專利名稱：一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、鹽堿等非生物逆境是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，
世界干旱、半干旱區(qū)占地球陸地面積的33%，鹽堿地占地球陸地面積的7.6%，有5.54 億畝的鹽堿地有待開(kāi)墾利用。
利用常規(guī)育種方法改良作物的抗逆性受到周期長(zhǎng)、優(yōu)異種質(zhì)資源缺乏的制約。 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)，從分子水平上深入研 究植物與非生物逆境之間的關(guān)系，揭示植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控的 分子機(jī)理，從而培育抗逆作物新種質(zhì)成為了可能。目前，通過(guò)基因工程技術(shù)已將許 多抗旱，耐鹽和耐低溫相關(guān)的基因(主要包括合成各類滲透保護(hù)劑的酶類基因、 抗氧化酶類基因、LEA蛋白類基因以及轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的蛋白激酶基因) 導(dǎo)入到作物中，獲得了一些抗逆性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。
通過(guò)基因工程技術(shù)將抗逆相關(guān)的功能基因?qū)胱魑?，從而提高作物的抗逆性?有大量的報(bào)道。Lilius等將編碼膽堿脫氫酶的基因(BetA)導(dǎo)入煙草和馬鈴薯，獲 得了抗鹽和耐低溫的轉(zhuǎn)基因植株(Lilius et al. ， 1996) 。 Nakamura等將甜菜堿 醛脫氫酶基因(BADH)導(dǎo)入煙草，增加了煙草中的甜菜堿的含量，同時(shí)明顯提高了 煙草對(duì)鹽和寒冷脅迫的耐受能力(Nakamura et al. ， 1997) 。 Thomas等將甘露醇 1-磷酸脫氫酶基因(mltD)導(dǎo)入擬南芥，增強(qiáng)了擬南芥的耐鹽性(Thomas et al.， 1995)。在植物體內(nèi)，抗氧化系統(tǒng)由許多酶組成，如S0D、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶 和谷胱甘肽還原酶。SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵酶，植物中已有幾種SOD酶基 因被克隆出來(lái)并在轉(zhuǎn)基因植株中得到了活驗(yàn)證性。McKersie等將煙草Mn-SOD導(dǎo)入苜 蓿，轉(zhuǎn)基因苜蓿在干旱脅迫環(huán)境下的產(chǎn)量和存活率都有了顯著提高(McKersie et al.， 1999) 。 LEA基因(編碼胚胎發(fā)育后期豐富蛋白)是最受關(guān)注的與抗旱有關(guān)的 非酶類功能蛋白。Xu等將大麥的LEA蛋白基因HVAl導(dǎo)入水稻后，在干旱條件下轉(zhuǎn)基 因水稻比對(duì)照水稻生長(zhǎng)快，解除脅迫后恢復(fù)也快，表明通過(guò)轉(zhuǎn)LEA蛋白基因來(lái)提高 植物的耐旱性有著很大的潛力(Xu et al.， 1996)。植物對(duì)干旱、高鹽等逆境脅 迫的耐性是多基因控制的數(shù)量性狀，其生理、生化過(guò)程是基因相互作用、共同調(diào)節(jié)的，導(dǎo)入單個(gè)功能基因雖然在一定程度上提高了植物的抗逆性，但提高幅度不大，
往往不能達(dá)到有效增強(qiáng)植物抗逆性的目的(Liu et al., 1998;劉強(qiáng)等，2000)。 近年來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能的分析來(lái)鑒定、闡明各種條件下基因表達(dá) 調(diào)控的機(jī)理得到了廣泛關(guān)注(劉強(qiáng)等，2000)。擬南芥的AtMYC2和AtMYB2轉(zhuǎn)錄因子， 在逆境脅迫下表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)也增強(qiáng)了干旱應(yīng)答基因rd22和AtADHl的表達(dá)(Abe et al.， 2003) 。 Yamaguchi-Shinozaki等人的研究結(jié)果表明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因，AtDREBlA cDNA和rd29A啟動(dòng)子能有效提高農(nóng)作物對(duì)干旱、高鹽和低溫的抗性(Yamaguchi-Shinozaki et al. ， 2002)。將擬南芥AtDREBlA基因?qū)肫胀ㄐ←溒贩NBobwhite26， 可以明顯提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱性(Pellegrineschi et al. ， 2004)。將大豆GmDREB 基因轉(zhuǎn)化小麥品種魯麥22號(hào)，轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱、耐鹽性得到明顯提高(Gao et al.， 2005) 。 AtDREBlA/CBF3基因的超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)低溫脅迫的耐 性(Seki et al.， 2001) 。 GmDREB3基因的超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植 株對(duì)干旱和低溫脅迫的耐性(Chen et al. ， 2007)。轉(zhuǎn)ABF3基因的擬南芥，對(duì)低 溫、熱、氧化脅迫的耐性比野生型擬南芥明顯增強(qiáng)(Kim et al. ， 2004) 。 ABF2/AREB1 過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫耐性顯著增強(qiáng)(Fujita et al., 2005)。
堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)蛋白是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分 布最廣泛、最保守的一類蛋白。研究表明bZIP蛋白不僅參與種子貯藏基因的表達(dá)、 光形態(tài)的發(fā)生以及器官建成的控制(Finkelstein et al. ， 2000; Finkelstein et al., 2002)，還參與植物對(duì)脫落酸、光和發(fā)育中各種信號(hào)的反應(yīng)(Jakoby et al.，
2002) 。植物bZIP類轉(zhuǎn)錄因子的共同特點(diǎn)是1)含有與特異DNA序列相結(jié)合的堿性 結(jié)構(gòu)域，大約由20個(gè)氨基酸組成，它緊靠亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的N末端，能與專一的 DNA序列相互作用(Landschulz et al. ， 1988); 2)參與寡聚化作用的亮氨酸拉鏈 區(qū)與堿性區(qū)緊密相連，典型的特征是每7個(gè)氨基酸的第7位含有一個(gè)亮氨酸。亮氨酸 拉鏈形成一個(gè)兩親的螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)參與bZIP蛋白與DNA結(jié)合之前的二聚體化；3) 轉(zhuǎn)錄因子的N-末端含有酸性激活區(qū)；4)以二聚體形式結(jié)合DNA，肽鏈N-末端的堿性 區(qū)與DNA直接結(jié)合。除了共有上述兩種保守的結(jié)構(gòu)域外，有些植物的bZIP蛋白還共 有其它一些結(jié)構(gòu)域，如脯氨酸、谷氨酞胺和酸性氨基酸豐富的結(jié)構(gòu)域，這些特殊 的結(jié)構(gòu)域可能與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相互作用從而調(diào)控下游基因的表達(dá)(Suzuki et al.，
2003) 。
bZIP類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別核心序列為ACGT的順式作用元件，如CACGTG(G盒)、GACGTC (C盒)、TACGTA (A盒)等， 一些受光或脫落酸(ABA)誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子區(qū)都含有這些元件。G盒元件普遍存在于受ABA、生長(zhǎng)素、茉莉酸、水楊酸誘導(dǎo)的基因中， 還是光誘導(dǎo)基因中最常見(jiàn)的順式作用元件之一，擬南芥HY5、 GBF2等bZIP類轉(zhuǎn)錄因 子都能與G盒元件特異結(jié)合，激活光誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄(Foster et al. ， 1994)。
許多干旱脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)也受ABA的誘導(dǎo)。植物種子在發(fā)育或水分虧缺等 逆境中，其內(nèi)源ABA的含量大量增加(Bray et al. ， 1997)。分析發(fā)現(xiàn)這些基因的 啟動(dòng)子有保守的ABA應(yīng)答元件(ABRE， CACGTG),其中ACGT為核心序列，其保守序 列為PYCGTGGC。 ABRE作為順式作用元件參與ABA調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，與ABRE作用的反 式作用因子已被克隆，其結(jié)構(gòu)中含有保守的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，在亮氨酸拉鏈的鄰近 區(qū)域具有一個(gè)堿性區(qū)域，屬于轉(zhuǎn)錄因子bZIP家族成員(Guiltinan et al. ， 1990; Hobo et al.， 1999) 。 Choi (2000)報(bào)道bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABF/AREB能夠激活含有 ABRE元件的基因的表達(dá)(Choi et al. ， 2000; Fujita et al., 2005)。在擬南芥 的/6X7、 r必朋、raW《、ZM 、 A^7么JZW厶C力5"、 5Z/57等抗逆相關(guān)基因的 啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了ABRE順式作用元件(Kang et al. ， 2002; Kim et al. ， 2004)。 ABRE元件參與ABA調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，與ABRE相互作用的bZIP轉(zhuǎn)錄因子已被分離，如 煙草的TAF-1 (Oeda et al. ， 1991)、水稻的0SBZ8(Nakagawa et al. ， 1996b) 、 TRAB1 (Hobo et al. ， 1999; Kagaya et al. ， 2002)、擬南芥的ABF1-4 (Choi et al., 2000)、 玉米的ABP9 (王磊等，2002)、大麥的HvABI5和HvVPl等(Casaretto et al. ， 2003)， 其結(jié)構(gòu)中含有保守的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和堿性DNA結(jié)合域(Guiltinan et al.， 1990)。
Marc Jakoby等對(duì)擬南芥基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)了大量的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，其 數(shù)量是酵母、蠕蟲(chóng)和人的4倍多。根據(jù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)差異，可以將其劃分為 10個(gè)亞族A亞族，B亞族，C亞族，D亞族、E亞族、F亞族、G亞族、H亞族、I亞族、 S亞族，其中，A亞族包括13個(gè)成員，如ABF1、 ABF2/AREB1、 ABF3、 ABF4/AREB2、 GBF4、 ABI5、 AREB3、 DPBF2等(Jakoby et al., 2002; Satoh et al. ， 2004)。 Choi等首 次克隆到的擬南芥的ABF/AREB bZIP類轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)儆贏亞族，其成員分別為-ABF1、 ABF2 (AREB1) 、 ABF3、 ABF4 (AREB2) 。 ABF1主要參與低溫、ABA脅迫應(yīng)答 反應(yīng)，ABF3主要參與ABA、高鹽、低溫、熱、氧化脅迫應(yīng)答反應(yīng)，ABF2/AREB1、 ABF4/AREB2主要參與ABA、干旱、高鹽、熱、氧化脅迫應(yīng)答反應(yīng)(Choi et al., 2000; Uno， et al. ， 2000)。
綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物的逆境反應(yīng)，提高植物的抗逆性中起著至關(guān)重 要的作用(劉強(qiáng)等，2000; Yamaguchi-Shinozaki et al. ， 2002)。目前，利用抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因改良和提高擬南芥、煙草、水稻等植物的抗逆性，取得了很
大成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的耐逆性相關(guān)蛋白，名稱為GmAREBl，來(lái)源于大豆，是如下(a) 或(b)的蛋白質(zhì)
(a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列1由439個(gè)氨基酸殘基組成，是bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。自序列1 的氨基末端第355-405位氨基酸殘基是保守的bZIP結(jié)構(gòu)，自序列1的氨基末端第 357-360位氨基酸殘基為核定位序列。
所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的上述結(jié) 構(gòu)域外進(jìn)行取代和/或缺失和/或添加。
為了使(a)中的GmAREBl便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。
表l標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為5個(gè))RRRRR
Poly-His2-10 (通常為6個(gè))HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-mye10EQKLISEEDL
上述(b)中的GmAREBl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表 達(dá)得到。上述(b)中的GmAREBl的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2自5'端第20 至1336位堿基所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行 一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的 編碼序列得到。
所述植物耐逆性相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)或4)的DNA分子
1)其編碼序列是序列表中序列2自5'末端第20至1336位脫氧核糖核苷酸所
7示的DNA分子；
2) 其序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
3) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
4) 與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上伺源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2XSSC, 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由1406個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，自5，末端的第20至1336 位脫氧核糖核苷酸為6ia4i^"7的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，自5， 端的第20至22位脫氧核糖核苷酸為fia^iZ^的起始密碼子，自5，端的第1337至 1339位脫氧核糖核苷酸為fta4y2^7的終止密碼子。6k4A!fiW的表達(dá)受干旱、鹽、脫 落酸和低溫脅迫的誘導(dǎo)。
含有Ga4y^5J基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有ft/z^^"7基因的重組表達(dá)載體。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述 植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何 其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加 入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基 因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用fe^^5J構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增 強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素 啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使 用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增 強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密 碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn) 錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn) 行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因 (GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物 的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
所述重組表達(dá)載體具體可為將pBI121的5i^1和位點(diǎn)間的小片段取代為 序列表中序列2的自5'末端的第20-1336位脫氧核苷酸得到的35S-ft^7i!fiW。
所述重組表達(dá)載體具體可為將pBI121-rd29A的5izzal和Spel位點(diǎn)間的小片段 取代為序列表中序列2的自5'末端的第20-1336位脫氧核苷酸得到的 2劃-fia4朋^ ;所述pBI121-rd29A是用rd29A啟動(dòng)子取代pBI121的CaMV 35S啟動(dòng) 子得到的重組載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。
本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有&^ ￡57基因的重 組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子GmAREBl的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫 耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo) 等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化 的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、小麥、大豆、 擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪草、苜宿等。
所述植物耐逆性具體可為對(duì)非生物脅迫的耐逆性，如對(duì)鹽脅迫的耐逆性。
本研究以耐鹽性較強(qiáng)的大豆(67yc^e/^義L.)栽培品種鐵豐8號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料， 得到了抗逆相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子GmAREBl (67yci; e /ffa義ABA Responsive Element Binding)蛋白及其編碼基因，并將&^^5J基因?qū)霟煵?，顯著提高了植物的耐鹽 性。本發(fā)明的耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)植物的抗逆性，提高產(chǎn)量、 加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖l為Northern分析&z^^A 在干旱、鹽、酸和低溫脅迫處理下的表達(dá)特征 圖2為GmAREBl蛋白與ABRE的結(jié)合特異性檢測(cè)電泳圖 圖3為轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、大豆耐逆性相關(guān)蛋白GmAREBl編碼基因的篩選及其cDNA克隆
對(duì)生長(zhǎng)14天左右的大豆鐵豐8號(hào)(購(gòu)自英駿公司)幼苗進(jìn)行高鹽(200mMNaCl) 處理12小時(shí)，用Trizol提取大豆總RNA。應(yīng)用5， RACE試劑盒(5， MCE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL， CAT. NO. 18374-058)禾口3， RACE 試布J盒(3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit) ( GIBCOBRL， CAT. NO. 18373-019)獲得fe!/^五W基因的全長(zhǎng)序列。
用Trizol (invitrogen)提取大豆鐵豐8號(hào)幼苗的總RNA，用superscriptll (invitrogene)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得到cDNA。根據(jù)&^ ￡ /基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì) 引物P1和P2。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物 P1和P2的序列如下
PI: 5， -GGTCAAAAGATGAACTTCAG -3,，
P2: 5， -GGCTTCCTTCGTATAGATGTC-3'。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到分子量約為1. 3-1. 4kb左右的 條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該 回收片段與pGEM-T Easy (Promega)連接，參照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)pGEM-T Easy 載體上的氨卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該 重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動(dòng)子序列為引物對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié) 果表明擴(kuò)增到的6iz"A^"7基因的開(kāi)放閱讀框(0RF)為序列表中序列2的自5'末端第 20至1336位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是序列表中序列l(wèi)的蛋白質(zhì)。將含 有序列表中序列2的自5'末端第20至1336位脫氧核糖核苷酸的6k4^a^基因的 重組載體命名為pTE-fta47^W。
fta^五W基因的序列在Genabnk上進(jìn)行比對(duì)，該基因與擬南芥中bZIP類轉(zhuǎn)錄因 子具有較高同源性，而在大豆中未發(fā)現(xiàn)同源蛋白基因，證明fia47ffi^J基因是一個(gè)新 的基因。
實(shí)施例2、逆境脅迫處理下大豆"/a^^W基因的表達(dá)特征
將大豆鐵豐8號(hào)種子種在盆中，生長(zhǎng)2個(gè)星期后取幼苗進(jìn)行如下脅迫處理:l) 干旱處理:將大豆幼苗從土中取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上；2)鹽處理: 將大豆幼苗置于200mMNaCl溶液中；3)ABA處理將大豆幼苗置于200 y M的ABA 溶液中；4)冷處理將小麥幼苗置于4'C培養(yǎng)箱；光照培養(yǎng)，分別在上述各種處理
10后0、 0.5、 1、 3、 6、 12小時(shí)取樣，用液氮速凍，-8(TC保存?zhèn)溆谩?br> 分別將干旱處理、鹽處理、ABA處理和冷處理后O、 0.5、 1、 3、 6、 12小時(shí)的 樣品提取總RNA，以"/a4A^WDNA為探針(序列表中的序列1)，進(jìn)行Northern 分析。
探針標(biāo)記的具體步驟如下
探針標(biāo)記為隨機(jī)六聚體引物法，每1-2張膜加入探針DNA約 50-100ng (pTE-fia4/^5力和適量DNA分子量標(biāo)記，加水至14. 5 u 1 ， IO(TC煮沸變性 5min后立即置于冰浴中5min，瞬時(shí)離心，然后加入下列成分，終體積25ul，于
37'C反應(yīng)5h以上。
5 xOligo Buffer 5^1
Klenow Fragment (5U/|il) 0.5|il
Buffer 2.5ul
BSA (lOmg/ml) 1^1 a-32P-dCTP (lOmCi/ml) 附1ml 5 xOligo Buffer中含有
160^1 H20
250W 1M Tris-HCl
25 |il 1M MgCl2
5(xl 1M Mercaptoethanol
500^1 2M HEPES
20nl lOOmM dATP
20^1 lOOmMdGTP
20pl 100mMdTTP。
Northern blot分析結(jié)果見(jiàn)圖l。圖1中，A為干旱處理的樣本；B為脫落酸處 理的樣本；C為NaCl處理的樣本；D為冷處理的樣本。
結(jié)果表明在干旱脅迫10小時(shí)后6ia^f57基因表達(dá)達(dá)到高峰；在高鹽(200mM NaCl)脅迫10小時(shí)后6ia^fi^基因表達(dá)達(dá)到高峰。冷脅迫24小時(shí)后fe^ fi^基因 表達(dá)達(dá)到高峰，ABA (200uM)脅迫5小時(shí)后6k4A^W基因表達(dá)達(dá)到高峰。說(shuō)明該基 因受干旱、高鹽、冷脅迫和ABA誘導(dǎo)。
實(shí)施例3、凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)1、 fiffi^fi^基因的原核表達(dá)
將fiz^2g^/基因的全長(zhǎng)序列插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)中，由 于pGEX-4T-l的多克隆位點(diǎn)前面有GST(谷胱苷肽)基因，這樣GraAREBl與GST蛋白 就形成了融合蛋白，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體大腸桿菌BL21，通過(guò)向培養(yǎng)基中 添加誘導(dǎo)物IPTG誘導(dǎo)融合蛋白(GmAREBl-GST)的產(chǎn)生，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)融 合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
按照MicroSpin GST Purification Module Kit說(shuō)明書(shū)的步驟純化GmAREBl-GST
融合蛋白。
2、 ABRE探針的標(biāo)記
根據(jù)已知序列合成ABRE探針序列，ABRE探針序列如下 野生型探針正義鏈ABRE (+): GAAGTCCACGTGGAGGTGG 野生型探針?lè)戳x鏈ABRE (-): TCCCACCTCCACGTGGACT 突變型探針正義鏈mABRE (+): GAAGTAACATGTTCGGTGG 突變型探針?lè)戳x鏈mABRE (-): TCCCACCGAACATGTTACT
使用T4多聚核苷酸激酶(T4-Polynucleotide Kinase, PNK)對(duì)ABRE片段進(jìn) 行(Y—，)dATP標(biāo)記，標(biāo)記體系如下
H20 18.6 uL
10 X PNK buffer 2.5 uL
ABRE片段 1 uL
T4-PNK 1 uL
(Y—32P)dATP 2 uL
37。C標(biāo)記30分鐘，加入l uL 0.5M EDTA終止反應(yīng)，65。C10分鐘滅活酶，4°C
備用o
3、標(biāo)記的ABRE探針與純化的GmAREBl蛋白進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)
結(jié)合反應(yīng)體系如下
5 X binding buffer 4 uL
GmAREBl純化蛋白 10 uL
標(biāo)記的ABRE探針 2uL
50%甘油 2uL
H20 2 uL5 X binding buffer:
12.5 mM HEPES-KOH(pH 7,6)
250 mM KC1
2.5 mM DTT
2.5 mM EDTA
結(jié)合反應(yīng)在冰上進(jìn)行30分鐘，反應(yīng)的同時(shí)配好的SDS-PAGE膠200V進(jìn)行1小 時(shí)的預(yù)電泳，結(jié)合反應(yīng)后加入l uL上樣緩沖液(0.025%溴酚蘭)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，170V電泳1-2小時(shí)后卸下電泳板，將膠放到水中，在將膠上的水吸干后壓X 光片檢測(cè)GmAREBl蛋白與標(biāo)記的ABRE探針的結(jié)合特性。
分析結(jié)果見(jiàn)圖2，圖2中A為EB染色后的膠；B為Commassie Blue染色后的 膠。A中，l為野生型ABRE探針；2為野生型ABRE探針+ GmAREBl-GST融合蛋白； 3為突變型ABRE探針+ GmAREBl-GST融合蛋白；4為突變型ABRE探針+GST蛋白；B 中l(wèi)，為野生型ABRE探針；2，為野生型ABRE探針+ GmAREBl-GST融合蛋白；3， 為突變型ABRE探針+ GmAREBl-GST融合蛋白；4，為突變型ABRE探針+GST蛋白。
結(jié)果顯示只有野生型ABRE和純化GmAREBl蛋白結(jié)合，而突變ABRE不與純化 GmAREBl蛋白結(jié)合，結(jié)果證明純化GmAREBl蛋白與ABRE具有結(jié)合特異性，6k^￡W 屬于bZIP類轉(zhuǎn)錄因子。
實(shí)施例4、用fia^^fi^基因培育耐鹽脅迫植物
1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
1) c 551-fia^^5J重組表達(dá)載體的構(gòu)建
以大豆鐵豐8號(hào)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有5inal和X6al接 頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后S/Ml和^ al雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶 切產(chǎn)物正向插入載體pBI121的CaMV 35S啟動(dòng)子之后的和酶切位點(diǎn)之間， 得到重組載體J55"-fiffi^fi^ 。
引物序列如下
5， [Smal] 5， -GGGGCCCGGGGGTCAAAAGATGAACTTCAG-3,
3， [Xbal] 5, -CCCCGGGTCTAGAGGCTTCCTTCGTATAGATGTCA-3，
2) 2劃-6k^fA 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
以大豆鐵豐8號(hào)的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用含有5i/ al和5^el接 頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后5^al和&el雙酶切PCR產(chǎn)物，回收，將酶 切產(chǎn)物正向插入載體pBI121-rd29A中的rd29A啟動(dòng)子之后的和Spel酶切位
13點(diǎn)之間，得到重組載體2劃-其中，pBI121-rd29A是用rd29A啟動(dòng)子取代 pBI121的CaMV 35S啟動(dòng)子得到的重組載體。 引物序列如下
5' [Smal] 5' - GGGGCCCGGGGGTCAAAAGATGMCTTCAG-3'
3， [Spel] 5， -CCCTCGCACTAGTGGCTTCCTTCGTATAGATGTC-3，
2、 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和鑒定 1)轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
將步驟1構(gòu)建的重組表達(dá)載體^劃-6ia^^厶J55HP/^725^7分別用凍融法轉(zhuǎn)化根 癌農(nóng)桿菌EHA105，再用葉盤(pán)法分別將整合有2劃-fia^fi^7和J5^-fia^AW的根癌農(nóng)桿 菌EHA105轉(zhuǎn)化煙草W38，用含IOO mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行2輪篩選，每輪篩選 10-15天，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。將篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株用PCR做進(jìn)一步鑒定 篩選，PCR所用的一對(duì)引物為P3和P4。
P3 (上游引物):5， - GGGGGTCAAAAGATGAACTTCAG -3，，
P4 (下游引物):5， -GAGGCTTCCTTCGTATAGATGTCA-3，。
對(duì)2劃-fiffi4i ￡ 7、 6in^ 朋7轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR 擴(kuò)增可獲得1.3Kb左右條帶，結(jié)果獲得轉(zhuǎn)2創(chuàng)-6i^/^iW煙草、轉(zhuǎn)35S-6iH^EW煙草各 15株。
同時(shí)將pBI121空載體導(dǎo)入煙草W38，方法同上，作為對(duì)照，獲得15個(gè)株系的轉(zhuǎn)
空載體煙草。
篩選獲得的轉(zhuǎn)基因煙草用T。代表示；
3、 轉(zhuǎn)fia^fi^基因植株耐鹽性鑒定
將15株T。代轉(zhuǎn)2劃-^^^W煙草植株、15株T。代轉(zhuǎn)355W7/z^2fi^煙草植株、 15株T。代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的3周齡苗的根系分別移入含有200 mMNaCl的培養(yǎng)基 中進(jìn)行鹽脅迫處理35天。觀察表型并拍照同時(shí)進(jìn)行存活率統(tǒng)計(jì)和基因表達(dá)量檢測(cè)。
結(jié)果表明，鹽脅迫處理35天后，15株2似-6k4i^^ 轉(zhuǎn)基因植株中有l(wèi)l株在鹽 脅迫條件下生長(zhǎng)正常，根系發(fā)達(dá)，葉片顏色深綠；15株355W^^^57轉(zhuǎn)基因植株中 有10株在鹽脅迫條件下生長(zhǎng)正常，根系發(fā)達(dá)，葉片顏色深綠；所有的15株空載體 轉(zhuǎn)基因植株葉片均失綠、發(fā)白，由于鹽離子毒害導(dǎo)致植株死亡。
轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性鑒定結(jié)果證明fia^^^J基因可以提高植物的耐鹽性。
圖3A顯示的是1株2劃-6k4A^A 轉(zhuǎn)基因植株、1株空載體轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫處 理35天的照片；圖3B顯示的是l株J55W /a4v^"J轉(zhuǎn)基因植株、1株空載體轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫處理35天的照片；圖3C和圖3D是空載體轉(zhuǎn)基因植株不進(jìn)行鹽脅迫處 理，生長(zhǎng)35天的照片。序列表
〈110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
〈120〉 一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
<130〉 CGG應(yīng)Y81329
〈歸 2
〈210〉 1 <211> 439 〈212〉 PRT
〈213〉 大豆屬大豆(67yc&e /war ( L )) <400> 1
Met Asn Phe Arg Asn Phe Gly Val Gly Asp Asn His Pro Thr Trp Asp
15 10 15
Ala Met His Gly Lys Thr Pro Ala Asn Asn Asn Val Thr Gly Thr Thr
20 25 30
Leu Leu Arg Gin Pro Ser Thr lie Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe
35 40 45
Gin Ser Thr Met Gly Gly lie Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met
50 55 60
Asp Glu Leu Leu Lys Asn lie Trp Thr Ala Gly Glu Thr Gin Ala Met 65 70 75 80
Val Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Val Glu Gly His Asn Asn
85 90 95
Asn Ser Asn Asn Asn Pro lie Asn Cys Ser Gly Leu Gin Arg Gin Gly
100 105 110
Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gin Lys Thr Val Glu Glu Val115
Asp Leu lie Lys
Trp Arg 130
Ser Gly Gly Asn Gly 145
Gly Glu Met Thr
120
Ser Gly Gly Glu
Glu 135
Ser Ser Asn Pro
125
Asn Asp Gly Gly
Gly 150
Glu Glu Phe Leu
Ala 140
Met Gin Ala Thr
Glu Asp Trp Phe
Val
Leu 165
Gin Gin Gin Gin
Gin 155
Arg Ala Gly Val
Pro 180
Asp Phe Pro Arg
Val 170
Gly Lys Pro Asn
Gly 195
Phe Gin Gin Pro
Asn 185
Lys His Asn Asn
Val 175 Asn
Leu 160 Arg
Gly
Leu Gly 210
Glu Asn Thr Asn Leu 225
Asn Ser Asn His
Pro 200
Arg Ser Asn Gly
Asp 190
Ser Leu Leu
Asn 215
Ser Lys Gin Gin
Thr 205
Gly Asn Leu Gly
Val 230
Gin Arg Gin Ala
Asn 220
Pro Pro Leu Ser
Ser 245
Pro Leu Phe Pro
Pro 235
His Gin His Gin
Gin His Pro Pro 260
Thr His Leu Leu
Gin 250
Pro Ala Asn Val
Gly Ala Pro 275 Arg
Lys 265
Asn Ala His Gin
His 255 Phe
Leu 240 Gin
Ala
Gly
Gly Arg 290
Val Gly Met Val 305
Ser Lys lie Ser
Gly Gly
Asn 280
Gly Val Ala Ala
Thr 270
Ala Ser Pro
Leu lie 295
Ala Thr Ala Asn
His 285
His Ser Met Asn
Leu 310
Asp Val lie Thr
Glu 300
Thr Ala Ser Pro
Pro 325
Ser Pro His Tyr
Asn Ser Pro lie 340
Ser Ala lie Glu Lys Val Val 355
Arg 330 lie
Val 315
Ser Asn Asn Asn
Asn
Glu 360
Val 345
Arg Arg Gin
Arg Arg
Gly
Arg 365
Val 335 Lys
Ser 320 Asp
Phe
Arg 350
Met lie LysAsn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gin Ala Tyr Thr
370 375 380
Phe Glu Leu Glu Ala Glu VaJ Ala Lys Leu Lys Glu Leu Asn Arg Glu 385 390 395 400
Leu Gin Arg Lys Gin Glu Glu lie Met Glu Met Lys Lys Asn Lys Asp
405 410 415
Leu Asp Pro Ala Cys Arg Pro Arg lie Ser Lys lie Gin Cys Leu Arg
420 425 430
Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp 435
〈210〉 2
〈211〉 1406
〈212〉 DNA
<213> 大豆屬大豆(67yc&e鵬7 ( L.))
〈400〉 2
ggggcccgggtgaacttcaggaactttggtgttggagata3cceicccc3c60
ttgggatgccatgcatgggaagacaccagcgttactggcactactctgct120
gagacagccctcaacaatatactcattgacatttgatgagtttcagagcaCC3tgggtgg180
gattggga站gatttcgggtccatgaacatggatgaactcttgaagaacatatggacagc240
tggag柳ctcaagccatggtgttttcagccgttgccgccgc3gg鄉(xiāng)3gtagaaggcca300
accctattaactgtagtggtttgca^ga_caaggctcttt360
ga<C3ttgcc33ggactctt3gtcagaaaacagttgaggaggtttggagggacttgeitcaa420
卿肌gtggtggtgaggccaacgatggtggaagtggtggcaatggtggctcatcaaatcc480
tcaaatgcaagcaacattgggagaaatgacattggaggagtttttggtgagagctggtgt540
tgtgag卿agatgttccccaacaacaacagiaatggagiaaatggatggtt600
tggtgactttcctagaccaaaacataacaacactagcctacttcttgggtttcaeicaacc660
aaatagaagtaatgggaatggg組Ugggtgagaacactaacttagtttcaaaacaaca720
acctcctcctttatcattaaactcaaaccactctcaaaga780
acaccaacaaca_tcc3cca_ccactttttccaaagccagcaaatgtaacttttgctggtgc840tcctacgcat ttgttgaaca atgctcatca acatgctagc cctggcagaa ggggagggtt 900
gattggagtt gctgctgagc attcaatgaa tgttggaatg gttggtttag ccacagctaa %0
tgtcacagct tctccctcaa gtaaaatatc accagatgta attacaeigga gtaataataa 1020
tgttgataac tctccaatat caccacatta tgtaatcaac aggggaagga aattcagtgc 1080
catagagaaa gtggttgaga ggagacaaag gagaatgatt aaaaatagag aatcagcagc 1140
gagatcaagg gctcgtaagc aggcctacac tttcgaacta gaagctgaag ttgcaaaact 1200
taaggaatta aacagagaat tacaaagaaa acaggaagaa 3tcatggaaa tgaagaaaaa 1260
taaggatttg gaccctgcat gcagaccaag gataagtaaa atacaatgct tgagaaggac 1320
acttactgga ccatggtaga ttatgtgaat gtgagtcatt gtttcaaagt gacatctata 1380
cgaaggaagc ctctagaccc ggggaa 140權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的下述bZIP結(jié)構(gòu)域和核定位序列外進(jìn)行 取代和/或缺失和/或添加所述bZIP結(jié)構(gòu)域?yàn)樽孕蛄?的氨基末端第355-405位 氨基酸殘基，所述核定位序列為自序列1的氨基末端第357-360位氨基酸殘基。
3、 權(quán)利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因?yàn)槿缦耹)或 2)或3)或4)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列2自5'末端第20-1336位脫氧核糖核苷酸所示 的DNA分子；2) 其序列是序列表中序列2所示的DNA分子；3) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4) 與l)或2)限定的DNA序列具有9(^以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。
5、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)盒或重組表達(dá)載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為 35S-fi^處B7或2劃-fta4朋別；所述35S-6^7^W是將pBI121的和JZ aI位點(diǎn) 間的小片段取代為序列表中序列2的自5'末端的第20-1336位脫氧核苷酸得到的; 所述2劃-6ia^^"J是將pBI121-rd29A的5"/z al和^; el位點(diǎn)間的小片段取代為序列 表中序列2的自5，末端的第20-1336位脫氧核苷酸得到的；所述pBI121-rd29A 是用rd29A啟動(dòng)子取代PBI121的CaMV 35S啟動(dòng)子得到的重組載體。
7、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的細(xì)胞系或重組菌。
8、 一種培育耐逆植物的方法，是將權(quán)利要求3或4所述基因?qū)胫参锛?xì)胞中， 得到耐逆植物。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò) 權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。
10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述耐逆植物是耐鹽植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該植物耐逆性相關(guān)蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)的編碼基因。將該植物耐逆性相關(guān)蛋白的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物品種。本發(fā)明對(duì)改良、增強(qiáng)植物的抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101591383SQ20081011301
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者徐兆師, 李連城, 明 陳, 馬有志, 高世慶 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所