專利名稱：一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物細(xì)胞的逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ca2+作為第二信使具有非常重要的作用。當(dāng)植物細(xì)胞受到脅迫刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有時(shí)空特征的Ca2+信號(hào)，通過各種Ca2+傳感器蛋白識(shí)別和解碼，激活下游的級(jí)聯(lián)應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致許多逆境相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)。目前在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)⑶Hi (鈣依賴蛋白激酶)、CaM(鈣調(diào)素)、CBL(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B類似蛋白)等三類均與鈣信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的結(jié)合蛋白。CBL作為近年發(fā)現(xiàn)的一類鈣結(jié)合蛋白家族，對(duì)其功能研究逐漸成為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的熱點(diǎn)。擬南芥及水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10種編碼該類蛋白的基因。CBL是植物中存在的一類能夠結(jié)合鈣離子的小蛋白家族，CBL只能通過唯一一類蛋白家族CIPlUCBL-interaction protein kinase)相互作用才能將信號(hào)繼續(xù)向下游傳遞。所以，一種CBL可能與多個(gè)CII3K 相互作用，而幾個(gè)CBL也可能和一個(gè)Cira相互作用，從而組成多條信號(hào)傳遞的支路。目前， 已經(jīng)闡明多條CBL-Cira信號(hào)途徑的支路，它們分別參與低鉀、高鹽、干旱、ABA等非生物脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)。鉀作為植物生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)元素，土壤中鉀成分隨著耕作和水土侵蝕而減少，植物生活在潛在的低鉀條件下，因此，植物能在低鉀條件下正常生長(zhǎng)則變的尤為重要。研究表明在低鉀條件下，AtCBLl/AtCBL9結(jié)合并激活A(yù)tCIPK23形成AtCBLl/AtCBL9_AtCIPK23組合，被牽引到細(xì)胞質(zhì)膜上的AtCIH(23激活K+轉(zhuǎn)運(yùn)體(K+transporter) AKTl，進(jìn)而促進(jìn)植物對(duì)K+的吸收。目前低鉀信號(hào)是否是通過Ca2+信號(hào)傳遞給AtCBLl/AtCBL9的途徑不確定，而且CIH(23也有可能通過其它未知的K+轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)促進(jìn)K+的吸收；一些逆境條件，包括藍(lán)光、 生物侵染等都能使植物細(xì)胞膜內(nèi)的質(zhì)子梯度發(fā)生變化。膜內(nèi)外質(zhì)子濃度的調(diào)節(jié)是植物的主要一類響應(yīng)逆境的適應(yīng)方式。細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子濃度的調(diào)節(jié)主要是通過質(zhì)膜上H+-ATP酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而質(zhì)膜上H+-ATP酶的調(diào)節(jié)主要是通過磷酸化和去磷酸化調(diào)控。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)CBL-CII3K信號(hào)途徑中的H(S5/CIPK11是質(zhì)膜H+-ATP酶AHA2的負(fù)調(diào)節(jié)因子。AHA2通過 PKS5/CIPK11磷酸化后而解除了與14-3-3蛋白的相互作用，從而使14_3_3蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的能力喪失。PKS5/CIHQ1磷酸化AHA2的位點(diǎn)位于第931位的絲氨酸上。在pks5突變體中AHA2 的活性被抑制，AHA2與14-3-3蛋白相互作用而增強(qiáng)了 14_3_3蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的能力，pks5 比野生型更能適應(yīng)堿性環(huán)境條件下生長(zhǎng)。酵母雜交系統(tǒng)證據(jù)顯示，在擬南芥中H(S5/CIPK11 通過與kaBPl/CBL2相互作用，而調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的去極化過程；CBL-CII3K作為近來(lái)研究的一類鈣信號(hào)傳遞途徑也參與了 ABA依賴途徑的信號(hào)傳遞過程。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥種子萌發(fā)過程中，CIPK3基因表達(dá)能被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。在施加外源ABA時(shí)，突變體cipk3的萌發(fā)比野生型延遲，說(shuō)明CIPK3參與了 ABA的信號(hào)傳遞過程。而且還發(fā)現(xiàn)，CIPK3參與了許多逆境應(yīng)答基因的表達(dá)調(diào)控。在低溫和高鹽條件下，逆境應(yīng)答基因RD^A、Kim、KIN2在野生型擬南芥中能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而在cipk3突變體中雖然也都能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但是被強(qiáng)誘導(dǎo)的時(shí)間推遲、強(qiáng)度減弱。與高鹽和低溫條件下不同的是，在干旱條件下，野生型和cipk3的逆境應(yīng)答基因表達(dá)方式相同。由于干旱和高鹽都存在一個(gè)共同的ABA依賴信號(hào)途徑，而CIPK3對(duì)逆境應(yīng)答基因的調(diào)節(jié)不作用于干旱條件而只作用于高鹽條件，說(shuō)明CIPK3 —定參與ABA非依賴途徑的信號(hào)傳遞過程。以上證據(jù)說(shuō)明CIPK3同時(shí)介導(dǎo)了 ABA依賴和非ABA依賴兩種信號(hào)途徑。另外，已經(jīng)研究表明植物對(duì)低溫逆境的信號(hào)傳遞是由非ABA依賴途徑參與進(jìn)行的；但是，通過對(duì)cipk3的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型比較，逆境應(yīng)答基因RD^B的表達(dá)方式在低溫、ABA 等逆境條件下都發(fā)生了改變，說(shuō)明CIPK3是ABA和低溫信號(hào)傳遞途徑等的交叉響應(yīng)節(jié)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱為0sCIH(7，來(lái)源于水稻中花十號(hào)(Oryza sativa L. cvZhonghua 10)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中的序列2由447個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白(0sCIPK7)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白(0sCIPK7)的編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1自5’末端第71-1414位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且與植物耐逆性相關(guān)的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且與植物耐逆性相關(guān)的DNA分子。上述序列表中的序列1由1707個(gè)核苷酸組成，其編碼區(qū)為自5’末端第71-1414 位核苷酸。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體通過如下步驟獲得 1)將用I^st I和BamHI酶切質(zhì)粒KSP9得到的大小約為2. Okb的小片段插入 PUC19的Pst I和BamII識(shí)別位點(diǎn)間獲得中間載體pUC19+UbiPro ；再用SacI和EcoR I酶切pBI221得到的小片段插入中間載體pUC19+UbiPro的McI和EcoR I識(shí)別位點(diǎn)間，獲得中間載體pUC19+UbiPro+Noster ；再用EcoR I部分酶切和HindIII完全酶切中間載體 pUC19+UbiPro+Noster 得到的大小約為 2. 3kb 的片段插入pCAMBIA1301 的 EcoRI 和HindIII識(shí)別位點(diǎn)間，構(gòu)成中間載體PUN1301 ；2)將0sCIPK7蛋白的編碼基因插入中間載體pUN1301的KpnI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)
間，獲得重組載體。擴(kuò)增所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫侥湍嫘愿哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物。所述耐逆性為耐低溫、耐旱性和/或耐鹽性。所述編碼基因是通過所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，在粳稻中花十號(hào)中克隆到的基因0sCIPK7導(dǎo)入水稻中花十號(hào)，經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)，獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻株系，分析超表達(dá)株系和其對(duì)應(yīng)野生型表型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出明顯的耐旱和耐凍等抗逆特性。


圖1為RT-PCR方法擴(kuò)增到0sCIPK7的全長(zhǎng)cDNA圖2為超表達(dá)載體PUN-CIPK7的物理圖譜圖3為轉(zhuǎn)基因水稻的定量PCR鑒定圖4為0sCIPK7超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)低溫脅迫的耐受性圖5為0sCIPK7超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性圖6為0sCIPK7超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)高鹽脅迫的耐受性
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)0sCIPK7水稻的獲得l、0sCIH(7 的克隆根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)分析的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，5'端引物5' -CGG GAT CC ATA GTA ACC AGCTGC-3‘(下劃線序列為 BamHI 位點(diǎn)，序列 3)，3'端引物5' -GGG GTA CCG TCG AGA ATCGAA TAC C-3 ‘(下劃線序列為KpnI位點(diǎn)，序列4)，提取粳稻中花十號(hào)三葉期幼苗總 RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增到0sCIPK7的1707bp全長(zhǎng)cDNA。具體操作過程如下 1)植物總RNA的提取選取IOOmg三葉期水稻中花十號(hào)(Oryza sativa L. cvZhonghua 10)的幼苗(李梅芳，水稻花培品種-中花10號(hào)，農(nóng)業(yè)科技通訊，1998年第1期第26頁(yè)。公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得。)為材料，在液氮中研磨，將液氮中研碎的凍干粉轉(zhuǎn)入到含Iml Trizol試劑(Invitrogen)的1. 5ml離心管中，充分混勻；25°C放置5 分鐘；每管中加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15秒，25°C溫育2-3分鐘；12, OOOrpm,4^ 心15分鐘；把上清的水相0. 5ml轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離心管中，加0. 5ml異丙醇，25°C放置10分鐘使RNA沉淀；12，OOOrpm, 4°C，離心10分鐘；去上清，將RNA沉淀用Iml 75%乙醇清洗2次，超凈臺(tái)吹至半干；用50 μ 1 DEPC-ddH20重懸沉淀，60°C水浴10分鐘，以溶解RNA 沉淀獲得RNA溶液。將此RNA溶液分裝后-70°C保存，備做反轉(zhuǎn)錄的模板。2) RT-PCR 取1 μ 1上述RNA溶液，用DEPC_ddH20稀釋100倍，用分光光度計(jì)測(cè)定 RNA濃度。參照RT-PCR試劑盒(ftOmega)說(shuō)明書，根據(jù)RNA的定量結(jié)果，取含有2 μ gRNA的上述RNA溶液，加1. 0 μ g 01 igo dT引物，用DEPC-ddH20補(bǔ)充至15 μ 1，混勻后70°C變性5分鐘，冰浴5分鐘。短暫離心后，加入25 μ 1反轉(zhuǎn)錄混合物(5 μ IM-MLV 5 X Reaction Buffer, 6 μ IdNTP Mixture(2. 5mM),1 μ IM-MLV ReverseTranscriptase,0. 5 μ 1 RNase Inhibitor, 12. 5 μ lDEPC-ddH20)?；靹蚝螅?2°C水浴1小時(shí)完成反轉(zhuǎn)錄過程；75°C水浴10分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到含有第一鏈cDNA的混合物。取1 μ 1上述第一鏈cDNA作為PCR的模板，按以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng) 0. 2 μ ILATaq (5U/μ 1)、10 μ 12 X GC buffer, 1. 8μ 1 dNTPs，0· 5 μ 15 ‘端弓I 物(10 μ Μ)， 0. 5μ 1 3'端引物(ΙΟμΜ)，加ddH20終體積20μ 1。引物序列5'端引物5' -CGG GAT CCATA GTA ACC AGC TGC-3 ‘(下劃線序列為BamHI位點(diǎn)，序列3)，3 ‘端引物5' -GGG GTACCG TCG AGA ATC GAA TAC C-3'(下劃線序列為 KpnI 位點(diǎn)，序列 4)，PCR 程序?yàn)?4C 預(yù)變性3分鐘后進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C 30秒變性一58°C 30秒復(fù)性一72°C 1分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)后在72°C繼續(xù)合成10分鐘。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，得到分子量大約1. 7kb的條帶，用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收該片斷得到 20 μ 1回收產(chǎn)物。進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果該P(yáng)CR產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1的OFR為序列表中序列1自5’末端第71-1414位核苷酸。該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名0sCIH(7，0sCIPK7編碼的蛋白為0sCIH(7，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。2、表達(dá)載體pUN-CIPK7的獲得A 含有 0sCIPK7 的 cDNA 序列的載體 pTE_CIPK7取3. 5μ 1上述PCR產(chǎn)物的回收產(chǎn)物，加入1μ l(3U/y 1)T4-DNA連接酶、5μ 1 2X 連接酶緩沖液、0. 5μ l(50mg/ml)pGEM-T fesy載體(Promega)4°C連接過夜，得到連接產(chǎn)物， 用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含羧芐青霉素的抗性平板篩選得到含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。采用堿裂解法從菌株中分離提取質(zhì)粒，以PGEM-T fesy載體上的 T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物，進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果pGEM-TCasy載體中插入序列表中的序列 1，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pTE-CIH(7。B :pUN1301質(zhì)粒的獲得第一步剪取約0. 2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800 μ L新配制的提取緩沖液(含 0. IM Tris-HCl ρΗ8· 0，50mM EDTA, 0. 5M NaCl，1 % SDS ^P 1 % β -巰基乙醇)， 劇烈振蕩使其全部懸浮；65°C水浴30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次；然后加入250 μ L預(yù)冷的5Μ乙酸鉀水溶液，立即顛倒混勻，冰浴5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清液，加入0. 6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4°C 12000rpm 離心15分鐘，棄上清；沉淀用70%、100%乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μ 1含100μ g/mL RNase的ddH20中，得到玉米基因組DNA。第二步取上述玉米基因組DNA溶液2μ L作為模板，以帶有Hind III識(shí)別位點(diǎn)的5 ‘引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有BamHI識(shí)別位點(diǎn)的3 ‘引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為先 94°C 3 分鐘；再94°C 45秒，62°C 45秒，72°C 2分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后， 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明得到長(zhǎng)度約為21Λ的擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收該目的片段，用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI雙酶切后回收，得到片段經(jīng)測(cè)序，該片段為序列表中的序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸，為帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子⑴biPro)。(玉米泛素啟動(dòng)子(WDiPro)也可以人工合成獲得。)第三步用限制性內(nèi)切酶Me I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體 PBI 121(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司目錄號(hào)MP-091)上切下，連接到載體pUC19 (北京百泰克生物技術(shù)有限公司目錄號(hào)DP7801)的Mc I和EcoRI位點(diǎn)間，得到重組載體，命名為pUC19-Noster。再用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI雙酶切pUC19_Noster，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與第二步中經(jīng)酶切獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動(dòng)子(WDiPro)相連，得到重組載體，命名為pUN19。第四步用限制性內(nèi)切酶EcoRI部分酶切和HindIII完全酶切從第三步購(gòu)建的重組載體PUN19切下包含W^iPro和Noster的長(zhǎng)度約為2. 3kb的片段，將該片段克隆入質(zhì)粒載體 pCAMBIA1301 (Biovector Co.，LTD 公司目錄號(hào) Biovec-Il)的 EcoRI 和 HindIII 位點(diǎn)處，得到重組載體，命名為PUN1301。C 表達(dá)載體pUN-CIPK7的獲得用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對(duì)B步驟獲得的質(zhì)粒pUN1301進(jìn)行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒 10μ l、10x 酶切緩沖液 5μ l、KpnI 1 μ 1 (IOU/μ 1)、BamHI 0· 8 μ 1 (IOU/μ 1)，加 ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μ 1，37°C酶切4小時(shí)。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離， 回收線性化的PUN1301大片段，溶于20 μ 1 ddH20中。用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對(duì)A步驟獲得的質(zhì)粒pTE_CIPK7進(jìn)行雙酶切。酶切體系為質(zhì)粒 ο μ 1，酶切緩沖液5 μ 1、KpnI 1 μ 1 (IOU/μ 1)、加ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至 50μ 1，37°C酶切 4 個(gè)小時(shí)。再加入 BamHI 0. 2 μ 1 (IOU/μ 1)，37°C酶切 20 分鐘。用 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，用AXyft~ep公司的DNA凝膠回收試劑盒回收該片斷， 回收 1700bp 的 0sCIPK7cDNA 片段。將10 μ 1回收的1700bp的0sCIPK7cDNA溶液、6 μ 1回收的載體pUN1301大片段溶液、2μ 1(3υ/μ 1)T4DNA連接酶和2μ 1 IOx連接酶緩沖液混和，16°C連接16小時(shí)，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆中的重組質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果含有序列表中的序列1的核苷酸的為正確重組質(zhì)粒，命名為pUN-CIH(7，且pUN-CIPK7中啟動(dòng)子、基因和終止子的結(jié)構(gòu)正確。在該表達(dá)載體中采用玉米泛素啟動(dòng)子(WDiPro)啟動(dòng)目的基因0sCIPK7在植物中超表達(dá)，其物理圖譜示意圖如圖2所示。3、轉(zhuǎn)0sCIPK7水稻的獲得1)遺傳轉(zhuǎn)化參照電激儀(EasyJecT Plus電激儀，英國(guó)EquiBio公司)操作指南，將步驟2獲得的表達(dá)載體PUN-CIPK7用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (Biovector Co. , LTD公司目錄號(hào) Biovec-11)，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽(yáng)性克隆的超表達(dá)工程菌，命名為EHA105/ PUN-CIPK7。
7
將EHA105/pUN-CIH(7 導(dǎo)入中花十號(hào)水稻(Oryza sativa L. cv Zhonghua 10)的愈傷組織，再將導(dǎo)入EHA105/pUN-CIPK7的愈傷組織用含300mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水洗滌 4-5遍，無(wú)菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)至N6D2S1培養(yǎng)基上，篩選一代；兩周后，轉(zhuǎn)移至N6Dj2培養(yǎng)基上篩選二代O周/代)；取出經(jīng)過3代篩選生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(1)， 上，在分化培養(yǎng)箱(12小時(shí)光周期，白天^°C，夜晚25°C)中培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基O)，上，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。再生的植株在生根壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗；待小苗長(zhǎng)至10厘米左右時(shí)，打開容器封口膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培，獲得6個(gè)株系共25棵TO代轉(zhuǎn)0sCIPK7水稻。所用培養(yǎng)基如下
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列1自5’末端第71-1414位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且與植物耐逆性相關(guān)的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且與植物耐逆性相關(guān)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)；所述引物對(duì)如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示。
6.一種培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3中所述的編碼基因?qū)肽康闹参锏玫侥湍嫘愿哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐低溫、耐旱性和/或耐鹽性。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述編碼基因是通過權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供蛋白質(zhì)，名稱為OsCIPK7，來(lái)源于水稻中花十號(hào)(Oryza sativa L cv Zhonghua 10)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將OsCIPK7蛋白的編碼基因?qū)胨局谢ㄊ?hào)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出明顯的耐旱和耐凍等抗逆特性。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102336823SQ201010233089
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者張大健, 徐云遠(yuǎn), 李俊華, 種康 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所