專利名稱：一種流感病毒疫苗種子株的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種流感病毒疫苗種子抹的制備方法，特別涉及一種利用腺病毒載體在Vera細(xì)胞中進(jìn)行流感病毒疫苗種子林的制備方法。
技術(shù)背景流感病毒隸屬于正粘病毒科，病毒基因組含有多個(gè)負(fù)鏈RNA ( 7-8節(jié)段) 組成，在曱、乙、丙三型中，曱型流感病毒可以通過(guò)抗原漂變和抗原重組兩種 方式進(jìn)行變異以逃避人群中已有的針對(duì)流感病毒的特異性免疫反應(yīng)，因此對(duì)人 類的威脅最大。近年來(lái)，禽流感時(shí)有爆發(fā)，并有多例人感染禽流感病毒H5N1 的報(bào)道，并且由于人群中沒(méi)有針對(duì)H5N1流感病毒的預(yù)存抗體存在，人群流行 病學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為高病死率。禽流感的爆發(fā)和流行是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大隱患。在抗擊流感病毒的過(guò)程中，雖然有抗流感藥物(如金剛烷胺，奧斯他韋 等)可供選擇，但是，由于流感病毒的高變異性，抗流感藥物的使用已導(dǎo)致耐 藥毒林的出現(xiàn)，預(yù)防和控制流感病毒爆發(fā)流行最有效的方法是疫苗免疫。每年的流感病毒疫苗抹的獲得均是通過(guò)反向遺傳學(xué)方法獲得。現(xiàn)有的反向 遺傳系統(tǒng)主要由12質(zhì)?；蛘?質(zhì)粒組成(參見(jiàn)如下文獻(xiàn)Fodor, E., Devenish, L.， Engelhardt, 0. G.， Palese, P., Brownlee, G. G" and Garcia-Sastre， A. (1999). Rescue of Influenza A Virus from Recombinant DNA. Wra/. 73(11), 9679-9682;該文獻(xiàn)中 文名為從重組DNA中拯救A型流感病毒；Neumann, G., Watanabe, T., Ito， H., Wat纖be, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R.， Donis, R.， Hoffinann, E.， Hobom， G., and Kawaoka， Y. (1999). Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Prac Ato/(/SJ 96(16), 9345-50;該文獻(xiàn)中文名為通過(guò)克 隆cDNA產(chǎn)生完整的A型流感病毒。Hoffmann, E.， Neumann, G., Kawaoka, Y,Hobom, G" and Webster, R. G. (2000). A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.Ato/ylcaJ V97(11)， 6108-13; 該 文獻(xiàn)中文名為通過(guò)8個(gè)質(zhì)粒產(chǎn)生A型流感病毒的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng))。因?yàn)橥瑫r(shí)轉(zhuǎn) 染12個(gè)或者8個(gè)質(zhì)粒進(jìn)入同一個(gè)細(xì)胞的效率比較低，所使用的細(xì)胞抹為比較容 易轉(zhuǎn)染的293T與MDCK混合細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)得到的病毒產(chǎn)量也不高。但是 293細(xì)胞系因?yàn)楹辛讼俨《镜腅l基因，可能會(huì)含有潛在的危險(xiǎn)成分，目前還 未被FDA批準(zhǔn)用于流感疫苗制備。非洲綠猴腎細(xì)胞才朱(Vera )已經(jīng)應(yīng)用于多種 病毒疫苗的生產(chǎn)，證明其安全性(可參見(jiàn)如下文獻(xiàn)Montagnon, B. J., Vincent-Falquet, J. C., and Saluzzo, J. F. (1999》Experience with vero cells at Pasteur Merieux Connaught. Dev ^awd 98, 137-40; discussion 167;該文獻(xiàn)中文 名為巴斯德梅里卡耐特公司關(guān)于Vero細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)之談)。并且實(shí)驗(yàn)證明Vero細(xì) 胞可以支持流感病毒的生產(chǎn)(可參見(jiàn)如下文獻(xiàn)Govorkova, E. A., Murti, G., Meignier， B., deTaisne， C., and Webster, R. G. (1996). African green monkey kidney (Vero) cells provide an alternative host cell system for influenza A and B viruses, owr"fl/ o/ F ro/ogv 70(8)， 5519-5524;該文獻(xiàn)中文名為非洲綠猴腎細(xì)胞林Vero細(xì) 胞可為A、 B型流感病毒的宿主細(xì)胞系)。Vero細(xì)胞生產(chǎn)的流感病毒疫苗具有與 傳統(tǒng)雞胚方式得到的流感病毒疫苗具有相同的免疫原性(可參見(jiàn)如下文獻(xiàn)Bruhl, P., Kerschbaum, A.， Kistner, O., Barrett, N., Dorner, F., and Gerencer， M. (2000). Humoral and cell-mediated immunity to Vero cell-derived influenza vaccine. J^cc/ e 19(9-10)， 1149-1158，該文獻(xiàn)中文名為源于Vero細(xì)胞的流感疫苗的體液和細(xì)胞免 疫反應(yīng))。因?yàn)閂ero細(xì)胞比較難以通過(guò)質(zhì)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染方式接受外源基因，以現(xiàn)有 的流感病毒質(zhì)粒系統(tǒng)在Vero細(xì)胞中得到的病毒產(chǎn)量很低(可參見(jiàn)文獻(xiàn)Fodor， E., Devenish, L., Engelhardt, O. G, Palese, R, Brownlee, G. G., and Garcia-Sastre， A. (1999). Rescue of Influenza A Virus from Recombinant DNA. / H'ra/. 73(11)， 9679-9682,該文獻(xiàn)中文名為從重組DNA中拯救A型流感病毒)。有時(shí)候需要借 助于電轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行病毒拯救(可參見(jiàn)文獻(xiàn)Horimoto， T., Murakami, S., Muramoto, Y" Yamada, S.， Fujii， K., Kiso, M., Iwatsuki-Horimoto， K., Kino, Y" and Kawaoka, Y. (2007). Enhanced growth of seed viruses for H5N1 influenza vaccines.Wra/ogv 366(1)， 23-7.該文獻(xiàn)中文名為H5N1流感疫苗種子 f朱的加強(qiáng)生長(zhǎng))。因此非常有必要開發(fā)出一種可以在Vero細(xì)胞中拯救產(chǎn)生疫苗種子林的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于克服上述技術(shù)缺陷，提供一種流感病毒疫苗種子林 的制備方法，克服了通過(guò)質(zhì)粒方式轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞進(jìn)行流感病毒拯救的低效率。 同時(shí)采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與病毒感染相結(jié)合的方法，保證了流感病毒拯救的靈活性。本發(fā)明的目的是按以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種流感病毒疫苗種子抹的制備方法為將拯救組合物感染或轉(zhuǎn)染到至少 一個(gè)宿主細(xì)胞中，其中，拯救組合物包含四個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺 病毒載體，或三個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體和兩個(gè)分別攜帶HA 基因和NA基因的質(zhì)粒。所述的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞林。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞為Vero細(xì)胞。優(yōu)選地，所述的四個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體為 Ad5-lN-PB2+NS、 Ad5-IN-PB1+M、 Ad5-IN-PA+NP和Ad5誦IN-HA+NA。優(yōu)選地，所述的三個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體為 Ad5-IN-PB2+NS、 Ad5-IN-PB1+M和Ad5 -IN-PA十NP。優(yōu)選地，所述的腺病毒載體包含一種具有啟動(dòng)效率一致的串連hCMV/hPol I 雙向啟動(dòng)子DNA結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，所述的攜帶HA基因的質(zhì)粒為pPolI-VN-1194HA質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述的pPolI-VN-1194HA質(zhì)粒，其HA氨基酸序列中的堿性裂解 位點(diǎn)由RRRKK突變?yōu)镮。優(yōu)選地，所述的流感病毒包括曱型、乙型、丙型流感病毒。上述的具有雙向啟動(dòng)能力的hCMV/hPol I的DNA結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)上依次含有 正向的人的CMV病毒II型啟動(dòng)子序列(hCMV)，反向丁型肝炎核酶序列(HDV(R))，反向人PolI啟動(dòng)子序列與牛生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列(BGH)。 在插入流感病毒的基因組片段后，可以通過(guò)hCMV啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄得到信使RNA(message RNA， mRNA ),其含有5'帽子結(jié)構(gòu)和3，的PolyA結(jié)構(gòu)，可以利用宿 主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，進(jìn)一步表達(dá)出流感病毒的蛋白，同時(shí)可以通過(guò)反向插入的 hPol I啟動(dòng)子從反方向啟動(dòng)流感病毒基因組病毒RNA (viral RNA, vRNA)的轉(zhuǎn) 錄，其中hPolI可以準(zhǔn)確起始流感病毒vRNA的起始，反向(HDV(R))序列可 以準(zhǔn)確終止這個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而得到與流感病毒基因組結(jié)構(gòu)完全相同的單負(fù)鏈 RNA序列。此結(jié)構(gòu)如圖IA所示。通過(guò)上述的hCMV/hPol I的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建一種穿梭質(zhì)粒。該穿梭質(zhì)粒包括 兩個(gè)串聯(lián)的雙向啟動(dòng)的hCMV/hPol I的DNA結(jié)構(gòu)，其兩個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)的連接序列 為fl噬菌體的單鏈DNA轉(zhuǎn)錄序列(Fl ), Fl序列可以保證兩個(gè)啟動(dòng)子的啟動(dòng)效 率一致。即，在用于流感病毒拯救過(guò)程中，可以兩個(gè)表達(dá)盒中，保證轉(zhuǎn)錄得到 的mRNA與vRNA兩個(gè)病毒基因組片段的比例為1:1與天然存在的序列一致。通過(guò)上述的包括兩個(gè)串聯(lián)的雙向啟動(dòng)的hCMV/hPol I的DNA結(jié)構(gòu)的穿核差 粒構(gòu)建一種腺病毒載體，該腺病毒載體包含上述的含有上述兩個(gè)串聯(lián)的雙向啟 動(dòng)的hCMV/hPol I的DNA結(jié)構(gòu)。其中每個(gè)腺病毒載體含有兩個(gè)流感基因組片段。 構(gòu)建得到四個(gè)腺病毒載體為Ad5 -IN-PB2+NS, Ad5 -IN-PB1+M, Ad5 -IN-PA+NP, Ad5 -IN-HA+NA。優(yōu)選地，使用四個(gè)腺病毒載體制備新的曱型流感病毒種子疫苗抹的方法可 按如下步驟進(jìn)行Vero細(xì)胞進(jìn)行腺病毒感染，感染3-6h后，更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基 中含有TPCK胰酶，促進(jìn)流感病毒從細(xì)胞表面的釋放。得到的細(xì)胞上清，接種 10日齡雞胚。48h后檢測(cè)雞胚尿囊液中的HA血凝(具體方法參見(jiàn)郭元吉程小 雯著《流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第88頁(yè)，第100頁(yè))。優(yōu)選地，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和腺病毒感染相結(jié)合的流感病毒種子疫苗林制備方 法，該方法可按如下步驟進(jìn)行兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，其中 一個(gè)質(zhì)粒攜帶流感病毒H5N1越南抹(VN)l 194的HA基因(其中HA的改造過(guò)程中去除了堿性裂解位點(diǎn)RRKK,改為I),另 一個(gè)攜帶NA基因。轉(zhuǎn)染更換為新鮮培養(yǎng)基后，用Ad5-IN-PB2+NS 、 Ad5-IN-PB1+M和Ad5-IN-PA+NP三個(gè)腺病毒共同感染轉(zhuǎn)染有HA和NA質(zhì)粒的 細(xì)胞。感染3-6h后，更換為無(wú)血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有TPCK胰酶，促進(jìn) 流感病毒從細(xì)胞表面的釋放。得到的細(xì)胞上清，接種10日齡雞胚。48h后檢測(cè) 雞胚尿嚢液中的HA血凝(具體方法同上《流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第 88頁(yè)，第100頁(yè))，從得到的雞胚尿嚢液中提取病毒基因組RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 然后用針對(duì)NA的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增得到的片段經(jīng)過(guò)酶切鑒定。 本發(fā)明的有益效果在于使用四個(gè)腺病毒載體制備的流感病毒種子疫苗抹， 或利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和腺病毒感染相結(jié)合的方法制備流感病毒種子疫苗林，提高現(xiàn) 有的流感病毒質(zhì)粒系統(tǒng)在Vera細(xì)胞中的病毒產(chǎn)量，而且得到的重組流感病毒安 全性高。


圖1是本發(fā)明的串聯(lián)雙向hCMV/hPolI啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2-l，圖2-2是本發(fā)明的串連啟動(dòng)子啟動(dòng)效率示意圖； 圖3-1，圖3-2，圖3-3是本發(fā)明的腺病毒載體質(zhì)粒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的鑒 定圖；圖4是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pPol I-VN-1194HA的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的測(cè)序鑒定圖；圖5是本發(fā)明的流感病毒拯救示意圖；圖6是本發(fā)明的拯救流感病毒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的PCR鑒定示意圖。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例1:含有串連CMV/PolI雙向表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建。以pCDNA4To( invitrogen公司)為模板，以引物Fl(1308+21)與Fl(1757-19)為引物對(duì)，擴(kuò)增得到F1片段，其中5'端引入MluI位點(diǎn)，3'端引入Spe[位點(diǎn)。 通過(guò)Mlu與Spe I酶切插入pGAl-EGFP質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室j呆存)，得到 pGAl-Fl-EGFP。 Spe I, Xba I與Nhe I三個(gè)酶切割產(chǎn)生的末端相同，且相互連 接后酶切位點(diǎn)消失，該技巧在下述操作中多次使用。以pPolI質(zhì)粒為模板，以 Pol-I(2071+22)與Pol-I(2587-18)為引物擴(kuò)增得到含有人類Pol I啟動(dòng)子和丙型肝 炎病毒核酶序列(HDV ( R))的片段，其中Pol I —段引入Spe I位點(diǎn)，HDV ( R) 一端引入BamH I位點(diǎn)。此PCR片段經(jīng)過(guò)Spe I與BamH I雙酶切后插入到經(jīng) Xba I與BamH I雙酶切的pGAl-Fl-EGFP質(zhì)粒，得到pGAl-Fl-Pol 1質(zhì)粒。
相類似地，以pPolI質(zhì)粒為模板，以Pol-I(2071+22)與Pol-1(2587-18)為引 物擴(kuò)增得到含有人類Pol I啟動(dòng)子和丙型肝炎病毒核酶序列(HDV ( R))的片段， 其中PolI—段引入NheI , Spel位點(diǎn)，HDV ( R) —端引入BamH I位點(diǎn)。此 PCR片段經(jīng)過(guò)Nhe I與BamH I雙酶切后插入到經(jīng)Xba I與BamH I雙酶切的 pGA 1 -F1 -EGFP質(zhì)粒，得到pGA 1 -F1 -Spe I質(zhì)粒。
以得到的pGAl-Fl-Spe I質(zhì)粒為模板，以pGAl-CMV(7491+19)與 pGAl-BGH(1030-18)為引物對(duì)，擴(kuò)增得到含有CMV到BGH的序列，在CMV 的5，端引入了 Mlu I位點(diǎn)，在BGH序列3，端引入了 Nhe I位點(diǎn)。以Mlu I與Nhe I雙酶切得到，插入到經(jīng)Mlu I與Spe I雙酶切的pGAl-Fl-Pol I質(zhì)粒，得到 pShuttle-IN穿才炎質(zhì)粒。
F1 (1308+21): TacacgcgtacgGATATCGCC ACTAGTCTGAGG F1 (1757-19): tactctagaTTAACCAATAGGCCGAAAT Pol-I(2071+22) : AACAGCTATGACCATGATTACG Pol-I(2587誦18) : TGactagtGTGCTGCAAGGCGATTAA pGAl-CMV(7491+19): ACTACGCGT tgtacgggccagatatacg pGAl-BGH( 103 0隱18): CATGCTAGC ccgcctcagaagccatag
實(shí)施例2:含有兩個(gè)流感病毒基因片段的腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建與病毒拯救。 流感病毒的質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，每個(gè)流感基因片段的兩端均有Pol I啟動(dòng)子和HDV ( R)序列。pPol I-PB2與pPol I-NS分別經(jīng)過(guò)Xba I酶切得到PB2片段與 NS片段，pShuttle-IN首先經(jīng)過(guò)Spe I單酶切，插入PB2片段，得到 pShuttle-IN-PB2 , 此質(zhì)粒再經(jīng)過(guò)Xba I酶切，插入NS片段得到 pShuttle-IN-PB2+NS。同樣的方法得到，pShuttle-IN-PBl+M， pShuttle-IN-PA+NP, pShuttle-IN-HA+NA, pShuttle-IN-PB 1+EGFP, pShuttle-IN-EGFP+PB 1 。
四個(gè)穿梭質(zhì)粒分別經(jīng)過(guò)SgrA I線性化，與Cla I線性化的pAd5El-E3-進(jìn) 行重組。得到腺病毒質(zhì)粒，pAd5-IN畫PB2+NS, pAd5畫IN-PBl+M, pAd5隱IN-PA+NP, pAd5畫IN-HA+NA。 ^口圖1B所示。
具體方法為lug線性化Shuttle-IN質(zhì)粒與0.5ug Cla I線性化的 pAd5El-E3-混合，轉(zhuǎn)化0.1ml BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min后，42。C熱沖擊 60sec,迅速水浴lmin，加入lml無(wú)抗性培養(yǎng)基，37。C孵育45min，涂布到含有 Amp抗生素LB瓊脂固體平板。37。C孵育12-16h,挑取單克隆，到含有Amp抗生 素LB液體培養(yǎng)基，利用堿裂解方法提取質(zhì)粒(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2頁(yè))， 電泳選擇是大質(zhì)粒的克隆，再次轉(zhuǎn)化XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞，方法同BJ5183的轉(zhuǎn) 化操作相同。
提取的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切鑒定得到正確的質(zhì)?？寺。鐖D3-l、圖3-2、圖3-3 所示，酶切大小分別為
pAd隱PA+NP Mlu 1:18418,7907,5845,4305,1797， 1134; pAd-PA+NP Xbal: 25489,12013,1904; pAd5畫PBl+MMM: 18009,7907, 5845,4305, 1797， 1134; pAd5-PBl+MXbal: 25489, 12142,1366;
pAd-HA+NA coR I+Xba I:16742, 9321, 5958, 2255, 2019,1752, 770; pAd5畫PB2+NS bal+EcoRI: 16742,10340,5958,2019,1802,1229,770。
病毒的拯救與生產(chǎn)參見(jiàn)Shiver, J. W.， Fu， T. M., Chen, L., Casimiro, D. R., et al. (2002). Replication-incompetent adenoiral vaccine vector elicits effective anti-immunodeficiency-virus immunity. Nature 415(6869》331-5。 該文獻(xiàn)中文名為 不完全復(fù)制腺病毒疫苗載體產(chǎn)生的有效的抗免疫缺陷病毒的免疫性。實(shí)施例3:串耳關(guān)啟動(dòng)子效率比專交
6孔培養(yǎng)板，293細(xì)胞，90%融合度，利用Lipotransfectamine2000轉(zhuǎn)染試 劑(Invitrogen公司)，分別轉(zhuǎn)染pShuttle-IN-PBl+EGFP, pShuttle-IN-EGFP+PB 1 質(zhì)粒各4ug。轉(zhuǎn)染方法遵照操作說(shuō)明。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)進(jìn)行，使用流式細(xì)胞儀檢 測(cè)EGFP的表達(dá)水平具體方法參照文獻(xiàn)，Hoffmann, E., Neumann, G., Hobom, G., Webster, R. G., and Kawaoka, Y. (2000a). "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template. Virology 267(2), 310-7。該文獻(xiàn)的中文名為產(chǎn)生A型流感病毒的"雙義"方法乂人同一模板合 成病毒RNA和信使RNA。得到的結(jié)果如圖2-1,圖2-2所示，表明兩個(gè)串聯(lián)啟 動(dòng)子的啟動(dòng)效率一致。
實(shí)施例4: pPolI-1194HA與pPolI-1194NA質(zhì)粒的構(gòu)建。 VN-1194HA與VN-1194NA序列，進(jìn)行合成(TaKaRa生物公司，大連)。本 實(shí)驗(yàn)室保存。宜VN-1194HA為模板，以Sapl-H5-1與SapI-H5-1025R為引物對(duì)， 擴(kuò)增得到HA序列中石咸性裂解位點(diǎn)上游的序列；以Sapl-H5-1020與 SapI-H5-1778R為引物對(duì)，擴(kuò)增得到堿性裂解位點(diǎn)下游序列，兩個(gè)片段經(jīng)過(guò)SapI 酶切，連接插入到Sap I酶切后的pPol I質(zhì)粒，得到pPol I-VN-1194HA,其中核 酸序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中的堿性裂解位點(diǎn)RRRKK被去除，突變?yōu)橐粋€(gè)I 氨基酸，表達(dá)得到的HA蛋白被減毒。構(gòu)建質(zhì)粒測(cè)序鑒定，表明RRRKK被去除， 構(gòu)建成功，如圖4所示。
Sapl-H5隱l: 5'-GATCGCTCTTCAGCCAGCAAAAGCAG-3， Sapl-H5-1025R: 5 ，-GATCGCTCTTCACGAGTCTCTCTTTGAGG-3' Sapl-H5-1020: 5 ，-GATCGCTCTTCGTCGAGGATTATTTGGAGC誦3' Sapl-H5隱1778R: 5 ，-CATCGCTCTTCTATTAGTAGAAACAAGGGTGT畫3' 同樣方法，VN-1194NA為模板，以Sapl-Nl-1與SapI-Nl-1398R為引物對(duì)，擴(kuò) 增得到，含有Sap I酶切位點(diǎn)的片段，片段經(jīng)過(guò)Sap I酶切，連接插入到Sap I酶切后的pPol I質(zhì)粒，得到pPol I-VN-1194NA。
SapI陽(yáng)Nl-l: 5，-5'-GATCGCTCTTCGGCCAGCAAAAGCAGGAG-3，
Sapl-Nl-1398R: 5，-CATCGCTCTTCTATTAGTAGAAACAAG-3'
實(shí)施例5:流感病毒的拯救示意圖
如圖5所示為流感病毒的拯救示意圖。將使用四個(gè)腺病毒載體Ad5 -IN-PB2+NS, Ad5 -IN-PB1+M, Ad5 -IN-PA+NP, Ad5 -IN-HA+NA感染Vero細(xì)胞， 或者利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和腺病毒感染相結(jié)合的流感病毒種子疫苗林制備方法兩個(gè) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，其中一個(gè)質(zhì)粒攜帶流感病毒H5N1越南株(VN)1194的HA 基因(其中HA的改造過(guò)程中去除了堿性裂解位點(diǎn)RRKK,改為I),另一個(gè)攜 帶NA基因。轉(zhuǎn)染更換為新鮮培養(yǎng)基后，用Ad5-IN-PB2+NS、 Ad5-IN-PB1+M 和Ad5-IN-PA+NP三個(gè)腺病毒共同感染轉(zhuǎn)染有HA和NA質(zhì)粒的細(xì)胞。
使用含10 % FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行Vero細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。24 孔培養(yǎng)板中，80-90%飽和度的Vero細(xì)胞用不同濃度的上述腺病毒進(jìn)行感染，3h 后，含病毒的培養(yǎng)基更換為10%FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，6-8h后，去 除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用Hanks培養(yǎng)液徹底洗去殘留的培養(yǎng)基，然后加入0.5ml 含有l(wèi)ug/ml的TPCK胰酶(Fluka公司)。此后每隔24小時(shí)，加入0.5ul lmg/ml 的TPCK胰酶，保證培養(yǎng)上清的TPCK終濃度為lug/ml。 12h, 24h, 36h, 48h， 60h分別收集培養(yǎng)上清。取200ul接種10日齡雞胚，48h后測(cè)定雞胚尿囊液中的 HA效價(jià)，并進(jìn)行RT-PCR鑒定。
實(shí)施例6: H5N1流感疫苗抹種子病毒的生產(chǎn)
兩個(gè)1.5ml離心管中分別加入600ul OptiMEMI (Gibico公司)，然后一份 中分別加入2ugpPo11-1194HA與2ugpPo11-1194NA質(zhì)粒并充分混勻；另外一份 加入8ul LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑，并充分混勻。室 溫靜止5min后將DNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液混合。室溫靜止20 min-30min。與 此同時(shí)，70-90%飽和度的Vero細(xì)胞，用0.25%胰酶EDTA消化處理，得到單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，106個(gè)細(xì)胞分裝到1.5ml離心管，300g離心5min,棄去離 心上清，用1 ml Hanks洗液重懸細(xì)胞，再次離心一次300g離心5min,棄上清。 用含有DNA和轉(zhuǎn)染試劑的混合液重懸細(xì)胞。然后加入到六孔板的培養(yǎng)孔中。6h 后，細(xì)胞已經(jīng)完全貼壁，更換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后12h,培養(yǎng)液更新為含有病 毒劑量200-400 VP/AdV/Ce11 。以下步驟同實(shí)施例5 。
實(shí)施例7:重組PR8病毒與減毒H5N1(VN1194)病毒的PCR檢測(cè) 各取200ul雞胚尿嚢液，按照標(biāo)準(zhǔn)的方法Trizol方法(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 第518頁(yè))進(jìn)行病毒RNA提取，提取后用流感病毒的通用引物Unil2進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，反轉(zhuǎn)錄條件42°C孵育lh,然后用針對(duì)NA片段的特異性引物Sapl-Nl-1 與SapI-Nl-1398R (同實(shí)施例5 pPol I-1194NA質(zhì)粒構(gòu)建)進(jìn)4亍PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增 得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Bgl II與EcoR V酶切鑒定，結(jié)果如圖6所示。圖6中 PR8NA表示PR8病毒的NA片段，VN-NA表示減毒H5N1(VN1194)病毒的NA 片段，E表示用EcoRV酶切，B表示用BglII酶切。 引物序列Unil2:AGCAAAAGCAGG。
以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限 制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)
理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)
方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1、一種流感病毒疫苗種子株的制備方法，其特征在于，該方法為將拯救組合物感染或轉(zhuǎn)染到至少一個(gè)宿主細(xì)胞中，其中，拯救組合物包含四個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體，或三個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體和兩個(gè)分別攜帶HA基因和NA基因的質(zhì)粒。
2、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng) 物細(xì)胞才朱。
3、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為Vero 細(xì)胞。
4、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的四個(gè)分別攜帶兩個(gè) 流感病毒片段的腺病毒載體為Ad5-IN-PB2+NS 、 Ad5-IN-PB1+M 、 Ad5 -IN-PA+NP和Ad5-IN陽(yáng)HA+NA。
5、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的三個(gè)分別攜帶兩個(gè) 流感病毒片段的腺病毒載體為Ad5-IN-PB2+NS 、 Ad5-IN-PB1+M和Ad5 -IN-PA十NP。
6、 如權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述的腺病毒載體包 含一種具有啟動(dòng)效率一致的串連hCMV/hPol I雙向啟動(dòng)子DNA結(jié)構(gòu)。
7、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的攜帶HA基因的質(zhì) 粒為pPolI-VN-1194HA質(zhì)粒。
8、 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的pPolI-VN-1194HA 質(zhì)粒，其HA氨基S臾序列中的堿性裂解位點(diǎn)由RRRKK突變?yōu)镮。
9、 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的流感病毒包括曱型、 乙型、丙型流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種流感病毒疫苗種子株的制備方法，將拯救組合物感染或轉(zhuǎn)染到至少一個(gè)宿主細(xì)胞，如Vero細(xì)胞中，其中，拯救組合物包含四個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體，或三個(gè)分別攜帶兩個(gè)流感病毒片段的腺病毒載體和兩個(gè)分別攜帶HA基因和NA基因的質(zhì)粒。腺病毒載體是利用構(gòu)建的含有hCMV/hPol I雙向啟動(dòng)子而進(jìn)一步構(gòu)建而成的，并攜帶流感病毒基因組片段。該方法可以在Vero細(xì)胞中靈活地拯救出減毒流感病毒疫苗株。本發(fā)明提高現(xiàn)有的流感病毒質(zhì)粒系統(tǒng)在Vero細(xì)胞中的病毒產(chǎn)量，而且得到的重組流感病毒安全性高。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101302499SQ200810029130
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者鋒 李, 楊化強(qiáng), 潘蔚綺, 凌 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院