具有免疫作用的質(zhì)粒的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請日為2007年07月13日、申請?zhí)枮?00780029708.8、發(fā)明名稱為"具有 免疫作用的質(zhì)粒"的申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及具有免疫作用的質(zhì)粒。
【背景技術】
[0003] 質(zhì)粒來源的DNA可通過已知方法用于轉(zhuǎn)染原核和真核細胞。為此目的構(gòu)建的質(zhì)粒 一般由具有編碼某個蛋白的遺傳物質(zhì)的插入單元的骨架構(gòu)成，所述蛋白可提供或可不提供 其自身的生物學活性。
[0004] 所述質(zhì)?？梢允巧虡I(yè)來源的，其中攜帶特異性的部分根據(jù)在所述質(zhì)粒所指定的生 物體中待重建的某個特性被引入已經(jīng)知道和使用或自發(fā)產(chǎn)生（即通過組裝選擇的遺傳物質(zhì) 的片段)的結(jié)構(gòu)構(gòu)建體。
[0005]質(zhì)粒合成是對于獲得需要的細胞性能的目的具有基本重要性的操作。質(zhì)粒決定轉(zhuǎn) 染和轉(zhuǎn)基因蛋白合成的效率，并且也決定轉(zhuǎn)染的安全性，并由此在最終的分析中決定轉(zhuǎn)染 細胞的蛋白表達的綜合效率。
[0006] 質(zhì)粒是遺傳數(shù)據(jù)的載體，遺傳數(shù)據(jù)影響宿主細胞的細胞周期，并因此影響容納 (hosts)這些轉(zhuǎn)染的細胞的生物體的生命周期：向質(zhì)粒中引入的數(shù)據(jù)越多，在轉(zhuǎn)染過程中遇 到的風險越大。
[0007] 質(zhì)粒的特征在于所包含的數(shù)據(jù)的特異性:其復雜性越小，則其越易合成，其使用越 安全。
[0008] 質(zhì)粒執(zhí)行轉(zhuǎn)染細胞群體的能力，這或多或少自發(fā)地取決于細胞的類型和執(zhí)行轉(zhuǎn)染 的接觸/溫育實驗條件。質(zhì)粒對特定細胞群體的選擇性越強，其在安全條件下的用途越大。
[0009] 執(zhí)行轉(zhuǎn)染的條件對其成功具有決定作用：待轉(zhuǎn)染細胞的均質(zhì)性和濃度、溫育時間 和條件、使用特異性和選擇性方法監(jiān)控現(xiàn)象的可能性構(gòu)成了決定操作成功的極其重要的因 素。
[0010] 在使用質(zhì)粒在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)染待注射細胞的特異性情況下，對所述細胞的操作要極 其小心，因為它們必須重新插入患者，并且不能有危險和致命的間接現(xiàn)象:操作必須要少， 方法的安全性越高，結(jié)果的可重現(xiàn)性越大。
[0011] 由上所述，必然得出，使用具有降低的大小的質(zhì)粒，特別是如果與具有有限操作的 方法結(jié)合，是用于預防性和治療性目的的轉(zhuǎn)染中優(yōu)選的條件。
[0012] 在自體轉(zhuǎn)染方法中使用編碼免疫原性表位的質(zhì)粒是可用于在一些病理學中誘導 特異性免疫應答的系統(tǒng)之一，所述病理學的特征在于出現(xiàn)感染媒介（infecting agent)，或 在于自發(fā)的或誘導的細胞突變(致癌作用），并且選擇的細胞或細胞系的凋亡過程具有修 飾。
[0013] W0 90/09804描述了基因工程設計免疫球蛋白，其在所述免疫球蛋白的可變區(qū)或 結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達預定的肽表位。
[0014] W0 00/61766描述了端粒酶(telomerases)來源的腫瘤抗原，其可用于產(chǎn)生針對端 粒酶和因此針對腫瘤自身的T細胞介導的應答。
[0015] W0 00/64488描述了編碼嵌合的免疫球蛋白重鏈的質(zhì)粒，ρΝγινΗ62質(zhì)粒，其是通過 將鼠 VH62基因亞克隆至含有編碼人類γ殖定區(qū)的序列的ρΝ γ i質(zhì)粒獲得的。此質(zhì)?？赏ㄟ^ 在可變區(qū)的任何互補性決定區(qū)域（complementarity determining regions)引入異源表位 進行修飾。因此，公開了其在用于誘導免疫應答的方法中的應用。
[0016] 但是，如果將ρΝγινΗ62質(zhì)粒注射至人類，此質(zhì)粒含有有害的部分。此外，此質(zhì)粒的 大小使其獲得非常低的轉(zhuǎn)染產(chǎn)率(transfection yield)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明的目標體現(xiàn)為用于轉(zhuǎn)染真核和原核細胞的重組質(zhì)粒，其具有介于7和12千 堿基(kbase)的長度，并包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列。本發(fā)明的進一步目標體現(xiàn)為前 述質(zhì)粒用于在人類或動物生物體中誘導免疫應答的藥物制劑或疫苗制備的用途或治療性 處理的用途。
[0018] 特別地，所描述和要求保護的是用于構(gòu)建質(zhì)粒的堿基序列，所述質(zhì)?？捎糜冢?br>[0019] -轉(zhuǎn)染原核或真核細胞(間接體內(nèi)（ex vivo))的過程，所述原核或真核細胞可接種 于高等生物以誘導預防性或治療性免疫應答(特別是用具有序列SEQ ID NO. 1的質(zhì)粒1);
[0020] -基因免疫方法學中直接接種(direct inoculation)(體內(nèi)）于高等生物的方案， 以誘發(fā)預防性或治療性免疫應答(特別是用具有序列SEQ ID N0.2的質(zhì)粒2)。
[0021] 還描述了可使用所述質(zhì)粒治療的病理學特性(profile)。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1顯示質(zhì)粒1的圖譜。
[0024] 圖2顯示質(zhì)粒2的圖譜。
[0025] 圖3顯示質(zhì)粒⑶R的表位插入模型示意圖。
[0026] 圖4顯示具有本發(fā)明所述質(zhì)粒編碼的抗原性表位的蛋白質(zhì)的假想結(jié)構(gòu)。
[0027]圖5顯示質(zhì)粒的限制圖譜。
[0028]圖6顯示通過PCR測試從間接體內(nèi)轉(zhuǎn)染的淋巴細胞擴增質(zhì)粒。 具體實施方案
[0029] 本發(fā)明人現(xiàn)在開發(fā)了包含編碼免疫球蛋白的重鏈的序列的質(zhì)粒，當用于在人類或 動物生物體中體內(nèi)或間接體內(nèi)誘導免疫應答時，所述質(zhì)粒不存在ρΝ γ以此2質(zhì)粒的缺點。特 別地，所開發(fā)的質(zhì)粒具有更好的安全特性，并在轉(zhuǎn)染至細胞時顯示增加的產(chǎn)率。
[0030] 這些質(zhì)粒具有介于7和12千堿基、優(yōu)選地介于8和12千堿基、更優(yōu)選地介于9和11千 堿基和甚至更優(yōu)選地介于9和10千堿基的長度，并且在它們被轉(zhuǎn)染至淋巴細胞時能夠表達 免疫球蛋白的重鏈。
[0031] 根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，這些質(zhì)粒表達嵌合的免疫球蛋白重鏈，所述免疫球蛋 白重鏈優(yōu)選地包含鼠可變區(qū)和人類恒定區(qū)（優(yōu)選地igyl)。
[0032] 所述鼠可變區(qū)優(yōu)選地是產(chǎn)生自成年高免疫小鼠脾細胞的雜交瘤62的VH區(qū) (Zanetti等人J· Immunol ·，1983，131:2452)，下文稱作Vh62區(qū)。Vh62雜交瘤62分泌具有抗甲 狀腺球蛋白（anti-thyroglobulin)活性的單克隆抗體。
[0033] Igyl區(qū)基因優(yōu)選地克隆自載體ρΝγΙ。
[0034] 所述質(zhì)粒可進一步含有淋巴細胞特異性啟動子(優(yōu)選地大約50bp)，或病毒來源的 啟動子(優(yōu)選地CMV啟動子，以及優(yōu)選地大約742bp)。
[0035] 本發(fā)明的質(zhì)粒優(yōu)選地還包含多聚腺苷酸化序列AATAAA。
[0036]優(yōu)選的是本發(fā)明的質(zhì)粒不表達對β內(nèi)酰胺抗生素特別是氨芐青霉素的抗性和/或 不包含SV40的復制起點。
[0037]因此，所述質(zhì)粒優(yōu)選地含有大腸桿菌（Escherichia coli)的復制起點，優(yōu)選地 PBR322。此外，所述質(zhì)粒優(yōu)選地表達對新霉素的抗性。
[0038] 本申請進一步提供了一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒具有序列SEQ ID NO. 1或與SEQ ID NO. 1至少90 %同源、優(yōu)選地至少95 %同源的序列。
[0039] 本申請還提供了一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒具有序列SEQ ID N0.2或與SEQ ID NO. 2至少90 %同源、優(yōu)選地至少95 %同源的序列。
[0040] 在本發(fā)明進一步的實施方案中，所述質(zhì)粒的特征在于其可含有至少一個編碼抗原 性表位的序列。在本發(fā)明的另一些實施方案中，所述質(zhì)粒的特征在于所述抗原性表位可選 自 p540(ILAKFLHWL)、p572(RLFFYRKSV)、pY572(YLFFYRKSV)、p865(RLVDDFLLVWPpNP (ASNENMETM)〇
[0041] 本發(fā)明的優(yōu)選質(zhì)粒是質(zhì)粒1和2。
[0042] 質(zhì)粒l長9727bp(SEQIDN0.1和圖l)，質(zhì)粒2長10004bp(SEQIDN0.2和圖2)。所述 的兩種質(zhì)粒均編碼嵌合的免疫球蛋白重鏈。
[0043] 兩種質(zhì)粒間的唯一結(jié)構(gòu)差異是由特異性啟動子確定的，其在質(zhì)粒1的情況下為 50bp的淋巴細胞特異性啟動子，在質(zhì)粒2的情況下為大小742bp的病毒啟動子。
[0044] 所述質(zhì)粒的骨架由PSV2neo表示，其為一種含有新霉素抗性基因和復制起點 PBR322的細菌來源的DNA。
[0045] 編碼重免疫球蛋白鏈的基因序列主要由以下區(qū)域組成：
[0046]-大約2.5kb的鼠可變區(qū)（Vh62)，其最初克隆自分泌具有抗甲狀腺球蛋白活性的單 克隆抗體的小鼠雜交瘤(雜交瘤62) (Sollazzo等人，Eur.J. Immunol .，1989);
[0047] -產(chǎn)生自 ρΝ γ 1 載體（Hybritech