專利名稱：一種新的rna干擾載體的構(gòu)建與篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是生物基因克隆表達技術(shù)，特別是一種快速、高效、高通量 構(gòu)建動植物RNA干擾(RNA interference ，RNAi)載體的方法。特別適合用于大 規(guī)模地構(gòu)建針對動植物各個基因的RNA干擾單元，用于動植物基因的功能研究， 而且篩選方便快捷。
背景技術(shù)：
RNA干擾是指在正常生物體內(nèi)，由雙鏈RNA引起同源mRNA的特異性降 解，從而抑制相應(yīng)基因表達的過程。它是一種轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默，在生物體 內(nèi)普遍存在。隨著研究者對生命現(xiàn)象研究的深入，RNA干擾技術(shù)因其高特異性、 高效率、操作簡便、重復(fù)性好，已經(jīng)成為當今動植物基因功能、基因治療、藥 物靶點篩選與鑒定、植物代謝以及細胞信號傳導(dǎo)通路等研究中的重要手段之一。
歸納起來，現(xiàn)行的RNA干擾載體構(gòu)建方法主要有以下三種①寡核苷酸退 火法。由化學(xué)合成的部分互補、含有干擾目的基因的靶序列的兩條寡核苷酸單 鏈，在離體條件下退火形成雙鏈DNA，退火產(chǎn)生兩端突出的粘性末端，能與處 理好的載體的突出末端互補，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，得到含有RNA干擾表達單元的重 組質(zhì)粒。化學(xué)合成的寡核苷酸通常為反向重復(fù)序列，這樣轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA 能夠回折互補配對，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)經(jīng)處理后形成小干擾RNA(siRNA) 而引發(fā)RNA干擾效應(yīng)。②PCR擴增法。構(gòu)建動物細胞RNA干擾載體時，先設(shè) 計一對擴增控制RNA干擾單元表達的啟動子的PCR引物，正向引物與啟動子 特異性匹配，反向引物5'末端額外加上針對目的基因的干擾靶序列，將PCR產(chǎn) 物克隆到相應(yīng)的載體上，得到表達RNA干擾單元的載體。構(gòu)建植物人工微 RNA(miRNA)表達載體時，先按照需要設(shè)計三對引物，進行三輪獨立的PCR， 獲得的三種PCR產(chǎn)物分別含有待干擾的目的基因的靶序列、miRNA的環(huán)序列 以及待干擾的目的基因靶序列的互補序列；然后采用重疊延伸PCR的方法將獲 得的三種PCR產(chǎn)物拼接成完整的人工miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，再將其克隆到植 物雙元載體上。采用PCR方法構(gòu)建植物人工miRNA載體的另一種方式是先設(shè) 計并合成一對引物，引物5'端為額外添加的酶切位點與目的基因的干擾耙序列 或其互補序列，3'端為與骨架miRNA中的環(huán)序列退火區(qū)域，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收后克隆到載體上。③寡核苷酸退火延伸法?；瘜W(xué)合成兩條部分互補 的寡核苷酸單鏈，在非互補的單鏈區(qū)域分別含有干擾目的基因的靶序列及其互
補序列,在特定條件下使兩條單鏈退火，然后延伸形成完整的小雙鏈DNA分子， 經(jīng)酶切處理后克隆到載體上。
以上方法雖然能夠成功構(gòu)建各種RNA干擾載體，但是明顯存在不足，主要 表現(xiàn)在以下幾個方面:
一、 步驟繁瑣，克隆效率低。以上三種方法都需要對克隆的目的片段和載 體進行特殊處理，需要目的片段與載體的連接反應(yīng)。方法①需要化學(xué)合成的兩 條寡核苷酸單鏈體外退火，得到的產(chǎn)物需要純化處理，然后與處理好的載體連 接反應(yīng)。由于待克隆的目的片段通常小于100bp，因此難以純化，得率低，而且 獲得正確的重組質(zhì)粒較困難，假陽性率高。方法②需要在PCR引物中加上針對 靶基因的干擾序列，通常需要長引物(通常大于70nt)或者多輪的PCR擴增反 應(yīng)，擴增后的PCR產(chǎn)物也需要酶切純化，然后與處理好的載體進行連接反應(yīng)； 方法③中兩條寡核苷酸單鏈退火延伸得到的產(chǎn)物必須經(jīng)過復(fù)雜的回收純化、酶 切純化等步驟后，才能克隆到相應(yīng)載體。方法②③不僅花費時間，工序繁瑣， 而且載體連接上非目的片段或自連的幾率很高，使后續(xù)的篩選鑒定過程復(fù)雜化。
二、 不適合高通量的操作。
以上三種方法中的待克隆片段都需要預(yù)先純化處理，都依賴于載體與外源 片段的連接反應(yīng)，這對于構(gòu)建單個或少數(shù)RNA干擾載體可能可行，但是對于大 規(guī)模地構(gòu)建RNA干擾載體來講卻非常困難，而且效率低下。方法①和②中使用 的寡核苷酸單鏈通常為60-100nt,合成這樣的寡核苷酸單鏈不僅實驗成本高，而 且堿基合成錯誤率高，進而大大增加了后續(xù)的篩選工作量，費時費力。方法② 和③中的外源片段都需要經(jīng)過復(fù)雜的雙酶切、回收純化等步驟，因外源片段一 般都較小(200bp以內(nèi))，回收純化效率較低，這兩種方法不僅實驗成本昂貴， 而且后續(xù)篩選困難，工作量大。
(參見刊物"RNA. 2002 8:1454-1460"; "Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1121-33.，，； "Nat Biotechnol. 2006 Nov;24(ll):1420-8. "; "Physiol Genomics. 2007 Nov 14;31(3):554-62."參見網(wǎng)頁www.invitrogen .com或Invitrogen公司產(chǎn)品目錄)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)載體的
構(gòu)建方法。該方法主要包括載體的改造、含有干擾靶序列的DNA序列的產(chǎn)生和將上述含有干擾耙序列的DNA序列克隆到載體三個部分。該方法不需要訂購 長度大于60nt的引物，不需要對PCR產(chǎn)物進行復(fù)雜的酶切純化處理，而是依賴 載體和外源片段連接重組，從而產(chǎn)生完整的fecrO序列(乳糖操縱基因)，在/^+ 的大腸桿菌菌株中憑借藍白斑篩選判斷重組子。其篩選方法方便、直觀、快捷、 高效，得到的重組子不需進行方向鑒定。 本發(fā)明中構(gòu)建RNA干擾載體的具體方法為
一) 載體的改造
首先選定一 目標載體，將該載體上已經(jīng)存在的萬> I (或fiyn)位點以及/acO 序列進行誘變，誘變后的載體不再含有^/"I (或Byn)位點以及/"cO序列。然
后在載體的多克隆位點處引入兩端帶有B/"i (或5yn)位點以及一端帶有部分
/"cO序列的填充片段(如抗性基因、妳等)。
二) 含有干擾靶序列的DNA序列的形成(具體過程見圖1) 根據(jù)RNA干擾載體種類的不同，采取不同的方法完成該步驟
1) 針對siRNA載體、shRNA載體，首先設(shè)計一對包含靶序列的引物，該 引物3，末端含有長度為9-20nt彼此同源的序列，其中一條引物5，端額外加上/oc:O 的部分序列(與載體上的部分/flcO序列正好重構(gòu)成完整的/"cO序列)，利用具 有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶(具體為TaqDNA聚合酶、ExDNA聚合 酶、LA DNA聚合酶等，下同)使兩條引物退火延伸，得到的產(chǎn)物即為所要的 序列(詳見圖1A);
2) 針對人工微RNA (artificial microRNAs，amiRNAs)載體，首先以出發(fā)微 RNA (microRNA， miRNA)的3'端側(cè)翼序列為模板，設(shè)計一條通用引物(若3' 端側(cè)翼序列較短，則不需要通用引物)，該引物的5'端額外加上/acO的部分序 列(與載體上的部分/acO序列正好重構(gòu)成完整的/acO序列)，然后根據(jù)出發(fā) miRNA環(huán)序列長短不同，又分為以下兩種情況
a) 當環(huán)序列較短(通常30nt以下)時，設(shè)計一對包含靶序列的引物，其3' 末端分別帶有部分環(huán)序列(兩部分環(huán)序列可重構(gòu)成完整的環(huán)序列)，且使該引物 3'末端序列彼此部分(通常為9-20nt)同源，其中與出發(fā)miRNA 3'端退火的那 條引物5'端與上面設(shè)計的通用引物含15-20nt同源序列(若出發(fā)miRNA3'端 側(cè)翼序列較短，則不需設(shè)計該同源部分)，利用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA 聚合酶使該對引物以及通用引物三者相互退火延伸，得到的產(chǎn)物即為所要的序 列(詳見圖1 B);
b) 當環(huán)序列較長(通常30nt以上)時，設(shè)計一對包含靶序列的引物，其3'末端分別帶有可以和出發(fā)miRNA的環(huán)序列退火的部分序列，其中與出發(fā)miRNA 3，端退火的那條引物的5'端與上面設(shè)計的通用引物含15-20nt同源序列(若出發(fā) miRNA3'端側(cè)翼序列較短，則不需設(shè)計該同源部分)，以含有相應(yīng)環(huán)序列的 DNA序列為模板，用上述設(shè)計的三條引物(一對特異引物和一條通用引物)和 具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶進行PCR，得到的產(chǎn)物即為所要的序列 (詳見圖1C);
三) 載體與外源片段的連接轉(zhuǎn)化
首先將步驟一)中改造好的載體經(jīng)^/i/i (或丑yn)完全酶切，得到3'端突
出一個堿基的線性載體DNA分子，所得的線性載體經(jīng)回收純化，然后與純化過 的步驟二)中獲得的含有靶序列的PCR產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 DH10P，涂布含lOO^g/ml氨芐青霉素(或其它抗生素)以及30ng/ml X-gal的 LB固體培養(yǎng)基，37 。C培養(yǎng)12-16小時，呈現(xiàn)藍色的菌落即為重組子。
四) 含有耙序列的RNAi表達單元克隆到植物雙元表達載體上 對于可以直接用于步驟一)改造的RNAi載體(如動植物細胞中用于瞬間
檢測的RNAi表達載體)則可省略該步驟。對于不能或不方便用于步驟一)直 接改造的植物雙元表達載體，可先選擇一個比較小的克隆載體按步驟一)進行 改造(如pBluescript SK 、 pMAGIC等)，然后通過酶切連接、Gateway重組克 隆以及接合轉(zhuǎn)移等方法將RNAi表達單元克隆到植物雙元表達載體上。
本發(fā)明的基本原理是①1Is型限制性核酸內(nèi)切酶5/"I(或^n)的識別序 列中均含有一定數(shù)量的可變堿基，且雙鏈DNA經(jīng)該酶切割后會在3，末端突出一 個堿基；②帶有完整/^0序列的載體導(dǎo)入/^+的大腸桿菌菌株后，載體上的 /wO位點由于競爭性結(jié)合菌體中的Lacl阻遏蛋白而使得菌體中的Lac操縱子表 達開啟，表達的卩-半乳糖苷酶因分解半乳糖類似物X-gal而使得菌落呈藍色。根 據(jù)以上兩個原理，我們將某特定載體改造成攜帶一填充片段(如抗性基因、 她等)的載體，填充片段兩端分別帶有一個B>I (或斷I)酶切位點，同時， 在其中的一個丑>1 (或5力1)位點附近帶有/"cO的部分堿基序列，/mO的剩余 堿基序列在外源片段的末端，只有外源片段按照正確的方向連接到載體上，才 能構(gòu)成完整的/"cO序列，進而篩選出重組子。
本發(fā)明所述的或限制性核酸內(nèi)切酶，還包括所有酶切后的DNA具 有5'端突出特點的lis型限制性核酸內(nèi)切酶。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢
一、本發(fā)明中，在改造后的載體中插入了易于篩選的填充片段(如抗性基因、她等)，經(jīng)B/"I (或必力I)酶切后填充片段丟失，這樣在重組子篩選過 程中使得因酶切不完全造成的背景極易辨別。
二、 本發(fā)明在載體與含有干擾靶序列的PCR產(chǎn)物末端各包含一部分/wO序 列，只有當兩者按照正確的方向連接成功，重組質(zhì)粒上才能產(chǎn)生完整的/acO序
列，重組子才有可能呈現(xiàn)藍色，這種正向篩選的/^o序列重構(gòu)的方法使得載體
自連、非目的序列與載體連接以及連接方向不正確等產(chǎn)生的菌落與我們想要的 正確重組子極易區(qū)分。
三、 本發(fā)明在構(gòu)建siRNA和shRNA干擾載體的過程中，利用兩條引物相互 退火延伸，得到的PCR產(chǎn)物不需復(fù)雜的回收純化(必要時可用兩倍體積乙醇或 一倍體積異丙醇沉淀)就可直接與處理好的載體進行連接，大大簡化了實驗工 序，提高了實驗效率，降低了實驗成本。
四、 本發(fā)明在構(gòu)建人工微RNA (amiRNA)載體的過程中巧妙地利用了一 條通用引物搭橋，使得所有設(shè)計的引物長度都不受側(cè)翼序列長度的限制，而且 都被控制在60nt以內(nèi)，這樣不僅節(jié)約了實驗成本，而且大大降低了引物合成中 的堿基錯誤率。
五、 本發(fā)明的整個過程操作簡單方便，實驗周期短，重組效率高，成本低， 篩選方便、直觀、快捷，很容易實現(xiàn)自動化和高通量操作。


圖1:含RNAi表達單元的載體構(gòu)建過程 其中①②表示包含干擾耙序列的一對引物；③表示通用引物；/acO'表示位 于載體上的部分/aoO序列，堿基序列為5'-agcgctcacaatt-3' ; /acO'表示位于通 用引物上的部分/aoO序列；GeneX表示填充片段；丑/mI表示酵切位點，其識別 序列及切割位點為 5'-GTATCCNNNNNN」3'
3' -CATAGGNNNNN |一5，
圖2:實施例l中改造的目標載體結(jié)構(gòu)圖
其中5' flanking seq表示選定miRNA骨架的5'端側(cè)翼序列，B/wI表示酶切位點； lacO'表示完整/aoO的部分序列；Promoter表示啟動子序列；Terminator表示終 止子序列；GeneX表示填充片段。
具體實施方式
下面以實施例對本發(fā)明進一步說明實施例1:
利用本發(fā)明構(gòu)建以擬南芥的miR319a為骨架，以査爾酮合成酶(CHS)基 因作為干擾靶基因的植物人工微RNA (amiRNA)表達載體。
1) 克隆載體的改造
為了后續(xù)實驗的需要，選定的克隆載體為可用于接合輔助的遺傳整合克隆 (mating-assisted genetically integrated cloning, MAGIC)方法的供體質(zhì)粒。經(jīng)分 析得知，該質(zhì)粒DNA序列上攜帶兩個5/wI位點， 一個/acO序列，將兩個B/"I 位點誘變成B"mHI位點，將/acO序列缺失突變。在改造好的載體的多克隆位點 處插入下列片段"-啟動子(P35S) -5，側(cè)翼序列-5>1位點-她表達單元-5>1位 點-tocO部分序列-終止子(Tnos)-"，得到改造載體pDONOR-gfy。(詳見圖2)
2) 含有干擾靶序列的人工微RNA —miR319aCHS的形成 按照本發(fā)明具體方法步驟二)中的原則，分析擬南芥來源的miR319a序列，
省去通用引物，設(shè)計并合成一對特異性引物pF&pR ,以含有miR319a序列的 載體為模板，用TaqDNA聚合酶進行PCR，得到的產(chǎn)物即為miR319aCHS。設(shè)
計的引物序列如下
pF: 5 ，ag catctceaagaacattgtgaa tcetc碎gtcgtgatateatt 3 ，
pR: 5 ，cflca"W caaaagagag catctccaag幼cattgtgaa tcaaagagaatcaatgatcc 3 ，
以上引物中，pF中下劃" _^"部分表示5'端側(cè)翼序列被切掉的兩個堿 基；pR中下劃" "部分表示3'端側(cè)翼序列；下劃"一"部分表示與miR319a的 環(huán)序列退火部分；灰色陰影部分表示選定目的基因的干擾靶序列；斜體部分表 示可與載體上攜帶的部分/acO序列組成完整/flcO的剩余序列。
3) 載體與外源片段的連接轉(zhuǎn)化
將步驟l)中改造好的載體經(jīng)5^/I酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與步驟2) 中純化的PCR產(chǎn)物miR319aCHS經(jīng)連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10p，涂 布LA+X-gal平板，于37 °C培養(yǎng)12小時觀察結(jié)果，挑選藍色單菌落抽提質(zhì)粒驗 證，驗證結(jié)果表明，藍色菌落為重組子的概率為100%。正確的重組子送給 Invitrogen公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒用于下一步實驗。
4) 含有耙序列的RNAi單元克隆到植物雙元RNAi表達載體上
采用MAGIC的方法，將步驟3)中測序正確的重組質(zhì)粒上的RNAi單元 miR319aCHS轉(zhuǎn)移到經(jīng)改造的受體載體——植物雙元載體pl301R上。實驗結(jié) 果表明，獲得含有miR319aCHS序列的植物雙元表達載體的陽性克隆率達到 100%。實施例2:
利用本發(fā)明構(gòu)建以哺乳動物的miR30為骨架，以agtagattaccactggagtct為干擾 靶序列的動物人工微RNA (amiRNA)載體。
1) 克隆載體的改造
分析載體pBluescript SK (+)序列，誘變該序列上的Byi/I位點和/flcO序列。 在改造好的載體的多克隆位點處插入下列片段"-啟動子(CMV) -5'側(cè)翼序列 -5/wI位點-gfy表達單元-^^I位點-lacO部分序列-終止子(SV40PolyA)-"。
2) 含有干擾耙序列的人工微RNA—mir30-X的形成
按照本發(fā)明具體方法步驟二)中的原則，分析miR30序列，設(shè)計并合成一 條通用引物pUR和一對特異性引物pF&pR ，混合3條引物，用TaqDNA聚合 酶在25 。C下退火，72 °C延伸，得到的產(chǎn)物即為mir30-X。設(shè)計的引物序列如下
pF: agtagattaccactggagtct tagtgaagccacagatgta
pR: cgaggcagtaggca agtagattacctggagtct tacatctgtggcttcac
以上引物中，斜體部分表示可與載體上攜帶的部分/^0序列組成完整/flcO 的剩余序列；下劃"—"部分表示miR30的3'端側(cè)翼序列；灰色陰影部分表示干 擾靶序列(pF中)及其互補序列(pR中)。
3) 載體與外源片段的連接轉(zhuǎn)化
將步驟l)中改造好的載體經(jīng)5/wI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與步驟2) 中經(jīng)酒精沉淀的PCR產(chǎn)物miR30-X用連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10卩， 涂布LA+X-gal平板，于37 °C培養(yǎng)12小時觀察結(jié)果，挑選藍色單菌落抽提質(zhì)粒 驗證，驗證結(jié)果表明，藍色菌落為重組子的概率為100%。正確的重組子送給 Invitrogen公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒即可用于下一步的哺乳動物細胞瞬間 表達檢測。
權(quán)利要求
1、一種新的RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選方法，它主要包括載體的改造、含有干擾靶序列的DNA序列的產(chǎn)生和將上述含有干擾靶序列的DNA序列克隆到載體三個部分，其特征在于具體步驟為一、載體的改造首先選定一目標載體，將該載體上已經(jīng)存在的Bfu I或者Bfi I位點以及l(fā)acO序列進行誘變，誘變后的載體不再含有Bfu I或者Bfi I位點以及l(fā)acO序列，然后在載體的多克隆位點處引入兩端帶有Bfu I或者Bfi I位點以及一端帶有部分lacO序列的填充片段；二、含有干擾靶序列的DNA序列的形成根據(jù)RNA干擾載體種類的不同，采取不同的方法完成該步驟1)針對siRNA載體、shRNA載體，首先設(shè)計一對包含靶序列的引物，該引物3’末端含有長度為9-20nt彼此同源的序列，其中一條引物5’端額外加上能夠與載體上的部分lacO序列正好重構(gòu)成完整的lacO序列的lacO部分序列，利用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶使兩條引物退火延伸，得到的產(chǎn)物即為所要的序列；2)針對人工微RNA(artificial microRNAs，amiRNAs)載體，首先以出發(fā)微RNA(microRNA，miRNA)的3’端側(cè)翼序列為模板，該引物的5’端額外加上能夠與載體上的部分lacO序列正好重構(gòu)成完整的lacO序列的lacO部分序列，然后根據(jù)出發(fā)miRNA環(huán)序列長短不同，又分為以下兩種情況a)當環(huán)序列小于30nt時，設(shè)計一對包含靶序列的引物，其3’末端分別帶有部分環(huán)序列，且使該引物3’末端序列彼此部分同源，序列長度為9-20nt，其中與出發(fā)miRNA 3’端退火的那條引物5’端與上面設(shè)計的通用引物含15-20nt同源序列，利用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶使該對引物以及通用引物三者相互退火延伸，得到的產(chǎn)物即為所要的序列；b)當環(huán)序列大于30nt時，設(shè)計一對包含靶序列的引物，其3’末端分別帶有可以和出發(fā)miRNA的環(huán)序列退火的部分序列，其中與出發(fā)miRNA 3’端退火的那條引物的5’端與上面設(shè)計的通用引物含15—20nt同源序列，以含有相應(yīng)環(huán)序列的DNA序列為模板，用上述設(shè)計的一對特異引物、一條通用引物和具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的耐熱DNA聚合酶進行PCR，得到的產(chǎn)物即為所要的序列；三、載體與外源片段的連接轉(zhuǎn)化首先將步驟一中改造好的載體經(jīng)Bfu I或者Bfi I完全酶切，得到3’端突出一個堿基的線性載體DNA分子，所得的線性載體經(jīng)回收純化，然后與純化過的步驟二中獲得的含有靶序列的PCR產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH10β，涂布含100μg/ml氨芐青霉素或其它抗生素以及30μg/mlX-gal的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12-16小時，呈現(xiàn)藍色的菌落即為重組子；四、含有靶序列的RNAi表達單元克隆到植物雙元表達載體上對于能夠直接用于步驟一改造的RNAi載體，則能夠省略該步驟，對于不能直接改造的植物雙元表達載體，應(yīng)先選擇一個比較小的克隆載體按步驟一進行改造，然后通過酶切連接、Gateway重組克隆以及接合轉(zhuǎn)移方法將RNAi表達單元克隆到植物雙元表達載體上。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新的RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選方法，其 特征在于所述的5>i或5ya限制性核酸內(nèi)切酶，還包括所有酶切后的DNA具有 5'端突出特點的lis型限制性核酸內(nèi)切酶。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種新的RNA干擾載體的構(gòu)建與篩選方法，它主要包括載體的改造、含有干擾靶序列的DNA序列的產(chǎn)生和將上述含有干擾靶序列的DNA序列克隆到載體三個部分，本發(fā)明步驟繁瑣，克隆效率低，適合高通量的操作。該方法不需要訂購長度大于60nt的引物，不需要對PCR產(chǎn)物進行復(fù)雜的酶切純化處理，而是依賴載體和外源片段連接重組，從而產(chǎn)生完整的lacO序列(乳糖操縱基因)，在lac⁺的大腸桿菌菌株中憑借藍白斑篩選判斷重組子。其篩選方法方便、直觀、快捷、高效，得到的重組子不需進行方向鑒定，很容易實現(xiàn)自動化和高通量操作。
文檔編號C12N15/82GK101418311SQ20081004865
公開日2009年4月29日 申請日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者紅 嚴, 俊 徐, 馬立新 申請人:湖北大學(xué)