專利名稱：：一種檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因a719g多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒、方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因型檢測試劑盒、方法和用途。更具體的，本發(fā)明涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，提供一種分析編碼巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒、方法和用途。
背景技術(shù)：
：嘌呤類藥物，包括6-巰基嘌呤(6-MP)，6-巰代鳥嘌呤(6-TG)和巰唑嘌呤(AZA)是臨床常用的腫瘤化療藥物，它們通過干擾體內(nèi)的核酸代謝，包括核酸的從頭合成和補(bǔ)救合成途徑發(fā)揮作用。嘌呤類藥物是無內(nèi)在生物活性的藥物，必須通過體內(nèi)一系列代謝后才能發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。研究表明，嘌呤類藥物的療效和巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(thi叩urinemethyltransferase,TPMT)活性密切相關(guān)，臨床研究表明，6-MP，6-TG以及AZA的臨床療效及不良反應(yīng)和TPMT活性相關(guān)。TPMT活性高的個體，用藥后生成活性代謝產(chǎn)物一巰基鳥嘌呤磷酸鹽(TGNs)的濃度低，因此疾病的復(fù)發(fā)率高；而對于TPMT缺陷的個體，醫(yī)用常規(guī)劑量的嘌呤類藥物也會導(dǎo)致體內(nèi)巰基鳥嘌呤磷酸鹽的積累，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用如嚴(yán)重骨髓抑制和肝損害等，最終導(dǎo)致治療的被迫中斷，造成治療的失敗(CoulthardSA，HowellC,RobsonJ,etal.Blood,1998,92:2856-2862;RellingMV,HancockML,BoyettJM，etal.Blood,1999,93:2817-2823)。人類TPMT基因總長為3.4kb，編碼序列總長2.7kb，開放閱讀框架含735個堿基。編碼的TPMT的分子量大約為30000。由245個氨基酸殘基組成。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，TPMT基因有3個重要的位點(diǎn),分別是核苷酸序列中第238位點(diǎn)、第460位點(diǎn)和第719位點(diǎn)。當(dāng)三個位點(diǎn)發(fā)生突變，即第238位的鳥嘌呤(G)—胞嘧啶(C)，結(jié)果使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)—Pro(脯氨酸)，第460位的鳥嘌呤(G)—腺嘌呤(A)，使得氨基酸序列第154位的Ala(丙氨酸)—Thr(蘇氨酸)，第719位的腺嘌呤(A)—鳥嘌呤(G)，使第240位的Tyr(酪氨酸)—Cys(半胱氨酸)。突變誘導(dǎo)的TPMT酶活性的減低或喪失，導(dǎo)致在使用嘌呤類藥物時形成高濃度的TGNs,引起明顯的造血組織細(xì)胞毒性，產(chǎn)生嚴(yán)重后果，甚至引起死亡(TaiHL，KrynetskiEY,YatesCR,etal.AmJHumGenet,1996,58:694-702;KrynetskiEY,SchuetzJD,GalpinAJ,etal,ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:949)。研究發(fā)現(xiàn)，TPMT的基因型和其酶活性之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，根據(jù)TPMT基因多態(tài)性和酶活性的關(guān)系，可以通過檢測患者TPMT的基因型，推測患者體內(nèi)TPMT酶活性的高低，預(yù)測不同患者對于嘌呤類藥物的療效和副作用，為醫(yī)生提供用藥時的參考。根據(jù)國內(nèi)外的文獻(xiàn)報道，檢測TPMT基因多態(tài)性的方法主要有熒光定量PCR方法、等位基因特異性PCR(allelespecificPCR)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、變性高效液相色譜分析(DHPLC)、SNaPshot定點(diǎn)序列分析檢測以及基因序列測定等分析方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定可靠的高通量的檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒、方法和用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案應(yīng)用巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物和探針，對樣本DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同時進(jìn)行熒光標(biāo)記探針熒光信號的掃描判定基因型的一種檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒，該試劑盒包含檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)的基因特異性引物和探針。其中，檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因的正向引物為5'-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGATTT-3;反向引物為5'-CCTGATGTCATTCTTCATAGTATTTTAACA-3'。檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)的野生型探針為VIC-TGTAAGTAGATATAACTTTTC-MGB;突變型探針為FAM-TAAGTAGACATAACTTTTCA-MGB。本發(fā)明提供的試劑盒，還可以含有PCR反應(yīng)混合液和TaqDNA聚合酶等PCR應(yīng)用試劑。其中，PCR反應(yīng)混合液含有100mMTris-HCl、100mMKC1、5.0uMMgCl2、0.4mMdATP、0.4mMdCTP、0.4mMdGTP、0.4mMdTTP;TaqDNA聚合酶的含量為1-10U/ul，優(yōu)選5U/ul。本發(fā)明提供的試劑盒，還可以含有巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)的野生型和突變型的陽性對照。陽性對照選自基因組DNA、RNA或者克隆到載體上的DNA片段，其中載體為質(zhì)粒載體。同時，本發(fā)明還提供應(yīng)用檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)的方法。其中，檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)的基因擴(kuò)增程序?yàn)?5。C預(yù)變性10分鐘；95。C變性15秒，58'C退火15秒，60'C延伸45秒，45個循環(huán)。同時，本發(fā)明又提供檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒在預(yù)測嘌呤類藥物的療效和副作用中的用途。其中，嘌呤類藥物是6-巰基嘌呤、6-巰代鳥嘌呤或巰挫嘌呤。具體的，當(dāng)巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型為野生型，酶活性不受影響，可以使用常規(guī)劑量的嘌呤類藥物?；蛐蜑榧兒贤蛔冃?，會引起TPMT酶活性的喪失，如果用常規(guī)劑量的的藥物會引起嚴(yán)重的副作用，因而建議不使用此類藥物治療。雜合的基因型會引起酶活性的降低，建議降低藥物的劑量。本發(fā)明檢測樣本基因型的步驟為1.樣本處理2.樣本如果為DNA樣本，則需要測定樣本的濃度，并將樣本濃度調(diào)整至合適的范圍。如果樣本為RNA則需要轉(zhuǎn)錄成為cDNA。3.配置PCR反應(yīng)混合物PCR反應(yīng)混合液2.5Ul;引物+探針lul;H20:6.5ul;總計10Ul。4.TPMT基因片段的擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序如下95'C預(yù)變性10分鐘；95'C變性15秒，58'C退火15秒，60'C延伸45秒，45個循環(huán)。5.探針的熒光掃描在ABI7900儀器或者類似的儀器上掃描熒光類型，使用SDS軟件分析掃描結(jié)果。6.樣本基因型判定人類細(xì)胞中的染色體成對存在，在成對的染色體中，每一條染色體的基因型可能相同或者不同。根據(jù)這種情況，每一種基因型又可分為純合野生型，雜合型和純合突變型。當(dāng)TPMT719位點(diǎn)的兩條染色體均為A時，基因型為野生型；當(dāng)TPMT719位點(diǎn)的一條染色體為G,—條染色體為A時，基因型為雜合型；當(dāng)TPMT719位點(diǎn)的兩條染色體均為G時，基因型為純合突變型。7.待檢樣本酶活性預(yù)測以及嘌呤類藥物療效預(yù)測野生基因型，酶活性不受影響，可以使用常規(guī)劑量的嘌呤類藥物?；蛐蜑榧兒贤蛔冃停瑫餞PMT酶活性的喪失，如果用常規(guī)劑量的的藥物會引起嚴(yán)重的副作用，因5而建議不使用此類藥物治療。雜合的基因型會引起酶活性的降低，建議降低藥物的劑量。本發(fā)明的生物樣品選自DNA樣本，RNA樣本以及人工合成的寡核苷酸樣本。本發(fā)明所述試劑盒除了包含測定上述多態(tài)性位點(diǎn)所需要的特定引物之外，還包含運(yùn)用PCR擴(kuò)增而進(jìn)行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明提供的試劑盒可以具體地含有1、PCR反應(yīng)試劑，具體包括(1)引物，包括針對巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的正向引物和反向引物，它們能擴(kuò)增含有巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因特定突變位點(diǎn)的基因片斷；(2)2xPCR反應(yīng)混合液l.Oml[lOOmMTris-HCl，100mMKCl,pH8.3(20。C)];5.0uMMgCl2;各0.4mMdATP，dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸水配制，pH7.0;(3)TaqDNA聚合酶(5U/ul);Taq酶保存緩沖液20mMTris-HCl(pH8.0)，100mMKC1，O響lmMEDTA，lmMDTT，0.5%NP40，0.5%(v/v)，Tween20，50%甘油；(4)dNTP(5)Mg2+(6)PCR用水滅菌的雙蒸水或者注射用水。2、特異性的熒光標(biāo)記的探針探針5'端的標(biāo)記熒光基團(tuán)可以是FAM、ROX、TET、HEX、TAMRA、CY3、CY5、JOE、Texasred等中間的一種，3'端的標(biāo)記基團(tuán)可以是TAMRA，NFQ中的一種。3、標(biāo)準(zhǔn)品，包括陽性對照，即含有TPMT基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒DNA和突變型質(zhì)粒DNA。陰性對照經(jīng)DNAaseI處理的雙蒸水。本發(fā)明提供的利用Taqman實(shí)時定量PCR技術(shù)的基因型檢測試劑盒，使PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率大幅度提高，2ng的PCR模板在反應(yīng)結(jié)束時能夠得到約2ug的PCR產(chǎn)物，完全能夠滿足檢測的需要。我們根據(jù)TPMT基因的具體情況，設(shè)計了引物，并且經(jīng)過摸索，檢測每個樣本可以節(jié)省3個小時的時間。在本發(fā)明中，我們構(gòu)建了含有TPMTA719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的陽性對照質(zhì)粒。對于A719G位點(diǎn)堿基為A(野生型)的基因片段，我們利用A719G特異性引物，擴(kuò)增得到A719G位點(diǎn)堿基為A(野生型)的基因片段，經(jīng)過基因序列測定方法確定擴(kuò)增片段的基因序列以后，連接入T載體中，經(jīng)過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ct，篩選得到陽性克隆，提取質(zhì)粒后，通過酶切、PCR以及序列測定的方式驗(yàn)證均提示得到正確的陽性質(zhì)粒。將此陽性克隆大規(guī)模培養(yǎng)，從中提取質(zhì)粒并進(jìn)行純化，測定濃度以及純度后低溫保存，即得到試劑盒使用的陽性對照質(zhì)粒。對于A719G位點(diǎn)堿基為G(突變型)的基因片段，因?yàn)橥蛔冃驮谌巳褐姓嫉谋壤^小，從基因組中克隆基因需要檢測很大的樣本量，因此釆用人工合成基因的方式。根據(jù)基因序列，人工合成了含有TPMT719G位點(diǎn)的基因序列，克隆到載體質(zhì)粒pUC57中，經(jīng)序列測定驗(yàn)證后得到陽性對質(zhì)粒。野生基因型，酶活性不受影響，可以使用常規(guī)劑量的嘌呤類藥物?；蛐蜑榧兒贤蛔冃停瑫餞PMT酶活性的喪失，如果用常規(guī)劑量的的藥物會引起嚴(yán)重的副作用，因而建議不使用此類藥物治療。雜合的基因型會引起酶活性的降低，建議降低藥物的劑量。本發(fā)明的有益效果是-(1)本發(fā)明特別針對巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶TPMT的A719G(Tyr240Cys)多態(tài)性位點(diǎn)基因型設(shè)計特定PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增效率高、特異性好、省時，有更好的使用價值。(2)本發(fā)明特別針對巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶TPMT的A719G(Tyr240Cys)多態(tài)性位點(diǎn)基因型設(shè)計特定熒光標(biāo)記的探針，特異性高，假陽性率低。(3)在本發(fā)明中，我們將檢測得到的樣本基因型經(jīng)過序列測定驗(yàn)證以后，將A719G位點(diǎn)堿基為A(野生型)的基因片段擴(kuò)增出來，克隆到載體中，獲得含有719A野生型序列的陽性對照質(zhì)粒；另外，人工合成了含有TPMT719G位點(diǎn)的基因序列，將上述含有719G的突變型片段構(gòu)建成含有719G突變型序列的陽性對照質(zhì)粒，并且再次經(jīng)過序列測定確證。這樣的陽性對照品序列明確，可以無限制的擴(kuò)增，獲得大量的陽性對照，并且更容易控制對照品的質(zhì)量比如濃度和純度。方便獲得，易于大批量生產(chǎn)，又便于控制質(zhì)(4)本發(fā)明操作方法簡單，熟悉一般分子生物學(xué)操作的技術(shù)人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可完成整個過程。檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大規(guī)模高通量的樣本檢測需要。(5)本發(fā)明根據(jù)TPMT的基因多態(tài)性結(jié)果，結(jié)合個體的其他生物學(xué)指標(biāo)對于嘌呤類藥物的療效和副作用進(jìn)行預(yù)測。本發(fā)明提供的檢測結(jié)果使醫(yī)生減少了臨床選擇嘌呤類藥物的盲目性，在多態(tài)性基因型分析的基礎(chǔ)上可以預(yù)測使用嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，以進(jìn)行個體化醫(yī)療，減少毒副作用，減少醫(yī)療成本。圖1是TPMTA719G野生型陽性對照質(zhì)粒構(gòu)建過程中的樣品PCR結(jié)果M:100bpLadder;1:樣品1PCR結(jié)果；2:樣品2PCR結(jié)果；3:樣品3PCR結(jié)果；4:樣品4PCR結(jié)果圖2是20個患者A719G片段PCR擴(kuò)增后熒光掃描的結(jié)果。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1下面以TPMTA719G野生型陽性對照質(zhì)粒為實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)闡述。1.引物和模板基因片段擴(kuò)增使用下列引物-TPMT719For:5，-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGATTT-3;TPMT719Back:5，-CCTGATGTCATTCTTCATAGTATTTTAACA-3'。模板采用人類基因組DNA(編號AI011611，濃度15ng1)2.基因片段擴(kuò)增配置PCR擴(kuò)增混合物模板(1515ng4il):3pl;10XPCRbuffer(-MgCl2):1^1;50mMMgCl2:0.3|il;lOmMdNTP:0.2nl;2(HlM引物混合物0.2^1;5，Taq酶0.05^il;無菌雙蒸水5.25nhTotal:IOjj!。PCR擴(kuò)增條件為94°C3分鐘；94°C30秒鐘，63°C45秒鐘，72°C30秒鐘，35個循環(huán)；72°C7分鐘。PCR擴(kuò)增后得到大小為240bp的條帶，結(jié)果見附圖1。3.PCR產(chǎn)物純化1).0尺產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察條帶位置，切膠稱重。2).采用德國MN公司NucleospinExtractII膠純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，最終用40^1洗提液洗脫。4.AT克隆采用Promega公司的pGEM—Teasykit試劑盒進(jìn)行AT克隆，按照說明書操作。配置連接體系Teasyvector-ljil;2X連接緩沖液5^1;T4DNA連接酶純化后的PCR產(chǎn)物1^1;無菌雙蒸水2pl。4'C連接過夜。5.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1).取5fjl連接產(chǎn)物，加入100|ilDH5a感受態(tài)細(xì)菌，輕輕混勻冰上靜置20分鐘。2).將混合物在42。C循環(huán)水浴熱休克90秒，置于冰上2分鐘。3).混合物中加入lml37。C預(yù)溫的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩(180rpm)培養(yǎng)1小時。4).將200pl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于含有100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板(含lmol/1IPTG知1，20mg/mlX-gal40nl)上，37。C倒置培養(yǎng)10h。5).從LB培養(yǎng)板上挑取白色菌落，接種于2ml含100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37。C振蕩(250rpm)培養(yǎng)過夜。6.陽性質(zhì)粒的鑒定1).陽性質(zhì)粒的酶切鑒定取lml菌液，堿裂解法小提質(zhì)粒，加20W無菌雙蒸水溶解。用EcoRI進(jìn)行酶切鑒定，配制酶切體系10xbufferH:1)^1;￡coRI(12U/|al):0.3|ll;質(zhì)粒無菌雙蒸水7.7pl。37"C水浴酶切2小時，酶切可以得到200bp大小的酶切片段，證明序列正確。2).陽性質(zhì)粒序列測定由步驟1篩選得到的陽性克隆3送交北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行基因序列測定，測序結(jié)果顯示，陽性克隆序列和已知TPMT719野生型序列完全一致，證明陽性質(zhì)粒序列正確。7.陽性質(zhì)粒大規(guī)模培養(yǎng)和純化將篩選得到的陽性克隆接種1LLB培養(yǎng)基中，37'C搖床振蕩培養(yǎng)過夜后，采用堿裂解法純化質(zhì)粒。低溫(-2(TC)凍存。9實(shí)施例2下面以白血病患者基因的TPMT基因型檢測過程為實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。我們應(yīng)用本試劑盒檢測20個患者的巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因型，流程如下1.樣本處理由于樣木為基因組DNA，采用紫外分光光度計檢測樣本的DNA濃度，并將DNA濃度稀釋至30-100ng/ml2.配置A719G擴(kuò)增混合液PCR反應(yīng)混合液2.5ul;A719G引物+探針1ul;H20:6.5ul;總計10ul。3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增特異性的TPMT基因片段-1)將配制好的PCR反應(yīng)混合物加入PCR反應(yīng)管中，其中719特異性的混合物加入反應(yīng)管。2)TPMT基因片段擴(kuò)增按照下列條件擴(kuò)增TPMT基因片段95。C預(yù)變性10分鐘；95。C變性15秒，58。C退火15秒，60。C延伸45秒，45個循環(huán)。4.PCR反應(yīng)結(jié)果的熒光掃描將擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管放入ABI7900HT熒光定量PCR中，使用SDS軟件掃描PCR反應(yīng)結(jié)果。掃描結(jié)果見附圖2。5.樣本基因型的判定根據(jù)熒光掃描結(jié)果進(jìn)行樣本基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)熒光掃描結(jié)果分別判定TPMTA719G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。根據(jù)基因型判定結(jié)果，TPMT酶活性。根據(jù)以上基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)，可以確定20個樣本的基因型，各樣本基因型見表l:6.根據(jù)樣本基因型進(jìn)行藥物療效和副作用預(yù)測。根據(jù)上述檢測結(jié)果，第1、5、11、16、19號樣本為純合突變，將會導(dǎo)致巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性的缺失。該酶活性缺失將會導(dǎo)致嘌呤類藥物代謝能力大幅度降低，如使用正常劑量的嘌呤類藥物可能會引起嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，建議該患者改用其它類型的治療藥物。3、6、8、10、14、20號患者為雜合型，巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性降低，建議患者降低嘌呤類藥物用量。表1.20個待檢樣本的基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><110〉北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司深圳奧薩醫(yī)藥有限公司〈120〉一種檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A7I9G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒、方法和<160〉4〈170>Patentlnversion3.3〈210>1<211>25〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉1cctcaaaaacatgtcagtgtgattt25<210>2<211>30〈212>腿〈213〉人工合成〈400>2cctgatgtcattcttcatagtattttaaca30〈210>3〈211〉21〈212〉腿〈213〉人工合成<400〉3tgtaagtagatataacttttc21〈210>4〈211>20〈212〉DNA〈213>人工合成<400>4taagtagacataacttttca201權(quán)利要求1.一種熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包含檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物、探針。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)的正向引物為5,-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGATTT-3';反向引物為5'-CCTGATGTCATTCTTCATAGTATTTTAACA-3，。3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)的野生型探針為VIC-TGTAAGTAGATATAACTTTTC-MGB;突變型探ft為FAM-TAAGTAGACATAACTTTTCA-MGB。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，含有PCR反應(yīng)混合液和TaqDNA聚合酶。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)混合液含有100mMTris-HCl、100mMKCl、5.0uMMgCl2、0.4mMdATP、0.4mMdCTP、0.4mMdGTP、0.4mMdTTP。6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的TaqDNA聚合酶的含量為1-10U/ul，優(yōu)選5U/ul。7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，含有巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)野生型和突變型的陽性對照。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照選自基因組DNA、RNA或者克隆到載體上的DNA片段。9.應(yīng)用權(quán)利要求1-8所述的試劑盒檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的方法。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)的基因擴(kuò)增程序?yàn)?5'C預(yù)變性10分鐘；95'C變性15秒，58。C退火15秒，60'C延伸45秒，45個循環(huán)。11.如權(quán)利要求1-8所述的試劑盒在預(yù)測嘌呤類藥物的療效或副作用中的用途。12.如權(quán)利要求ll所述的用途，其特征在于所述的嘌呤類藥物是6-巰基嘌呤、6-巰代鳥嘌呤或巰唑嘌呤。全文摘要本發(fā)明屬于基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因A719G多態(tài)性位點(diǎn)基因型的試劑盒、方法、用途。本發(fā)明采用熒光定量PCR的單核苷酸多態(tài)性基因分型方法，該方法應(yīng)用巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物和熒光標(biāo)記的探針對樣本DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，隨后進(jìn)行熒光掃描，根據(jù)熒光類型進(jìn)行基因型的分類，其中引物包含檢測巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶檢測A719G多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物。探針包括巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶A719G多態(tài)性位點(diǎn)的野生型和突變型特異性探針。文檔編號C12Q1/68GK101591697SQ20081011308公開日2009年12月2日申請日期2008年5月27日優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日發(fā)明者多于,張彥明,徐希平,燕王申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫(yī)藥有限公司