜脈壁上沉積的脂肪等脂質(zhì)可以被有效去除或減少，能顯著降低血漿膽 固醇，從而防止動脈粥樣硬化的形成。
硫酸軟骨素的提取方法主要有堿提-酶解法、堿提法、超聲波輔助法和乙 酸提取法，而堿提-酶解法又分為稀堿-酶提取工藝、濃堿-酶提取工藝和稀堿 稀鹽-酶提取工藝等。以上幾種提取方法都存在或多或少的問題，如堿鹽用量 大、生產(chǎn)周期長、耗能高、收率低、產(chǎn)品純度低等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的稀堿稀鹽-酶提取工藝中產(chǎn)品收率低、純度低
的缺點，采用較濃的堿液(2%)有效釋放硫酸軟骨素，同時使部分蛋白質(zhì)降 解及變性沉淀，提高純度。再將酶解后的濾液濃縮，減少了酒精用量，使沉 淀更加完全，然后將一次沉淀物用水溶解，將夾雜在一次沉淀物中的蛋白質(zhì) 根據(jù)所含蛋白的種類在不同等電點進行沉降，再經(jīng)過H202的氧化去細菌和漂 白，最大限度的去除了產(chǎn)品中的雜蛋白，使產(chǎn)品質(zhì)量大大提高達到97%以上。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到 一種硫酸軟骨素的制備方法，包括如下步驟
(A) 用NaHC03溶液清洗軟骨后蒸煮8 10小時；其中NaHC03溶液 的質(zhì)量含量為1 5%。；
(B) 待冷卻至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次，2小時/次； 其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的0.5 5%， NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的5
10%;
(C) 向提取液中加入破碎均質(zhì)好的豬胰臟和2709堿性蛋白酶，在45 55°C、 pH8.8 9.0下處理5 10小時；其中豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的5 10%， 2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.3 1%。；酶解的溫度優(yōu)選為49 51°C， pH優(yōu)選為8.8 8.9;
(D) 經(jīng)過酶處理的提取液在溫度65 67。C、 pH4.4 4.6下處理0.5 3 小時，再調(diào)pH5.5 6.0至明顯分層后，用747過濾布過濾，濾液濃縮至1/3 體積；
(E) 向濃縮液中加入酒精至酒精的體積含量為62 68%，處理2 6小 時進行一次沉淀；
(F) 沉淀加水溶解，在60 65t:下，根據(jù)所含蛋白的種類，在不同等 電點沉降不同的蛋白質(zhì)。先調(diào)pH5.0 5.5放置1小時，再調(diào)pH6.5 7.0下靜 置0.5 3小時，然后調(diào)pH9.0 9.3，加入0.5 1.0%的H202處理0.5 5小 時，過濾去掉雜蛋白；
(G) 濾液加入酒精至體積含量為70 74%，處理0.2 1小時進行二次
沉淀，再過濾，得到的沉淀經(jīng)脫水、干燥得粗品。
粗品經(jīng)過球磨后即得到白色粉末狀成品。本發(fā)明中的酒精除特別說明的 以外， 一般指純乙醇。
通過反復實驗可以確定本發(fā)明的一種優(yōu)化的工藝條件，其中NaHC03溶 液的質(zhì)量含量為3%。， NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的1 3%， NaCl的用量為軟 骨質(zhì)量的7 9%， 一次沉淀時加入酒精至酒精的體積含量為64 66%， 一次
沉淀處理時間3 5小時；將一次沉淀物用水溶解后進行在不同等電點的pH 調(diào)節(jié)，以除去雜質(zhì)蛋白，去除方法為在60 65。C下，先在pH5.0 5.5下靜置 處理0.8 1.5小時，再在pH6.5 7.0下靜置處理0.8 1.5小時，最后調(diào) pH9.0 9.3，加入0.5 1.0°/0的&02處理1 3小時氧化漂白，過濾；濾液進 行二次沉淀，加入酒精至酒精的體積含量為71 73%， 二次沉淀處理時間 0.4 0.6小時。
本發(fā)明一方面利用天然酶與蛋白酶的協(xié)同作用來提高產(chǎn)品質(zhì)量，天然酶 是利用冷凍的豬胰臟經(jīng)機器絞碎后用30%左右的酒精均質(zhì)，酒精能使細胞膜 破碎直接剌激胰酶的分泌。此法比用純胰酶成本低，酶的原始狀態(tài)好酶活高， 實際效果比純胰酶更好。所用的蛋白酶是2709堿性蛋白酶，此酶是采用地衣 型芽孢桿菌2709優(yōu)良菌株經(jīng)液態(tài)深層培養(yǎng)發(fā)酵提取的固態(tài)酶。另一方面利 用蛋白質(zhì)等電點來提高硫酸軟骨素質(zhì)量，根據(jù)所含蛋白的種類，在不同等 電點沉降不同的蛋白質(zhì)，從而提高硫酸軟骨素的純度。
本發(fā)明采用兩種酶(2709蛋白酶和豬胰臟)按特定的比例混合使用，由 于豬胰臟中胰酶的原始狀態(tài)好酶活高，通過與2709蛋白酶的協(xié)同作用從而提 高酶解效率，可以使牛鼻骨最終收率達到25%，其他易提取軟骨的收率可達 到40%。同時本發(fā)明將一次沉淀物中所夾雜的蛋白質(zhì)通過精確的pH值調(diào)節(jié)， 在不同的等電點時進一步除去混在硫酸軟骨素中不易除去的雜蛋白，再通過 其他步驟的相互配合，從而使最終得到的硫酸軟骨素的純度達到97%以上。
具體實施例方式
將牛鼻骨用3%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小時；待冷卻至3(TC以 下后，加入NaOH和NaCl提取兩次；其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的2%, NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的8%。
向提取液中加入破碎均質(zhì)好的豬胰臟和2709蛋白酶，在51。C、 pH8.8 8.9下處理7小時，其中豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的8%， 2709酶的加入量 為軟骨質(zhì)量的0.6%。經(jīng)過酶處理的提取液在溫度67'C、 pH4.4 4.6下處理1
小時，再調(diào)pH5.5 6.0至明顯分層后，用747過濾布過濾，濾液濃縮至原體 積的1/3。
向上述濃縮液中加入酒精至體積含量為64%，處理4小時進行一次沉淀， 過濾，濾渣加水溶解后在63'C下，先在pH5.0 5.5下靜置處理1小時，再在 pH6.5 7.0下靜置處理1小時，最后調(diào)pH9.0 9.3，加入0.8%的恥2處理 2小時氧化漂白，過濾；濾液再加入酒精至體積含量為73%，處理0.5小時 進行二次沉淀，再過濾，濾渣脫水、干燥得粗品，再經(jīng)過球磨后即為白色粉 末成品。最終成品的收率為25%，經(jīng)檢測，硫酸軟骨素的純度為98.6%。 實施例2
將牛鼻骨用30%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小時；待冷卻至30°C以 下后，加入NaOH和NaCl提取兩次；其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的2%， NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的8%。
向提取液中加入均質(zhì)好的豬胰臟和2709蛋白酶，在50°C、 pH8.8 8.9 下處理8小時，其中豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的6%， 2709酶的加入量為 軟骨質(zhì)量的1%。。
經(jīng)過酶處理的提取液在溫度66°C、 pH4.4 4.6下處理1小時，再調(diào) pH5.5 6.0至明顯分層后，過濾，濾液濃縮。
向上述濃縮液中加入酒精至體積含量為65%，處理4小時進行一次沉淀， 過濾，濾渣加水溶解后在64"C下，先在pH5.0 5.5下靜置處理l小時，再在 pH6.5 7.0下靜置處理1小時，最后調(diào)pH9.0 9.3，加入0.7%的11202處理 2小時氧化漂白，過濾；濾液加入酒精至體積含量為72%，處理0.5小時進 行二次沉淀，過濾，濾渣脫水、干燥得粗品，經(jīng)過球磨后即為白色粉末成品。 最終成品的收率為24%，經(jīng)檢測，硫酸軟骨素的純度為98.5%。 實施例3
除將牛鼻骨替換為牛喉管外，其他同實施例1，最終白色粉末的收率為 15%，純度為97.4%。 實施例4
除將牛鼻骨替換為牛脊椎骨外，其他同實施例2，最終白色粉末的收率 為6%，純度為9挑。 實施例5
除將牛鼻骨替換為鴨喉管外，其他同實施例1，最終白色粉末的收率為 36%，純度為97. 3%。 實施例6
除將牛鼻骨替換為雞喉管外，其他同實施例2,最終白色粉末的收率為 40%，純度為97. 1%。
權(quán)利要求
1、一種利用蛋白質(zhì)等電點提高硫酸軟骨素質(zhì)量的方法，其特征在于包括如下步驟(A)用NaHCO3溶液清洗軟骨后蒸煮8～10小時；(B)加入NaOH和NaCl提取兩次；(C)向提取液中加入破碎均質(zhì)好的豬胰臟和2709堿性蛋白酶，在45～55℃、pH8.8～9.0下處理5～10小時；(D)經(jīng)過酶處理的提取液在溫度65～67℃、pH4.4～4.6下處理0.5～3小時，再調(diào)pH5.5～6.0至明顯分層后，過濾，濾液濃縮至1/3體積；(E)向濃縮液中加入酒精至酒精的體積含量為62～68％，處理2～6小時進行一次沉淀；(F)沉淀加水溶解，在60～65℃下，先調(diào)pH5.0～5.5放置1小時，再調(diào)pH6.5～7.0下靜置0.5～3小時，然后調(diào)pH9.0～9.3，加入0.5～1.0％的H2O2處理0.5～5小時，過濾；(G)濾液加入酒精至體積含量為70～74％，處理0.2～1小時進行二次沉淀，過濾，將沉淀脫水、干燥得粗品，再經(jīng)過球磨得成品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于均質(zhì)豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量 的5 10%， 2709堿性蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.3 1%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的NaHC03溶液的質(zhì)量含 量為1 5%0。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用NaOH和NaCl提取時，NaOH 的用量為軟骨質(zhì)量的0.5 5%， NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的5 10%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟C中酶解的溫度為49 51°C ， pH為8.8 8.9。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙酶法制備硫酸軟骨素的工藝，包括清洗蒸煮后加入NaOH和NaCl提取，再向提取液中加入胰酶進行酶解處理，經(jīng)過酶處理的提取液去蛋白后濃縮，最后通過一次沉淀以及調(diào)節(jié)pH值去除雜蛋白和二次沉淀即得到硫酸軟骨素粗品。本發(fā)明在一次沉淀后通過精確的pH值調(diào)節(jié)，可以進一步除去混在硫酸軟骨素中不易除去的雜蛋白，再通過其他步驟的相互配合，從而使最終得到的硫酸軟骨素的純度達到97％以上。
文檔編號C12P19/00GK101348814SQ200810124789
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者于文濤, 波 易, 岸 譚, 和 黃, 龍園園 申請人:南京工業(yè)大學