專利名稱：針對A族鏈球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對A族鏈球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基 酸的單克隆抗體(以下簡稱McAb96-118)，屬于單克隆抗體技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
A族鏈球菌(GAS)即化膿性鏈球菌，是一種常見的病原菌，它可 以引起人類的多種感染性疾病，包括扁桃腺炎、咽炎、中耳炎等的淺 表感染，及壞死性筋膜炎等具有高度侵襲及潛在致死性的感染，以及 兒童猩紅熱等中毒性疾病，更為嚴(yán)重的是可導(dǎo)致感染后的超敏反應(yīng)性 疾病，如風(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎等，臨床上存在著反復(fù)感染及難以 治愈等問題，因?yàn)槟壳吧袩o有效的疫苗予以預(yù)防，人類對其致病機(jī)制 及疫苗的研究從未停止過。FbaA蛋白是一種表達(dá)于GAS表面的新發(fā)現(xiàn) 蛋白，至少存在于18個(gè)血清型中。研究發(fā)現(xiàn)FbaA蛋白有抗吞噬及通 過結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白FH、 FH-L以促進(jìn)GAS進(jìn)入上皮細(xì)胞的作用(參見 Infect Imnmn. 2003， 71: 7119-7128.)。本申請發(fā)明人的前期工作顯 示FbaA具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性(參見中國免疫學(xué)雜志， 2007， 23 (9): 835-838，中華傳染病學(xué)雜志，2008， 26 (3): 146-150)， 有望成為疫苗的候選蛋白。
經(jīng)國內(nèi)外檢索，尚未發(fā)現(xiàn)以A族鏈球菌表面蛋白FbaA為抗原制備 單克隆抗體的相關(guān)文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為尋求新型GAS疫苗而開創(chuàng)新思路 的針對A族鏈球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的單克隆抗體。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案 本發(fā)明所述單克隆抗體是由以FbaA蛋白為免疫原免疫小鼠制備
的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生；
所述單克隆抗體的類型為IgGl;
所述第96-118位氨基酸的基因的堿基序列為
acg tat aaa caa犯a att aaa act gca cca gac犯ei gat aag eta tta ttc acg tat cat agt gag tat;
所述第96-118位氨基酸序列為
TY眼KTAPDKDKLLFTYHSEYo
一、制備A族鏈球菌(GAS)表面蛋白FbaA的單克隆抗體(McAb) 的方法
1. 材料和方法
材料pMD18-T載體，高保真PCR系統(tǒng)，T4DNA連接酶及限制性 內(nèi)切酶均購自Takara生物公司。表達(dá)載體pGEX4T-2和￡ cWiBL21 均為本室保存。FbaA+GAS標(biāo)準(zhǔn)菌株、FbaA—GAS菌株及抗FbaA蛋白的兔 血清均由Kansas大學(xué)Cue惠贈。小量質(zhì)粒抽提及膠純化回收試劑盒購 自北京天為時(shí)代科技有限公司。凝血酶購自PIERCE公司、6周齡的雌 性BALB/c小鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0為河北醫(yī)科大學(xué)生物科技公司惠贈；RPMI1640粉末(用于培養(yǎng) 細(xì)胞的培養(yǎng)基)購自GIBCO公司；服PES (羥乙基哌嗪乙硫磺酸)緩沖 液購自AMERECO公司；次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)、氨基喋呤(A) 等細(xì)胞培養(yǎng)添加劑購自SIGMA公司；聚乙二醇4000 (PEG4000)購自 MERK公司；弗氏佐劑購自SIGMA公司；堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗小 鼠IgG以及AP標(biāo)記的抗小鼠IgGl- IgG4購自北京中杉金橋生物技術(shù) 有限公司。
2. 以FbaA蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠 2.1.制備融合FbaA蛋白
2.1.1. 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)網(wǎng)上公布的化膿性鏈球菌SSI-9 (GAS Ml血清型標(biāo)準(zhǔn)株) 基因序列(編號:AB040536)設(shè)計(jì)引物， Pl: 5' -TTAAGGATCCAGGAGGACAATATGCGTAGAGC-3'; P2: 5' -AGTGAATTCTCACCTGTTGMGGCAAGTACTTACCTG-3'，分別在Pl 和P2上添加^a貞及&oM酶切位點(diǎn)(劃線所示)。擴(kuò)增的目的基因約 為982 bp，編碼324個(gè)氨基酸，為FbaA蛋白第1位至324位的氨基酸 片段。
2.1.2. PCR (聚合酶鏈反應(yīng))
以化膿性鏈球菌SSI-9為模板，用引物P1、P2進(jìn)行擴(kuò)增，94。C5min 預(yù)變性；94。C30s,55。C30s,72。C40s，25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7min。 PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化。
2.1. 3.融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
將純化的目的基因連接至pMD18-T載體，經(jīng)序列測定正確后，用
AM和&0皿雙酶切獲得目的基因片段如圖1所示，與經(jīng)相同雙酶
切后的原核pGEX4T-2表達(dá)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化￡ co7iDH5 a ，小量提取質(zhì) 粒酶切鑒定，成功構(gòu)建了 pGEX4T-2//&a4。
2. 1. 4.融合蛋白的表達(dá)和包涵體純化 將pGEX4T-2及鑒定為陽性的pGEX4T-2/Z&a4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 ￡ "hBL21，挑取單菌落用異丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)， pGEX4T-2作為表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)的融合蛋白帶有GST (Glutathione S-transferase,谷胱甘肽硫基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白，SDS-PAGE電泳檢 測目的蛋白的表達(dá)。陽性菌株大量誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲裂解破碎，分別 收集裂解上清液和沉淀，洗滌沉淀后，溶于8mol/L尿素(pH8.0)中， 經(jīng)SDS-PAGE電泳證實(shí)GST-FbaA融合蛋白主要為包涵體形式，采用凝 膠電泳回收法進(jìn)行純化。并按常規(guī)操作用凝血酶去掉GST蛋白，電洗 脫法回收。結(jié)果如圖2所示，成功誘導(dǎo)并純化出FbaA蛋白。本申請克 隆的/^W基因不包含錨定基序，共編碼324個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量 約為35. 6KDa,但由于FbaA蛋白中富含脯氨酸，使其在SDS-PAGE電 泳中的遷移速度變慢，因此經(jīng)SDS-PAGE反映的相對分子質(zhì)量比實(shí)際大 21. 1Kda (參見Molecular Microbiology, 2001,42(1)， 75-86)，故 FbaA蛋白的相對分子質(zhì)量為57. 7 KDa， GST相對分子質(zhì)量約為26KDa， 故GST-FbaA融合蛋白相對分子質(zhì)量分別為82. 7KDa。
2. 1. 5. Western blot檢測蛋白表達(dá)
純化的GST-FbaA融合蛋白及移去GST的FbaA蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳，通過電轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，用含3呢牛血清白蛋白(BSA) 的磷酸鹽緩沖液封閉過夜，以兔抗FbaA多克隆抗體為一抗，AP標(biāo)記 的羊抗兔IgG為二抗，底物BCIP-NBT顯色。結(jié)果獲得了純化的FbaA 蛋白。結(jié)果如圖3所示。
2. 2.免疫方法
免疫原為FbaA蛋白，分別在一、三、五周三次免疫小鼠，抗原 FbaA蛋白(50ug)與弗氏完全(初次免疫)或不完全佐劑(二、三 次免疫)按1 : 1比例充分混合乳化，于小鼠的背部皮下多點(diǎn)注射。末 次免疫后10天斷尾取血，檢測血清抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)6.0X1()4以上 小鼠備用，處死小鼠取脾細(xì)胞之前72-96小時(shí)，腹腔注射無佐劑的抗 原FbaA蛋白100ug加強(qiáng)免疫一次。
3. 雜交瘤細(xì)胞株的建立
按常規(guī)方法取免疫小鼠脾細(xì)胞，與已培養(yǎng)好的SP2/0細(xì)胞按io :
1比例混合，37。C水浴逐滴加入509&聚乙二醇(PEG4000) lmL進(jìn)行細(xì)胞融 合，HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)10-14天(待融合細(xì)胞集落生長至孔底1/4 時(shí))后，采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，具體方法為優(yōu) 化包被濃度后用10ug/ml FbaA蛋白包被ELISA板，用4°C 12h，洗 滌液洗滌4次(lmin/次)，加入封閉液100Pl/孔，37。C孵育1.5h洗滌 4次；加入細(xì)胞培養(yǎng)上清，每種上清雙復(fù)孔，37。C孵育lh，洗滌4次； 加入l: 5000稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠IgG, 37。C孵育lh，洗滌；加入顯 色液，顯色30min，測定0D405值，同時(shí)設(shè)2孔空白對照。判斷標(biāo)準(zhǔn) 將陰性對照的0D405值求平均數(shù)，然后將每一份細(xì)胞培養(yǎng)上清的 0D405值與該平均數(shù)相比，P/N〉 2. l為陽性。有限稀釋法行陽性雜交 瘤細(xì)胞株的亞克隆(參見《抗體工程》 一書，北京醫(yī)科大學(xué)出版社， 第二版，2001， 56-71)。結(jié)果獲得的雜交瘤細(xì)胞融合率為37. 1%，經(jīng) 兩次亞克隆后獲得了穩(wěn)定分泌抗FbaA融合蛋白單克隆抗體的雜交瘤 細(xì)胞株。
4.小鼠腹水的制備
采用免疫同系BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0. 5mL高溫滅菌后 的石蠟油，14d后每只小鼠再腹腔注射雜交瘤細(xì)胞0. 5-1 X 106。待小鼠 腹部明顯膨大后抽取腹水。
二、單克隆抗體的檢測方法
1. 抗體效價(jià)的測定
采用間接ELISA法，測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水的效價(jià)，方法 同上。酶標(biāo)儀檢測0D405值，效價(jià)的判定標(biāo)準(zhǔn)以大于或等于陰性對 照OD405值2. 1倍且0D405值^0. 15的最高稀釋度為效價(jià)。所獲單抗 的上清效價(jià)約為l: 640，腹水的效價(jià)約為1:105。
2. McAb類別的檢測
采用間接ELISA法，測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水中的McAb 的類別，方法同上，所獲單抗的類型均為IgGl。
3. 單克隆抗體特異性的檢測
采用Western-blot方法，將純化的GAS-FbaA融合蛋白及GST蛋 白(陰性對照)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，第一抗體為陽 性細(xì)胞培養(yǎng)上清，第二抗體為AP-馬抗鼠IgG，底物為BCIP-NBT。結(jié) 果陽性雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與FbaA蛋白有特異雜交帶，如
圖4所示。
4. McAb結(jié)合鏈球菌能力的檢測
挑FbaAGAS，F(xiàn)baA+GAS菌單菌落接種于THY液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)， 次日按l: 30轉(zhuǎn)種，當(dāng)0D560=0. 5時(shí)離心集菌、洗滌2次后，將菌液 用包被液稀釋為0D560=0. 05包被96孔ELISA，第一抗體為獲得的不 同株陽性雜交瘤細(xì)胞的分泌的McAb，第二抗體為AP-馬抗鼠IgG，間 接ELISA法檢測McAb結(jié)合菌的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一株單克隆抗體(命 名為McAb96-118)與FbaA+GAS菌的結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于與FbaA—GAS 菌的結(jié)合，如圖5所示。
三、McAb96-118對應(yīng)表位區(qū)段的檢測
1. FbaA蛋白分段表達(dá)及Western blot檢測McAb96-118對應(yīng)表位 所在區(qū)段
根據(jù)FbaA蛋白的結(jié)構(gòu)，本申請人將FbaA蛋白分段誘導(dǎo)表達(dá)，四 段蛋白分別為37-108位氨基酸(FbaA3w。s) 、 68-161位氨基酸
(FbaA68—161)、 104-277位氨基酸(FbaA卦277 )及160-324位氨基酸
(FbaA16Q-324 )，設(shè)計(jì)引物如下 FbaA37—咖的上游引物5， -TT GAATTC GCC GTA GAT GGC ATC CCT C-3， FbaA37—艦的下游引物5， -GC GCTAGC CTT ATC TTT GTC TGG TGC-3， FbaAs8-un的上游引物5， -GGC GGATCC CCT TTA GGT ATA AGC TTA G-3， FbaAe8,的下游引物5， -GGT GCTAGC AGG AGA ATC AGT CGT AAC-3， FbaAun-277的上游引物5， -G GGATCC GCA CCA GAC AAA GAT AAG CTA-3， FbaA,277的下游引物5， -GTTTG GCTAGC MC AAG TGA AGA GGC-3， FbaA則—324的上游引物:5， -TT GGATCC ACG ACT GAT TCT CCT GAG-3， FbaA16?！?24的下游引物5， -TC GCTAGC ACC TGT TGA AGG CAA GTA C-3， 上述劃線部分為DNA內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，以化膿性鏈球菌SSI-9 為模板，分別用四對引物進(jìn)行擴(kuò)增，94nC5min預(yù)變性;94'C30s，55i: 30s，72。C40s，25個(gè)循環(huán);最后72'C延伸7 min。 PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳切膠回收純化。成功擴(kuò)增出四段目的基因片段，見圖6A所示， 四段基因分別經(jīng)相應(yīng)DNA內(nèi)切酶雙酶切后插入經(jīng)相同雙酶切的原核表 達(dá)載體pGEX4T-2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)后小提質(zhì)粒做雙酶切鑒定，結(jié)果見圖6B，
成功構(gòu)建了四段基因的融合原核表達(dá)質(zhì)粒。挑選陽性克隆菌37"C常規(guī) IPTG誘導(dǎo)，四段蛋白成功表達(dá)見圖7A;將四段蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn) PVDF膜，與McAb96-118行Western blot,方法同上。結(jié)果McAb96-118
只與FbaAe8^段特異地結(jié)合，見圖7B，證實(shí)McAb96-118對應(yīng)表位位 于FbaA 68—161 段。但McAb96-118不與FbaA 37-108 段、FbaA 104—277 段結(jié)合，據(jù) 此推測McAb96-118針對的表位涵蓋了 FbaA第104-108位氨基酸，結(jié) 合生物信息學(xué)技術(shù)初步確定McAb96-118針對的表位區(qū)段為FbaA的第 96-118位氨基酸。
2.表位缺失片段的融合表達(dá)及檢測
PCR搭橋法設(shè)計(jì)缺失96-118氨基酸(涵蓋了 FbaA第104-108位 氨基酸)的68-161氨基酸的基因片段(簡寫為FbaAA68-161)，引物 如下
68位氨基酸端的上游引物為
5， -GGCGGATCCCCTTTAGGTATAAGCTTAG-3，
96位氨基酸端的下游引物為
5 ， -CGGCTGTCATTTCTTTTTGTGCTTCAGATAA-3 ，
118位氨基酸的上游引物為
5 ， -GCACAAAAAGAAATGACAGCCGTTAAGGAT-3,
161位氨基酸的下游引物為
5， -GCCGGGAATTCAGTCGTAACTGATGTTG-3， 上述劃線部位為酶切位點(diǎn)。上游引物的酶切位點(diǎn)為BamHl，下游 引物的酶切位點(diǎn)為EcoRI ，以化膿性鏈球菌SSI-9為模板，PCR擴(kuò)增 出相應(yīng)的基因片段(見圖8)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BamH I / EcoR I雙酶切 后插入經(jīng)相同雙酶切的pGEX4T-2載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)。PCR鑒定 陽性克隆、測序正確后，將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)，陽性克隆經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)FbaAA68-161蛋白片段(見圖9)， McAb96-118與FbaA △68-161、 FbaA68-161行western blot以及將這兩種蛋白以相同濃 度包被ELISA板后行間接ELISA。 二者結(jié)果一致，即McAb96-118只與 FbaA68-161片段特異結(jié)合，不與FbaAA68-161結(jié)合(見圖10， 11)， 證實(shí)McAb96-118針對的表位位于FbaA蛋白的第96-118位氨基酸。
四、結(jié)論與討論
鏈球菌FbaA蛋白屬于纖連蛋白結(jié)合蛋白，與金黃色葡萄球菌纖連 蛋白結(jié)合蛋白有很高的同源性。己知在化膿性鏈球菌和上皮細(xì)胞相互 作用的過程中，GAS的F1蛋白可以利用可溶性纖連蛋白介導(dǎo)與作為上 皮細(xì)胞表面受體的整合素a 5 6 1的結(jié)合(參見Mol Microbiol, 1998， 30:625-637 ); FbaA蛋白也可以通過結(jié)合纖連蛋白介導(dǎo)鏈球菌與HEp-2
細(xì)胞結(jié)合并侵入HEp-2細(xì)胞(參見Infect Immun., 1998， 66: 4593-4601)，鏈球菌的這種特性可使其逃避抗生素及機(jī)體免疫系統(tǒng)的 攻擊。
FbaA蛋白還可與血漿中的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白H因子(FH)及H因子樣蛋 白-1 (FHL-1)結(jié)合(參見Infect I國n, 2002， 70: 6206-6214)。 Horstmann等(參見Proc Natl Acad Sci USA， 1988, 85:1657-1661) 首先提出，F(xiàn)baA蛋白結(jié)合FH和其他補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的能力支配或影響致 病菌逃避補(bǔ)體攻擊和細(xì)胞調(diào)理作用的能力(參見Biol Chem, 2002， 277:12642-12648， Eur J I畫unol， 2003， 33:697-707)。
本申請基于FbaA蛋白制備了其單克隆抗體，類型均為IgGl，并 且其中一株單克隆抗體McAb96-118引起了申請人極大的興趣。全菌 ELISA結(jié)果顯示，McAb96-118與FbaA+GAS及FbaA—GAS的結(jié)合能力有明 顯的差異:其可與FbaA+GAS特異結(jié)合，而與FbaA—GAS的結(jié)合能力極弱， 提示McAb96-118針對的表位屬于菌體表面的FbaA蛋白的天然表位。 繼而，將McAb96-118與FbaA分段蛋白結(jié)合，顯示其能特異地結(jié)合FbaA 68—161 段，但不與FbaA 37-108 段、FbaA 104-277 段結(jié)合，據(jù)此推測McAb96-118 針對的表位涵蓋了 FbaA第104-108位氨基酸的區(qū)段，結(jié)合生物信息學(xué) 技術(shù)，初步確定了該單抗針對的表位區(qū)段位于FbaA蛋白的第96-118 位氨基酸；于是，設(shè)計(jì)FbaA蛋白的第96-118位氨基酸(包含了 FbaA 第104-108氨基酸)缺失的68-161位氨基酸的融合蛋白FbaAA68-161 的誘導(dǎo)表達(dá)，并將表達(dá)產(chǎn)物與McAb96-118分別行Western-blot及 ELISA，結(jié)果顯示缺失了 96-118位氨基酸的融合蛋白不與McAb96-l 18 發(fā)生特異性結(jié)合，證明FbaA蛋白的第96-118位氨基酸為McAb96-118 針對的表位區(qū)段，且篩選出多株一樣的雜交瘤細(xì)胞，其產(chǎn)生的單克隆 抗體針對的表位區(qū)段都多是該區(qū)段，提示該表位是一個(gè)優(yōu)勢表位。
本發(fā)明有益效果如下
1、 本發(fā)明所述的單克隆抗體McAb96-118所針對FbaA蛋白的氨基 酸序列是位于GAS表面的天然結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是GAS的一個(gè)優(yōu)勢表位， 這為深入研究新型GAS疫苗提供了新的靶點(diǎn)。
2、 McAb96-118與FbaA蛋白的結(jié)合區(qū)段與FH、 FHL-1與FbaA蛋 白結(jié)合位點(diǎn)(FbaA蛋白的97-112位氨基酸)重疊，因?yàn)镚AS通過其 表面蛋白FbaA與FH的結(jié)合入侵上皮細(xì)胞，故McAb96-118與GAS結(jié)合 可以降低GAS侵入細(xì)胞的能力。這為研究鏈球菌的致病機(jī)制、開辟控
制鏈球菌感染非抗生素治療提供了新視角。


圖1為PCR擴(kuò)增/ib^基因片段及PMD-18T/ZZ，a力雙酶切產(chǎn)物的瓊 脂糖膠電泳圖。
圖2為融合Fba蛋白的SDS-PAGE圖。
圖3為融合蛋白的Western blot分析圖。
圖4為Western blot檢測McAb的特異性。
圖5為McAb96-118與FbaA+GAS和FbaA_GAS結(jié)合能力的ELISA檢 測圖(橫坐標(biāo)為McAb96-118的稀釋度)。
圖6A為PCR擴(kuò)增四段基因片段的瓊脂糖膠電泳圖。 圖6B為四段基因片段插入pGEX4T-2后的雙酶切鑒定電泳圖。 圖7A為FbaA各分段蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖。 圖7B為McAb96-118與分段蛋白的Western blot分析圖。 圖8為PCR搭橋法擴(kuò)增FbaAA68-161的基因片段的瓊脂糖膠電泳圖。
圖9為FbaA68-161誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE圖。 圖10為McAb96-118與FbaA68-161和FbaAA68-161的Western blot分析圖。
圖11為McAb96-118與FbaA68-161和FbaAA68-161結(jié)合的ELISA 檢測圖(McAb96-118的稀釋度為l: 4000)。
在圖1中，1.標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量DNA， 2. PCR擴(kuò)增鏈球菌y&a4基 因，3.融合質(zhì)粒pMD18-T外o4雙酶切產(chǎn)物；
在圖2中，4.蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),5.融合質(zhì)粒pGEX4T-2/^kL4 未誘導(dǎo)，6.融合質(zhì)粒pGEX4T-2外"誘導(dǎo)表達(dá)，7.純化的GST-FbaA 融合蛋白，8.去除GST的FbaA蛋白；
在圖3中，9.純化的GST-FbaA融合蛋白，lO.移去GST的FbaA 蛋白，11. GST陰性對照；
在圖4中，12.純化的GST-FbaA融合蛋白，13. GST陰性對照， 14特異雜交帶；
在,6A中，15. FbaA37.u)8的基因片段，16. FbaA68_161的基因片 段，17. FbaAK)4.277的基因片段，18. FbaA,324的基因片段，19. DNA Marker;
在圖6B中，20. pGEX4T-2/y&d！,24的雙酶切產(chǎn)物，21.
pGEX4T-2/yZ>o4/w_277的雙酶切產(chǎn)物，22. DNA Marker ， 23. pGEX4T-2妙o4沐^的雙酶切產(chǎn)物，24. pGEX4T-2/yZ>a^7-/0S的雙酶切 產(chǎn)物；
在圖7A中，25.蛋白Marker, 26. FbaA37_108蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，27. FbaA37.108未誘導(dǎo)表達(dá)，28. FbaA68.161蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，29. FbaA^w 未誘導(dǎo)表達(dá)，30. FbaA脅277蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，31. FbaA1()4_277未誘導(dǎo)表 達(dá)，32. FbaA脅324蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，33. 63八16().324未誘導(dǎo)表達(dá)；
在圖7B中，34. FbaA37.108， 35. FbaA68.161， 36. FbaA104.277， 37. PbaA160_324;
在圖8中，38. DNAMarker, 39. 68位至95位氨基酸的基因片 段，40. 119位至161位氨基酸的基因片段，41. FbaAA68-161的基 因片段；
在圖9中，42.蛋白Marker，43. FbaAA68-161誘導(dǎo)表達(dá)，44. FbaA △68-161未誘導(dǎo)表達(dá)，45.陰性對照GST蛋白；
在圖10中，46. FbaA68-皿,47. FbaAA68-161。
具體實(shí)施例方式
單克隆抗體McAb96-118是由以FbaA蛋白為免疫原免疫小鼠制備 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生；
所述單克隆抗體的類型為IgGl;
所述第96-118位氨基酸的基因的堿基序列為
acg tat aaa caa aaa att aaa act gca_ cca_ gac aaa_ gat aag eta tta ttc acg tat cat agt gag tat;
所述第96-118位氨基酸序列為
TYKQKIKTAPDKDKLLFTYHSEY 。
并按照上述發(fā)明內(nèi)容部分中第一、二、三部分的內(nèi)容具體操作即可。
權(quán)利要求
1、針對A族鏈球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體是由以FbaA蛋白為免疫原免疫小鼠制備的一株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生；所述單克隆抗體的類型為IgG1；所述第96-118位氨基酸的基因的堿基序列為acg tat aaa caa aaa att aaa act gca cca gac aaa gat aag ctatta ttc acg tat cat agt gag tat；所述第96-118位氨基酸序列為TYKQKIKTAPDKDKLLFTYHSEY。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對A族鏈球菌表面蛋白FbaA第96-118位氨基酸的單克隆抗體，所述單克隆抗體是由以FbaA蛋白為免疫原免疫小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生；所述單克隆抗體的類型為IgG1。本發(fā)明的有益效果是為深入研究鏈球菌的致病機(jī)制提供了新的靶點(diǎn)；并且為尋找新型GAS疫苗、開辟控制鏈球菌感染非抗生素治療提供了新視角。
文檔編號C12N15/31GK101386647SQ20081007966
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者李彩紅, 楊建嶺, 王秀榮, 郭奕陽, 顧海燕, 馬翠卿, 林 魏 申請人:河北醫(yī)科大學(xué)