Pten基因干擾慢病毒載體及其制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種PTEN基因干擾慢病毒載體及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] PTEN又名MMAC1/TEP1，是1997年由三個獨立的研究小組幾乎在同一時間克隆出來 的一種抑癌基因。據(jù)Li J.Yen C.LiawD.et al.PTEN，aputative proteintyrosine phosphatase gene mutated inhuman brain. breast and prostate cancer[J] .Science. 1997, 275(28):1943-1947,中報道用代表性差別分析法 (representationaldifference analysis，RDA)，在浸潤性乳腺癌的兩個移植瘤中發(fā)現(xiàn)了 10q23染色體特定區(qū)域的純合性缺失，并通過外顯子俘獲分析法(exontrap analysis)分離 出一種新的基因，對其開放閱讀框架(0RF)序列分析揭示了它可能編碼蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸 酶（PTP)，且與張力蛋白，輔助蛋白有大片同源區(qū)，因此將其命名為PTEN(ph 〇SphataSe andtensin homology deleted on chromosome 10)。同時，由于10q23L0H在膠質(zhì)母細胞瘤 中的頻率為70 %左右，Steck等對此現(xiàn)象研究時，亦從其細胞系中克隆得到亞定位于 10q23.3，于多種進展期癌中突變的基因，稱之為MMAC1之后不久，在搜索PTPs家族新成員過 程中又獲得一受TGF-fH周節(jié)、上皮細胞富含的磷酸酶基因 TEP1，（TGF-f3regulated and epithelial cell-enriched phosphatase)，詳見 SteckPA.Pershouse MA . Jasser SA.etal. Identification of a candidate tumor suppressor gene .MMAC 1.atchromosome 10q23.3that is mutated inmultip le advanced cancers[J].Nat Genet，1997，15(4): 356-362 ·在比較PTEN、MMAC1和TEP1三者cDNA及編碼的蛋白后將其歸為 同一基因。隨后文獻中多以PTEN或PTEN/MMAC1的形式出現(xiàn)。PTEN基因異常廣泛存在于人類 各種惡性腫瘤中，如惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、黑色素瘤等。PTEN基 因正常表達可以抑制腫瘤細胞侵襲、轉移和生長，該基因異常將導致PTEN蛋白表達下降甚 至完全不表達。PTEN基因失活與細胞信號轉導、腫瘤發(fā)病機理、浸潤轉移、惡性轉化、無限制 生長和臨床預后等有較為密切的關系。
[0003] PTEN基因定位于第10號染色體10q23.3區(qū)，有9個外顯子，其cDNA序列內(nèi)包含一個 由1209個核苷酸組成的開放閱讀框，第5個外顯子編碼第122~123位氨基酸，該編碼序列與 蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶催化區(qū)的核心基序符合，是迄今為止 發(fā)現(xiàn)的第一個編碼具有雙重特異磷酸酶功能的抑癌基因。同其它抑癌基因一樣，PTEN為一 高度保守基因，人、小鼠、犬的PTEN序列有99.75%的同源性，在細胞的分化中起著重要的作 用。PTEN編碼一個由403個氨基酸組成的一條肽鏈，PTEN蛋白沒有SH2結構，也沒有跨膜信 號，它是定位于細胞漿的一種磷酸脂酶。PTEN蛋白的氨基酸序列氨基端與細胞骨架蛋白 tensin和神經(jīng)觸突泡轉運相關蛋白auxilin高度同源，提示PTEN在維持細胞的結構和信號 轉導中起重要作用。PTEN基因具有雙重磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸 酉每活性，SimpsonL · Parsons R. PTEN: 1 if e as a tumor suppressor [J] .Exp Cell Res. 2001，264( 1): 29-4 1.報道PTEN主要是通過脂質(zhì)磷酸酶發(fā)揮抑癌作用。磷脂酰肌醇-3， 4,5_三磷酸[PtdIns(3,4,5)P3,簡稱PIP3]是PTEN作用的主要底物，PIP3是細胞生長因子的 第二信使，其在細胞膜上地聚集能夠促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。而PTEN可以使其脫磷 酸，降低細胞內(nèi)的PIP3水平，阻斷其后的傳導通路，使細胞周期阻斷在G1期或促使細胞凋 亡，對細胞的生長起負調(diào)節(jié)作用。當PTEN基因發(fā)生體細胞突變或丟失而失活時，導致細胞內(nèi) PIP3的水平增高，其后的信號傳導加強，使細胞無限增殖形成腫瘤。此外，PTEN基因也具有 蛋白酪氨酸酶活性，使磷酸化的酪氨酸和絲氨酸局部粘連激酶(FAK)脫磷酸，抑制整合素介 導的細胞浸潤和轉移。
[0004] 在人類大多數(shù)惡性腫瘤中，均有抑癌基因的突變，如P53、PTEN、P16、BRCA1、BRCA2、 Rbl等。PTEN是迄今為此發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重磷酸酶功能的抑癌基因，在人類的惡性腫瘤 中廣泛存在突變(約25~50%)，如惡性神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、黑色素瘤、頭頸癌、腎癌等，尤其是 在甾體激素依賴性腫瘤中如前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、乳腺癌等，而PTEN 基因在子宮內(nèi)膜癌中的突變是所有惡性腫瘤中檢出率最高的，同時也是至今在子宮內(nèi)膜樣 腺癌中鑒定出的最常見的突變基因，突變率在36 %~83 %，在子宮內(nèi)膜癌前病變中也發(fā)現(xiàn) 有18~55%的突變率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] (一)解決的技術問題
[0006] 針對現(xiàn)有技術不足，本發(fā)明提供一種PTEN基因干擾慢病毒載體及其制備方法，制 備了 PTEN基因干擾慢病毒載體，轉染He 1 a細胞，He 1 a細胞內(nèi)PTEN基因的表達都有顯著下調(diào) 作用。
[0007] (二)技術方案
[0008] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)：
[0009] 一種PTEN基因干擾慢病毒載體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] S1、利用Age I和EcoR I酶切消化pGCSIL-GFP質(zhì)粒，凝膠電泳回收酶切線性化后的 載體質(zhì)粒，將4個siRNA干擾片斷分別與切線性化后的載體質(zhì)粒pGCSIL-GFP連接，再用冷卻 的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取180-200μ1轉移到無菌的微量離心管中，4只離心 管分別加2-4μ1連接液，輕輕旋轉以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘；
[0011] S2、將步驟S1中處理后的4只離心管放到預加溫到40-45°C的循環(huán)水浴中放好的試 管架上，靜靜放置90秒后快速將離心管轉移到冰浴中，冷卻1-2分鐘；
[0012] S3、向上述4支離心管中分別加800μ1 S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C，然 后將離心管轉移到37°C搖床上，溫育42-46分鐘使細菌復蘇，再將150μ1已轉化的感受態(tài)細 胞轉移到含20mmol/L MgS04和Amp抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上，將平板置于室溫直至液體被吸 收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，16小時；
[0013] S4、將4個siRNA干擾片斷連接pGCSIL-GFP質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物分別通過凝膠電泳鑒別 陽性克隆和陰性克隆，并挑選陽性克隆測序。
[0014] 優(yōu)選的，步驟S1所述利用Age I和EcoR I酶切消化pGCSIL-GFP質(zhì)粒，凝膠電泳回收 酶切線性化后的載體質(zhì)粒，將4個siRNA干擾片斷分別與切線性化后的載體質(zhì)粒pGCSIL-GFP 連接，再用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200μ1轉移到無菌的微量離心管 中，4只離心管分別加2μ1連接液，輕輕旋轉以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。
[0015] 優(yōu)選的，步驟S2所述4只離心管放到預加溫到42°C的循環(huán)水浴中放好的試管架上， 靜靜放置90秒后快速將離心管轉移到冰浴中，冷卻2分鐘。
[0016] 一種PTEN基因干擾慢病毒載體，所述載體轉染Hela細胞，利用Real-time PCR，對 PTEN基因干擾載體質(zhì)粒對目的基因干擾效果進行檢測。
[0017 ]優(yōu)選的，所述He la細胞內(nèi)PTEN基因的表達有下調(diào)作用。
[0018](三)有益效果
[0019 ]本發(fā)明提供一種PTEN基因干擾慢病毒載體及其制備方法，制備了 PTEN基因干擾慢 病毒載體，分別將4個siRNA干擾片斷，通過酶切位點與載體連接后，通過PCR產(chǎn)物凝膠電泳 鑒別挑選陽性克隆測序，還與pHelper 1.0、pHelper2.0兩種包裝質(zhì)粒共轉染293T細胞培 養(yǎng)，獲得重組慢病毒載體后，轉染目的細胞，再利用Real-time PCR，對4個PTEN基因干擾載 體質(zhì)粒對目的基因干擾效果進行了檢測，結果顯示，四個靶點對Hela細胞內(nèi)PTEN基因的表 達都有顯著下調(diào)作用，相對NC組，目的基因的表達水平下調(diào)達到85%，為進一步大量擴增提 取病毒奠定了基礎。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明質(zhì)粒簡化圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明輔助質(zhì)粒簡圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明PCR產(chǎn)物凝膠電泳鑒別挑選陽性克隆圖；
[0023]圖4為本發(fā)明Real-time PCR檢測四個PTEN基因干擾載體質(zhì)粒對目的基因干擾效 果圖；
【具體實施方式】
[0024]為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清