專(zhuān)利名稱(chēng)::一種與植物耐冷性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種與植物耐冷性相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù):
:水稻是重要的糧食作物,芽期冷害是影響我國(guó)長(zhǎng)江中下游早稻種植區(qū)和東北、西北稻區(qū)及云貴高原一季稻區(qū)水稻生產(chǎn)的重要因子之一。水稻芽期如遭遇冷害,將導(dǎo)致水稻幼苗生長(zhǎng)遲緩、分蘗減少,嚴(yán)重者甚至還會(huì)出現(xiàn)大面積的僵苗、死苗現(xiàn)象,最終造成水稻產(chǎn)量的大幅度降低,因此迫切需要培育出芽期耐冷的水稻品種。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種,野生稻在演化成栽培稻的過(guò)程中,經(jīng)過(guò)自然選擇和人工選擇,基因多樣性降低、等位基因數(shù)減少。據(jù)統(tǒng)計(jì),栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60%(SunCQ,WangXK,LiZC,YoshimuraA.Comparisonofthegeneticdiversityofcommonwildrice(Oj;zar"加ogo"Griff.)andcultivatedrice(O.s油'vaL.)usingRFLPmarkers.TheorApplGenet,2001,102:157-162),從而導(dǎo)致當(dāng)前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸問(wèn)題。因此從水稻近緣野生種的(普通野生稻o^加n/y^ogo"Griff.)基因組中發(fā)掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優(yōu)異基因,并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值,也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。江西東鄉(xiāng)普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一,具有極強(qiáng)的耐冷性,它的地下莖能耐-12.8°C的低溫并可安全越冬(ChenDZ,XiaoYQ,ZhaoSX,XiongHJ,PiYH,LuoLJ.StudiesoncoldtoleranceofseedlingandheadingstageinDongxiangwildrice.ActaAgricJiangxi,1996,8:1-6(inChinese);ChenDZ,XiaoYQ,ZhaoSX,PiYH,XiongHJ,LuoLJ.GeneticstudyonthecoldtoleranceofDongxiangwildriceattheseedlingstage.ActaAgricJiangxi,1997,9:56-59(inChinese)),而當(dāng)前栽培稻無(wú)一具此抗性,因此江西東鄉(xiāng)普通野生稻是水稻耐冷性研究的理想材料。Liu"a/.(LiuFX,SunCQ,TanLB,LiDJ,F(xiàn)uYC,WangXK.Identificationandmappingofquantitativetraitlocicontrollingcold-toleraneeofChinesecommonwildricerw加ogowGriff.)atbootingtofloweringstages.ChineseScienceBulletin,2003,48:2068-2071)報(bào)道了3個(gè)來(lái)自江西東鄉(xiāng)普通野生稻的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)能提高栽培稻受體親本(桂朝2號(hào))孕穗開(kāi)花期的耐冷性,進(jìn)一步證實(shí)了從江西東鄉(xiāng)普通野生稻中發(fā)掘耐冷基因的可行性。我國(guó)野生稻資源豐富,從野生稻中發(fā)掘、定位和克隆耐冷相關(guān)基因不僅為培育超耐冷新品種提供新基因和新技術(shù),而且對(duì)加強(qiáng)我國(guó)野生稻基因資源的保護(hù)、將資源優(yōu)勢(shì)變成經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與植物耐冷性相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與植物耐冷性相關(guān)的蛋白名稱(chēng)為L(zhǎng)TT1,來(lái)源于稻屬普通野生稻(an/^ogowGriff.),是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列l(wèi)的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的LTT1便于純化,可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的LTT1可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的LTT1的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2自5'末端第64-570位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子,和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變,和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述與植物耐冷性相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。與植物耐冷性相關(guān)蛋白的編碼基因具體可為如下l)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第64-570位脫氧核糖核苷酸;2)其核苷酸序列是序列表中的序列2;3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交且編碼具有序列表中序列1的氨基酸序列的蛋白的DNA分子。序列表中的序列2由995個(gè)堿基組成,其開(kāi)放閱讀框架(0RF)為自5'末端第64-570位堿基,編碼具有序列表中序列1的氨基酸序列的LTT1。上述嚴(yán)格條件可為用O.1XSSPE(或0.1XSSC),0.1XSDS的溶液,在DNA或者RNAgelblot實(shí)驗(yàn)中65'C下雜交并洗膜。擴(kuò)增上述Z777基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述與植物耐冷性相關(guān)蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍??捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有Z777基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等,如pCAMBIA1300、PBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pC細(xì)IA1301-IMN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明與植物耐冷性相關(guān)蛋白編碼基因Z777的植物表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻等單子葉植物,也可以是擬南芥等雙子葉植物。使用A777基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí),在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等,它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用;此外,使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí),還可使用增強(qiáng)子,包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選,可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工,如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮,可不加任何選擇性標(biāo)記基因,直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為在pCAMBIA1300-35S的多克隆位點(diǎn)間插入序列表中序列2的自5'末端的第64-570位脫氧核苷酸得到的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-35S-LTT1;所述pCAMBIA1300-35S是用歷"oIII和Z6al分別雙酶切載體pBI121和載體pCAMBIA1300,連接pBI121酶切得到的35S啟動(dòng)子和pCAMBIA1300酶切后的大片段,即得到pCAMBIA1300-35S。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐冷植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐冷植物的方法,是將上述與植物耐冷性相關(guān)蛋白的編碼基因Z777導(dǎo)入植物中,得到耐冷性提高的植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述植物具體可為水稻或擬南芥。本發(fā)明從江西東鄉(xiāng)普通野生稻中克隆了與植物耐冷性相關(guān)的基因Z7T7,并將其轉(zhuǎn)入水稻中,其T,代轉(zhuǎn)LTT1基因植株比對(duì)照株日本晴表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐冷性。4-5°C低溫處理5d,正常條件下恢復(fù)生長(zhǎng)7d后,L代轉(zhuǎn)LTT1基因植株生長(zhǎng)良好,葉色濃綠,活苗率為100%,株高8.37±0.51cm;而相同處理的對(duì)照植株(轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S的日本晴)卻長(zhǎng)勢(shì)很差,株高2.9士0.53cm,明顯矮于T,代轉(zhuǎn)LTT1基因植株,活苗率為50%。本發(fā)明的培育耐冷植物的方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短的特點(diǎn),適于推廣應(yīng)用。該方法對(duì)于植物耐冷性分子機(jī)制的研究、耐冷品種的選育以及植物耐冷性分子育種具有重要的理論及實(shí)際意義,為提高植物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。圖1為以江西東鄉(xiāng)普通野生稻、IL112和桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶圖2為以20個(gè)水稻品種的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶圖3A為轉(zhuǎn)入pCAMBIA1300-35S-LTT1的T。代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖3B為轉(zhuǎn)入Z777基因的L代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照株的芽期耐冷性鑒定結(jié)果具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法,所用引物合成及測(cè)序工作均由北京奧科生物科技有限責(zé)任公司完成。下述水稻品種若無(wú)特殊說(shuō)明,均購(gòu)自國(guó)家種子資源庫(kù)。實(shí)施例1、提高水稻芽期耐冷性的基因Z777的獲得首先將江西東鄉(xiāng)普通野生稻與超高產(chǎn)水稻品種桂朝2號(hào)進(jìn)行回交和自交,構(gòu)建了以桂朝2號(hào)為遺傳背景的高代回交群體(BC4F2群體),對(duì)此群體進(jìn)行芽期耐冷性鑒定,同時(shí)以麗江新團(tuán)黑谷作為對(duì)照。具體的鑒定方法為將桂朝2號(hào)、高代回交群體(BC4F2群體)和麗江新團(tuán)黑谷的種子分別用5%(體積百分含量)的次氯酸鈉溶液浸泡20min后用清水沖洗3-4次,37。C浸種催芽ld,隨后將種子置于玻璃試管中浸水的濾紙上,將試管放入光照培養(yǎng)室(晝溫28'C,夜溫25'C,每天光照、黑暗時(shí)間各為12h,相對(duì)濕度83%),待種子發(fā)芽后芽長(zhǎng)長(zhǎng)至5mm左右時(shí),每個(gè)水稻品種分別選擇10個(gè)健壯一致的芽置于直徑4cm、高9.5cm的玻璃試管中,將試管置于4-5'C冰箱中低溫處理5d,然后將低溫處理后的幼芽移至光照培養(yǎng)室中恢復(fù)生長(zhǎng)7d,測(cè)定高代回交群體(BC4F2群體)、桂朝2號(hào)及麗江新團(tuán)黑谷的活苗率,以活苗率[活苗率=(活苗數(shù)/供試苗數(shù))xiooy。]作為芽期耐冷性的指標(biāo)進(jìn)行耐冷性評(píng)價(jià),篩選出芽期強(qiáng)耐冷系IL112。結(jié)果表明,IL112的活苗率為100%,其芽期耐冷較強(qiáng)。隨后以IL112為供體,以桂朝2號(hào)為受體構(gòu)建F2:3群體,對(duì)其群體按照上述方法進(jìn)行芽期耐冷性鑒定,統(tǒng)計(jì)各株系的活苗率。進(jìn)一步的耐冷性分析表明,IL112及其后代能耐9d的4-5X:低溫,具有極強(qiáng)的芽期耐冷性。提取上述Fu群體各單株的基因組DNA,進(jìn)行SSR分析,獲得各株系的基因型,并利用QTXMAP17軟件進(jìn)行耐冷性QTL分析,結(jié)果在第1,2,5,6,7和10染色體上均檢測(cè)到與芽期耐冷性相關(guān)的QTL。為了精細(xì)定位這些QTL,找到與水稻芽期耐冷性相關(guān)的基因,以IL112和桂朝2號(hào)為材料進(jìn)行芯片(Affimetrix公司的水稻全基因組芯片(GeneChipRiceGenomeArray,貨號(hào)900599)雜交,在芯片數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合比較基因組學(xué)分析,在全基因組水平上篩選在日本晴和93-11間存在基因組差異的表達(dá)差異基因作為候選目的基因。依據(jù)日本晴的基因組序列,在二者存在基因組差異的區(qū)域設(shè)計(jì)引物p18(序列3和序列4),分別以江西東鄉(xiāng)普通野生稻、IL112和桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為水稻基因組DNA模板20ng,PlusDNA聚合酶0.5U,2.OW10XPCR緩沖液(100mMTrisClpH9.0,500mMKC1,15mMMg2+,1%TritonX-100),IOOMMdNTPs,正、反向引物各0.2MM,DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20W。PCR反應(yīng)條件為先94。C3min;然后94°Clmin,58°Clmin30sec,72°C2min,共35個(gè)循環(huán);再72°C10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),具體檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其中l(wèi)、2和3分別為以江西東鄉(xiāng)野生稻、IL112和桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶,DL2000為100—2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根生化科技有限公司,貨號(hào)Cat#HT402-01)。結(jié)果表明,在江西東鄉(xiāng)普通野生稻和IL112中擴(kuò)增到相同的條帶,其大小在1000bp左右;而桂朝2號(hào)中無(wú)擴(kuò)增條帶?;厥諗U(kuò)增得到的條帶并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,其核苷酸序列如序列表中序列2所示,并將其命名為Z77V,其編碼的氨基酸序列如序列表中序列1所示。為了驗(yàn)證基因Z777與水稻芽期耐冷性是否相關(guān),以pl8為引物,對(duì)Fu群體進(jìn)行了基因型檢測(cè),結(jié)合前面進(jìn)行的表型鑒定結(jié)果,用T-Test方法分析基因型與芽期耐冷性的關(guān)系,結(jié)果表明,Pl8擴(kuò)增產(chǎn)物單獨(dú)滲入時(shí)即與芽期耐冷性存在顯著相關(guān)性(尸<0.01)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因Z777與水稻芽期耐冷性的相關(guān)性,按照上述方法對(duì)125個(gè)水稻品種和地方種進(jìn)行了芽期耐冷性鑒定,并從中隨機(jī)選取20個(gè)水稻品種(10個(gè)耐冷品種,IO個(gè)耐冷性差品種,具體品種見(jiàn)表3)分別提取其基因組DNA,以pl8為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)其基因型,同時(shí)以IL112和桂朝2號(hào)作為對(duì)照。具體檢測(cè)如圖2所示。其中,泳道1為以IL112的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;泳道2—11為以IO個(gè)耐冷水稻品種的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;泳道12為以桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;泳道13_22為以10個(gè)耐冷性差的水稻品種的基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶;DL2000為100—2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根生化科技有限公司,貨號(hào)CatfflT402-01)。結(jié)果表明,在10個(gè)耐冷水稻品種中,9個(gè)品種均擴(kuò)增出與IL112相同的條帶,且條帶大小在1000bp左右;在10個(gè)耐冷性差的水稻品種中,9個(gè)品種均未擴(kuò)增出任何條帶,僅有1個(gè)品種能擴(kuò)增出與IL112相同的條帶。同時(shí)對(duì)以上20個(gè)水稻品種、IL112和桂朝2號(hào)的芽期耐冷性進(jìn)行表型鑒定,結(jié)果如表4所示。_表4水稻的芽期耐冷性鑒定結(jié)果__水稻品種_活苗率IL112100%746100%云峰7號(hào)100%香粳糯100%晚88-1100%尚洲10100%密陽(yáng)111100%合系35100%REIMEL100%IR66746-76-3-2100%9505-138100%桂朝2號(hào)0%03A-110%03A-90%中優(yōu)130%377600%水源3490%水源3320%水源2870%VISTA0%TP340%SR64446-10%實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù),表4中的數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值。用T-Test方法分析基因型與芽期耐冷性的關(guān)系,相關(guān)性分析結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明,基因^77與水稻芽期耐冷性存在極顯著相關(guān)性(尸<0.01)。表5.p18與水稻耐冷性的相關(guān)性分析分子標(biāo)記RSquareSignificanceFRatio1Ratio2p18的PCR產(chǎn)物0.56642.2074E-05**90%腦Ratiol為有分子標(biāo)記滲入的耐冷水稻品種數(shù)目/10;Ratio2為有分子標(biāo)記滲入的不耐冷水稻品種數(shù)目/10;**:p<0.01。以上結(jié)果表明,基因Z777是與水稻芽期耐冷性相關(guān)的基因,而且此基因是一功能未知的基因。實(shí)施例2、Z777轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其耐冷性鑒定一、Z777植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)日本晴的L0C—0s01g51670的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物,并在引物兩端分別引入限制性?xún)?nèi)切酶i^/7l和5^cl識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基,引物序列如下CDS-PF:5,-CGGGGTACCCCGTCTGAACTCCAAACATCAGTAAGC_3,(序列5)(帶下劃線(xiàn)堿基為限制性?xún)?nèi)切酶&/I識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基);CDS-PR:5,-CGAGCTCGTGACTTCAAATAATTTTTCAGGATATT-3,(序列6)(帶下劃線(xiàn)堿基為限制性?xún)?nèi)切酶6"acl識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。利用TRIZOL試劑提取江西東鄉(xiāng)普通野生稻經(jīng)4t:低溫處理12h的芽期總RNA,以此RNA為模板,使用SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,Catno.18064-014)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以此cDNA為模板,在引物CDS-PF和CDS-PR的引導(dǎo)下,RT-PCR擴(kuò)增水稻Z777基因的編碼序列。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),回收并純化995bp的DNA片段進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增得到的DNA片段的脫氧核苷酸序列是序列表中序列2的自5'端第1-995位核苷酸序列。用歷/dlI和分別雙酶切載體pBI121(購(gòu)自Promega公司)和載體pCAMBIA1300(購(gòu)自澳大利亞CAMBIA公司),連接pBI121酶切得到的35S啟動(dòng)子和pCAMBIA1300酶切后的大片段,即得到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S。將上述995bp的DNA片段克隆入植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S多克隆位點(diǎn)的A^/7l和&cI酶切位點(diǎn)之間,得到含有水稻Z777基因的重組表達(dá)載體,命名為pCAMBIA1300-35S-LTT1。二、轉(zhuǎn)化水稻將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-LTT1和pCAMBIA1300-35S分別用基因槍法轉(zhuǎn)化日本晴的成熟胚愈傷組織,用含50mg/L潮霉素的NB培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選,每輪篩選20-30天,篩選得到的愈傷組織經(jīng)預(yù)分化、分化得到轉(zhuǎn)基因的水稻植株,用T。代表示,T。代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株用L代表示。三、轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定培育一株轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S-LTT1的T。代水稻轉(zhuǎn)基因植株,提取上述T。代轉(zhuǎn)基因水稻的基因組DNA,并以此為模板,在引物l(序列7)和引物2(序列8)的引導(dǎo)下,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的日本晴作為對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為先94°C5min;然后94。C30sec,58。C45sec,72。Clmin,共35個(gè)循環(huán);再72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。具體檢測(cè)結(jié)果如圖3A所示。其中,泳道1為轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-LTT1的T。代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,泳道2為未轉(zhuǎn)基因的日本晴的PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,DL2000為100—2000bp的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(天根生化科技有限公司,貨號(hào)Cat#HT402-01)。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-LTT1的T。代轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出大小約為1Kb的條帶,而對(duì)照未轉(zhuǎn)基因的日本晴植株中卻無(wú)條帶。按照實(shí)施例1所述的芽期耐冷性鑒定方法對(duì)上述PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的T。代的后代,即L代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐冷性鑒定,同時(shí)以轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S的T。代水稻得到的T,代轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照。每個(gè)株系IO株。具體檢測(cè)結(jié)果如圖3B所示。其中,CK為正常條件下生長(zhǎng)的L代轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S植株(Control)和L代轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S-LTT1植株(0E1);cold為經(jīng)4-5。C低溫處理5d,正常條件下恢復(fù)生長(zhǎng)7d后的L代轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S植株(Control)和L代轉(zhuǎn)pC細(xì)IA1300-35S-LTT1植株(0E1)。結(jié)果表明,L代轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐冷性。4-5"C低溫處理5d,正常條件下恢復(fù)生長(zhǎng)7d后,L代轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)良好,葉色濃綠,活苗率為100%,株高8.37土0.51cm;而相同處理的對(duì)照植株(轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-35S的日本晴)卻長(zhǎng)勢(shì)很差,株高2.9土0.53cm,明顯矮于L代轉(zhuǎn)Z777基因植株,活苗率為50%。序列表<160>8<210>1<211>168〈212〉PRO〈213〉普通野生稻(an^/wgo"Griff.)<400>1MetSerSerLeuArgArgGluAlaProProlieSerAspTyrGluAla151015LeuAspGlySerGlyLysCysThrAspGluProSerCysSerSerAsp202530ProSerLysAspSerSerSerCysThrSerAlaPheAlaPheThrlie354045LeuAlalieAsnCysGlyAlaAlalieTyrHisSerArgArgAspPro505560TrpSerValAlaPheValLeuAlaAlaPheLeuMetLeulieSerLeu65707580PheCysAlaLeuArgLeuPheGluSerLeuProArgSerSerProArg859095ArgSerHisValLysAlaGlyValTrpValLeuSerThrValLeuThr100105110lieLeuPheThrTyrArgValAlaAlaLeuMetProPheProValAla115120125ValValValTrpAlaMetSerValPheThrlieLeuAlaGlyPheTyr130135140MetPhePheValCysSerAspGluValLysAlaAlaProGluGluArg145150155160ProAlaLysValSerAspMetAla165<210>2<211>995<212>DNA<213〉普通野生稻(an(/;70gowGriff.)〈400>2tctgaactccaaacatcagtaagctagatatcccttcctacgccgaaggcagaagcgtcg60acgatgtcgagtctccgcagggaagctccaccgatctctgactacgaggcactagatggt120tccggcaaatgcaccgacgaaccatcatgctcctcggatcctagcaaagacagctcgtcg180tgtacatcggccttcgccttcaccatccttgccatcaactgcggcgcagctatctaccat240tcgcggcgtgacccctggtcagtcgcgtttgtgttggccgccttcctcatgctcatctcg300ctcttctgcgcgctccgcttgttcgagagcttgcctcgcagctccccccgcagatcccat360gtcaaagccggtgtttgggtcctttccacggtgctcacaatcttgttcacctacagagta420gctgcgcttatgcctttcccagtcgccgttgtcgtgtgggctatgtccgtcttcacaatt480cttgcaggattctacatgttcttcgtttgcagcgacgaggtcaaggcggcgccagaggag540aggccggcaaaagtgtctgacatggcttgagccctggggccctggctgtgcaacccctgt600ggaaacgtcagtgctccactgctgggacccgagacggagacgccggcaacatcataattc660cccagcagtgtgtgtcccgattgcacaaccggaacaaaagggattgtgaaaagatcgatt720cctcagctgtgattgcaagtgctcctccaccctgcgcagctgtatggttttgaccgagtt780tcaggaccaaaaacggttcctccgccctgtgctgattcaccggtagttcctgttgataca840gtatcttccaaagcctctggttttcagaatgatcaaaggaaccacagaagatacactagg900gctcggattacagtacaeicctgtaactttccagtttcggccacaaattgttccgagtgat%0gtcatatgtaatatcctgaaaaattatttgaagca995<210>3〈211〉18<212〉靈<213〉人工序列<400>3ctacgccgaaggcagaag18<210〉4〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列<400〉4tcattcggaacaatttgtgg20<210〉5〈211〉36<212〉DNA<213〉人工序列<400〉5CGGGGTACCCCGTCTGAACTCCAAACATCAGTMGC36<210>6<211>35〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>6cgagctcgtgacttcaaataatttttcaggatatt35<210>7<211>18<212>DNA<213〉人工序列<400>7tacttctacacagccatc18<210〉8〈211>18〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉8cgtctgtcgagaagtttc18權(quán)利要求1.一種蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因,其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'端第64-570位脫氧核糖核苷酸;2)其核苷酸序列是序列表中序列2;3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序歹U2限定的DNA序列雜交且編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的DNA分子。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體,其特征在于所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1300-35S;所述pCAMBIA1300-35S是用歷'/7dn和J&I分別雙酶切載體pBI121和載體pCAMBIA1300,連接pBI121酶切得到的35S啟動(dòng)子和pCAMBIA1300酶切后的大片段,即得到pCAMBIA1300-35S。6、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。7、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組菌。8、擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)。9、一種培育耐冷植物的方法,是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入宿主植物中,得到耐冷性提高的植物。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,所述宿主植物為單子葉植物,優(yōu)選為水稻。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種與植物耐冷性相關(guān)的蛋白及其編碼蛋白與應(yīng)用。該蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐冷性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的培育耐冷植物的方法對(duì)于植物耐冷性分子機(jī)制的研究、耐冷品種的選育以及植物耐冷性分子育種具有重要的理論及實(shí)際意義,為提高植物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。文檔編號(hào)C12N1/21GK101280008SQ20081011301公開(kāi)日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日發(fā)明者付永彩,劉鳳霞,劉家勇,孫傳清,朱作峰,震蘇,譚祿賓申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)