專利名稱：人腦鈉肽二聯(lián)體[(BNP)₂]與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人腦鈉肽二聯(lián)體[(BNP)2]與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效融合蛋白藥物 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦鈉肽(Brain Natriuretic P印tide， BNP)是由Sudoh等在1988年在豬腦中發(fā)現(xiàn)的利鈉多肽家族成員， 它主要由心室分泌合成，前體含有108個氨基酸，力n.L:后釋放出含有32個氨基酸的成熟BNP分子。BNP 的主要特性是拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用，即通過抑制腎素和醛固酮的分泌，增加腎小球濾 過率和抑制腎髓質(zhì)集合管鈉重吸收促進排鈉、利尿。還可通過直接松弛血管平滑肌和拮抗血管緊張素II的
作用而擴張血管，抑制平滑肌細胞增生影響血管重塑。靜脈給予BNP能降低心力衰竭患者肺毛細血管楔 壓(PCWP)、右心房壓力、體循環(huán)血管阻力(SVR)，并能減輕水鈉潴留，迅速改善血流動力學(xué)狀態(tài)。2001 年8月美國FDA批準(zhǔn)了重組人腦鈉肽(rhBNP)藥物一奈西立肽(nesiritide)用于臨床治療急性心力衰竭。 2005年10月，我國也上市了 rhBNP (商品名新活素)。
像臨床上已廣泛使用的其它重組多肽/蛋A類藥物一樣，重組BNP藥物溶解度低、穩(wěn)定性差、體內(nèi)半 衰期僅為22min，必須持續(xù)高劑量給藥方能奏效。該類藥物治療費用高、藥物利用度低，患者頻繁注射， 導(dǎo)致其實際用量遠地低于需求量。提示有必要重視長效BNP藥物的研發(fā)，滿足臨床應(yīng)用的需要。
HSA作為人體血漿的主要成分在體內(nèi)具有無酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期長(大約23天) 等優(yōu)點。以HSA為載體的融合蛋白技術(shù)(Albumin Fusion Technology)受到重視。將HSA基岡和人干擾 素a2b (IFNa2b)基因融合，表達的融合蛋白HSA-IFNa2b在體內(nèi)的平均半衰期達140h，且有很好的抗病 毒活性、安全性和耐受性。這種融合蛋白質(zhì)一方面增加了藥物分子量，降低了腎臟的排泄速率；另一方面， 融合的蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，減低血液中蛋白水解酶對普通lFNa2b的水解作用，從而有效地 延長了蛋白分子藥物在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的滁留時間。通過改變藥物的藥代動力學(xué)特性，使得藥物的血漿濃度更 加穩(wěn)定，藥物在體內(nèi)維持的時間更長，從而達到提高藥物療效和降低副作用的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品。本發(fā)明的融合蛋白 在保持了人腦鈉肽的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的技術(shù)方案人工合成(BNP)2 cDNA;通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA; 利用重疊PCR技術(shù)，連接(BNP)2 cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(BNP)rHSA cDNA 融合基因插入到克隆載體pBlu2KSP中保存；(BNP)2-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿 主細胞中進行表達。
(BNP)2 cDNA的克隆，HSAcDNA的克隆，(BNP)2 cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆，融合蛋白
(BNP)2-HSA的重組酵母構(gòu)建和融合蛋白(BNP)rHSA的表達的步驟詳見具體實施方法。
用上述方法制備的人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人腦鈉肽至少85%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85%序列同源的第二區(qū)或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區(qū)；所述與人腦鈉肽 同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不 加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人腦鈉肽同源的第一 區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
優(yōu)選的是所述融合蛋白包括與人腦鈉肽至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少95%序列 同源的第二區(qū)。
所述融合蛋白的第二區(qū)可以由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成、經(jīng)結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成， 包括所有HSA天然存在的多態(tài)型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA (l-n)， n 為369-419。
所述融合蛋白包括與人腦鈉肽氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的 第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或 加入得到的多肽。
宿主細胞是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞等。優(yōu)選的宿主細胞是酵母。優(yōu)選的酵母是 畢赤酵母。優(yōu)選的畢赤酵母是畢赤酵母GS115。
由于(BNP)2基因較短，采用人工合成該基因。HSA cDNA可以通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增 獲得。利用重疊PCR技術(shù)，連接(BNP)2 cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽 加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫原性方面的問題，得到的(BNP)2 cDNA和HSAcDNA融合基因插入到 克隆載體中保存。
(BNP)2cDNA和HSAcDNA融合基因可以在多個宿主系統(tǒng)中表達，如細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細 胞、植物細胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲等)等。在這些表達系統(tǒng)中目的基因被整合到宿主的染色體 中或插入到質(zhì)粒中。本發(fā)明優(yōu)選的是酵母表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)除了具備原核表達系統(tǒng)的易操作、生長迅速、 營養(yǎng)要求簡單、易工業(yè)放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組 蛋白。更優(yōu)選的是畢氏酵母表達系統(tǒng)，和釀酒酵母表達系統(tǒng)相比，畢氏酵母表達系統(tǒng)在蛋白分泌和糖基化 方面具有明顯的優(yōu)勢。畢氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超 糖基化帶來的免疫源性問題。
畢氏酵母表達系統(tǒng)分泌型表達載體主要有pPIC9， pPIC9K， pHIL-Sl, pPICZa, pYAM75P6;胞內(nèi)型 表達載體主要有pPIC3K， pPICZ， pHWOlO， pGAPZ， pGAPZa (invitrogen)等，優(yōu)選的是畢赤酵母分 泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標(biāo)記基因HIS4、 A0X1啟動子、MF a分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標(biāo)記)等元件。A0X1啟動子是一個強啟動子，可以 高效的啟動目的基因的表達。在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶AOXl和AOX2，細胞中絕大多數(shù)乙醇 氧化酶的活力是由AOXl提供。在甲醇為唯一碳源培養(yǎng)的細胞中，該酶可占細胞總蛋白的30%以上。AOX2 與AOX1的同源性雖然高達97%，但酶活很低。當(dāng)AOXl基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧 化酶活力喪失，細胞利用甲醇能力降低，細胞在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長很慢。
帶有融合cDNA的表達載體可以通過轉(zhuǎn)化鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)體法或電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主細胞。成
功轉(zhuǎn)化的細胞，即帶有本發(fā)明構(gòu)建的DNA的細胞，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法加以鑒定，如收集細胞，
裂解后提取DNA，然后進行Southern雜交和PCR鑒定，也可在誘導(dǎo)表達后用HSA抗體和/或BNP抗體檢測培養(yǎng)液上清。
本發(fā)明的有益效果
利用重疊PCR技術(shù)，連接(BNP)2 cDNA和HSAcDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加 入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優(yōu)選的酵母表達系統(tǒng)除了具備原核表達系統(tǒng)的易操作、生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、易工業(yè)放大的特點 外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組蛋白。更優(yōu)選的是畢赤酵母表達系 統(tǒng)，和釀酒酵母表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優(yōu)勢。畢赤酵母自 身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明構(gòu)建的DNA的宿主細胞，來生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。宿主細胞培養(yǎng)優(yōu)選在 生物反應(yīng)器上進行，培養(yǎng)分兩個階段，第一階段主要用于宿主細胞生長，第二階段主要用于產(chǎn)物合成。可 以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白。如離心、鹽析、 超濾、層析、制備電泳等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。


圖1.質(zhì)粒pPIC9K-(BNP)2-HSA結(jié)構(gòu) 圖2.質(zhì)粒pPIC9K-(BNP)2-HSA構(gòu)建
圖3. (BNP)2-HSA的重疊PCR產(chǎn)物 M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1: (BNP)2的PCR產(chǎn)物；Lane 2: HSA 的PCR產(chǎn)物；Lane 3: (BNP)2-HSA的重疊PCR產(chǎn)物；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)
圖4. (BNP) 2-HSA融合蛋白的SDS-PAGE分析 M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane 1:空質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn) 化發(fā)酵上清；Lanel:質(zhì)粒pPIC9K-(BNP) rHSA轉(zhuǎn)化發(fā)酵上清
圖5. (BNP) 2-HSA融合蛋白的BNP和HSA抗體檢測(Western blot) Lane 1: (BNP)
2-HSA融合蛋白與HSA抗體雜交；Lane 2:對照((GLP-l)rHSA融合蛋白與BNP抗體雜交)Lane 3: (BNP) 2-HSA融合蛋白與BNP抗體雜交；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)
具體實施方法
實施例l: (BNP)2 cDNA的克隆
由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司人工合成(BNP)2 cDNA (195bp)，將其克隆到載體pBlu2KSP 上，插入位點為SwaI，受體菌為大腸桿菌JM109菌株。 實施例2: HSAcDNA的克隆
利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為 PHI: 5，-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3， PH2: 5，-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3'
PCR反應(yīng)體系lO^imol/L的PHI和PH2引物各1.5^1， 2.5mmol/L的dNTP化l， lOxpfu Buffer 5^il， 5U/nl的pftiDNA聚合酶0.5^11,人胎肝cDNA文庫l嗎，加雙蒸水補齊50nl。 PCR反應(yīng)程序95'C預(yù)變 性5分鐘；94'C變性1分鐘，60'C退火1分鐘，72'C延伸3分鐘，循環(huán)30次；72。C延伸10分鐘。
瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的
目的片斷。純化好的目的片斷和載體pBlu2KSP分別經(jīng)&/I和州Win雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR片段膠回收試劑盒回收目的片斷。T4 DNA連接酶連接經(jīng)雙酶切的HSA cDNA和載體pBlu2KSP,連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100ng/ml氨節(jié)青霉素的LB瓊脂 平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種于20ml含100ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過 夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。采用PCR擴增，Sa/I和州' K/ni雙酶切鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì) 粒1和ifi"c/ III雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍于-80'C 。 重組質(zhì)粒命名為pBlu2KSP-HSA,陽性重組子命名為JM109/pBlu2KSP-HSA。 實施例3: (BNP)2cDNA和HSAcDNA融合基因的克隆
(1) (BNP)2 cDNA的PCR擴增，所用引物如下
PB1: 5，-GCGCGCGAATTCAAAAGATCTCCAAAGATGGTCCAAGG-3， PB2: 5,-ACCTCACTCTTGTGTGCATCGTGACGTCTCAGGACCTTGC-3;
PCR反應(yīng)體系1Onmol/L的PB1和PB2引物各1.5^1， 2.5mmol/L的dNTP—l, 10xpfu Buffer 5^1， 5U/nl 的pfiiDNA聚合酶0.5nl，質(zhì)粒模板pBlu2KSP-(BNP)2 lng,加雙蒸水補齊50W。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù) 變性5分鐘；94'C變性1分鐘，65'C退火1分鐘，72'C延伸30秒，循環(huán)30次；72'C延伸10分鐘。
(2) HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下
PH3: 5'-GCAAGGTCCTGAGACGTCACGATGCACACAAGAGTGAGGT-3' PH4: 5'-CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3，
PCR反應(yīng)體系1Opmol/L的PH3和PH4引物各1.5^1， 2.5mmol/L的dNTP4nl， 10xpfo Buffer 5pl, 5U/nl的pfUDNA聚合酶0.5nl，質(zhì)粒模板pBlu2KSP-HSA lng,加雙蒸水補齊50^1。 PCR反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性5分鐘；94'C變性1分鐘，65'C退火1分鐘，72'C延伸3分鐘，循環(huán)30次；72'C延伸10分鐘。
(3) 重疊PCR技術(shù)融合(BNP)2 cDNA和HSA cDNA
將(BNP)2的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以1:10比例混合后作為模板， 于50ul反應(yīng)體系中加入2xPfuPCRMasterMix25ul，混合好的模板25pl。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性5分 鐘；94'C變性1分鐘，65'C退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，循環(huán)15次；72'C延伸10分鐘。
以該PCR產(chǎn)物為模板，50nl的反應(yīng)體系中加入1Onmol/L的引物PB1禾卩PH4各1.5pl， 2xPfo PCR MasterMix25ul，模板4ul，加雙蒸水補齊5(HU。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性5分鐘；94。C變性1分鐘，65°C 退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，循環(huán)35次；72'C延伸10分鐘。
瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目 的片段。純化的重疊PCR產(chǎn)物和載體pBlu2KSP，分別經(jīng)五co/ I和M^I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 用PCR片段膠回收試劑盒回收(BNP)2-HSA基因片段和載體pBlu2KSP。用T4 DNA連接酶連接兩回收片段， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100ng/ml氨芐青霉素的LB 瓊脂平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種于20ml含10(Hig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培 養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。采用PCR擴增，I和Afe/ I雙酶切鑒定陽性克隆，并對重 組質(zhì)粒￡coi I和WW I雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍 于-80。C。重組質(zhì)粒命名為pBlu2KSP-(BNP)rHSA，陽性重組子命名為JM109/pBlu2KSP-(BNP)rHSA。
實施例4: (BNP)2-HSA酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達
(1)融合蛋白(BNP)2-HSA的酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建
取一支凍存的JM109/pBlu2KSP-(BNP)2-HSA，接種到20ml含100ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒pBlu2KSP-(BNP)rHSA和酵母表達載體pPIC9K, 分別經(jīng)￡coi I和I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用PCR片段膠回收試劑盒回收(BNP)2-HSA基因片 段和載體pPIC9K。用T4 DNA連接酶連接兩回收片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn) 化物涂布于含100ng/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取長出的菌落，接種于20ml含 lOOpg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。采用PCR擴±曾，I 和Atol雙酶切鑒定陽性克隆。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍于-80。C。重組質(zhì)粒命名為 pPIC9K-(BNP)2-HSA，陽性重組子命名為JM109/pPIC9K-(BNP)2-HSA。
提取JM109/pPIC9K-(BNP)rHSA中的質(zhì)粒，經(jīng)Sa/I單酶切，DNA膠回收試劑盒回收后，電擊轉(zhuǎn)化畢 赤酵母GS115,轉(zhuǎn)化物涂布于含有l(wèi)mol/L山梨醇的MD平板上，于30。C培養(yǎng)6天。每塊平板上用2ml水 洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別涂布含有l(wèi)mg/ml、 2mg/ml、 3mg/ml、 4mg/mlG418的 YPD平板，于30'C，培養(yǎng)3 6天。挑取在最高濃度G418 YPD平板上長出的菌落，接種于20ml YPD培 養(yǎng)基中，30'C培養(yǎng)24小時，用常規(guī)方法提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR,瓊脂糖凝膠電泳鑒定 重組子。陽性重組子命名為GS115/pPIC9K-(BNP)2-HSA。
(2)融合蛋白(BNP)2-HSA的表達
將GS115/pPIC9K-(BNP)2-HSA接種至裝有10mlBMGY (2%胰蛋白胨，1%酵母提取物，100mmol/L磷 酸鉀(pH6.0)， 1.34%無氨基酸的酵母氮基(YNB)， 4xl0'5%生物素，1%甘油)的50ml三角瓶中，250 rpm， 30'C培養(yǎng)24小時，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有3mlBMMY (2%胰蛋白胨，1%酵母提 取物，10Ommol/L磷酸鉀(pH6.0)， 1.34%無氨基酸的酵母氮基(YNB)， 4xl(T5%生物素，2%甲醇)的 50ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度2%,誘導(dǎo)3天，離心收集上清，進行SDS-PAGE驗證，Western 雜交鑒定融合蛋白(BNP)2-HSA分子的BNP及HSA免疫源性。
實施例5:融合蛋白(BNP)2-HSA的生物活性檢測
離體動脈條測定法:取兔離體動脈條剪成約1.5 cm長、2 3 mm寬的螺旋環(huán)，懸掛于含10ml通氧的37'C 臺氏液(NaCl 8.0 g、 KC1 0.2 g、 CaCl2 0.2 g、 NaH2P04 0.05 g、 MgS04'7H20 0.1 g、 NaHC031.0 g、 Glucose l.Og,用蒸餾水配成l 000ml的溶液，用l mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4)的麥?zhǔn)显〔壑?，加負荷l g，穩(wěn)定l h，期間每20min換一次臺氏液。連接多導(dǎo)記錄儀，調(diào)節(jié)靈敏度，記錄血管的張力變化。待張力曲線基線穩(wěn) 定后，加入1.25mg/ml的鹽酸去氧腎上腺素溶液0.05 ml于麥?zhǔn)显〔壑惺蛊浣K濃度為6.25xl(^mg/m1,曲線 升高至最高并穩(wěn)定后，開始按累計濃度給藥法(曲線穩(wěn)定后對倍增加樣品濃度為6.25x10—4 8.0xl0—2 RU/ml )加入重組人腦鈉肽對照品，記錄血管的張力變化。完成上述給藥后，洗脫并穩(wěn)定l h，期間每20min 換一次臺氏液，待基線穩(wěn)定后，按測定對照品的方法測定待測樣品，記錄測定結(jié)果。計算對照品和各實驗 樣品的半效稀釋倍數(shù)，按下式計算樣品效價樣品效價:對照品效價x樣品半效稀釋倍數(shù)/對照品半效稀釋 倍數(shù)(RU/mL)。
權(quán)利要求
1. 人腦鈉肽二聯(lián)體[(BNP)2]與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。其特征是包括與人腦鈉肽至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二區(qū)；所述與人腦鈉肽同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，所述與人腦鈉肽同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括與人 腦鈉肽至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少95%序列同源的第二區(qū)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白的第二區(qū) 由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成或經(jīng)結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括與人 腦鈉肽氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能 等同物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的人腦鈉肽與人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述功能等同物是在不 改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人腦鈉肽二聯(lián)體[(BNP2)]與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備。其特征 是人工合成(BNP)2 cDNA;通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA;利用重疊PCR技術(shù)， 連接(BNP)2CDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的(BNP)2 -HSA cDNA融合基因插入到克 隆載體中保存;利用畢赤酵母分泌型表達載體將(BNP)2-HSAcDNA融合基因整合到宿主的染色體中進行表 達。(1) (BNP)2cDNA的克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司人工合成(BNP)2CDNA (195bp),將其克隆到載體pBlu2KSP 上，插入位點為SffwI，受體菌為大腸桿菌JM109菌株。(2) HSAcDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為 PH1: 5，-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3， PH2: 5 ，-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3'PCR反應(yīng)體系10nmol/L的PHl和PH2引物各1.5nl， 2.5mmol/L的dNTP 4pl， 10xpfu Buffer 5pl， 5U/nl的pfUDNA聚合酶0.5^11，人胎肝cDNA文庫l嗎，加雙蒸水補齊50^1。 PCR反應(yīng)程序95'C預(yù)變 性5分鐘；94'C變性1分鐘，60'C退火1分鐘，72。C延伸3分鐘，循環(huán)30次；72。C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的 目的片斷。純化好的目的片斷和載體pBlu2KSP分別經(jīng)和/^"rfffl雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR 片段膠回收試劑盒回收目的片斷。T4 DNA連接酶連接經(jīng)雙酶切的HSA cDNA和載體pBlu2KSP，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100ng/ml氨芐青霉素的LB瓊脂 平板，37。C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種于20ml含100ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過 夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。采用PCR擴增，&^1和7/ >^111雙酶切鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì) 粒Sa/1和雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍于-80'C 。 重組質(zhì)粒命名為pBlu2KSP-HSA,陽性重組子命名為JM109/pBlu2KSP-HSA。(3) (BNP)2 cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆 (D(BNP)2CDNA的PCR擴增，所用引物如下PB1: 5 ，-GCGCGCGAATTCAAAAGATCTCCAAAGATGGTCCAAGG-3 ， PB2: 5'-ACCTCACTCTTGTGTGCATCGTGACGTCTCAGGACCTTGC-3，PCR反應(yīng)體系10pmol/L的PB1和PB2引物各1.5^1， 2.5mmol/L的dNTP化l， 10xpfu Buffer 5^1, 5U/|il 的pfuDNA聚合酶0.5nl，質(zhì)粒模板pBlu2KSP-(BNP)2 lng,加雙蒸水補齊50^1。 PCR反應(yīng)程序95'C預(yù) 變性5分鐘；94'C變性1分鐘，65'C退火1分鐘，72'C延伸30秒，循環(huán)30次；72'C延伸10分鐘。② HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下PH3: 5 ，-GCAAGGTCCTGAGACGTCACGATGCACACAAGAGTGAGGT-3' PH4: 5'-CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3，PCR反應(yīng)體系10nmol/L的PH 3禾B PH 4引物各1.5^1， 2.5mmol/L的dNTP化l, 10xpfu Buffer 5pl， 5U爾1的pfUDNA聚合酶0.5pl，質(zhì)粒模板pBlu2KSP-HSA lng，加雙蒸水補齊50^1。 PCR反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性5分鐘；94'C變性1分鐘，65'C退火1分鐘，72'C延伸3分鐘，循環(huán)30次；72'C延伸10分鐘。③ 重疊PCR技術(shù)融合(BNP)2 cDNA和HSA cDNA將(BNP)2的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以1:10比例混合后作為模板， 于50ul反應(yīng)體系中加入2xPfuPCRMasterMix25ul，混合好的模板25pl。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性5分 鐘；94。C變性l分鐘，65"退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，循環(huán)15次；72。C延伸10分鐘。以該PCR產(chǎn)物為模板，50nl的反應(yīng)體系中加入10nmol/L的引物PB1禾B PH4各1.5jil， 2xPfu PCR MasterMix25ul，模板4ul，加雙蒸水補齊50^1。 PCR反應(yīng)程序95。C預(yù)變性5分鐘；94'C變性1分鐘，65°C 退火1分鐘，72'C延伸4分鐘，循環(huán)35次；72t延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目 的片段。純化的重疊PCR產(chǎn)物和載體pBlu2KSP，分別經(jīng)&oi I和Ato I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 用PCR片段膠回收試劑盒回收(BNP)2-HSA基因和載體pBlu2KSP。用T4DNA連接酶連接兩回收片段，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、 IPTG和100ng/ml氨芐青霉素的LB 瓊脂平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，接種于20ml含10(Hig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培 養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。采用PCR擴增，五coi I和A^I雙酶切鑒定陽性克隆，并對重 組質(zhì)?！阠oi I和AW I雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍 于-80'C。重組質(zhì)粒命名為pBlu2KSP-(BNP)2-HSA，陽性重組子命名為JM109/pBlu2KSP-(BNP)2-HSA。(4) 融合蛋白(BNP)rHSA的酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建取一支凍存的JM109/pBlu2KSP-(BNP)2-HSA,接種到20ml含100ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中， 37'C培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒pBlu2KSP-(BNP)2-HSA和酵母表達載體pPIC9K， 分別經(jīng)￡coi I和Wof I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用PCR片段膠回收試劑盒回收(BNP)rHSA基因和 載體pPIC9K。用T4 DNA連接酶連接兩回收片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂 布于含10(^g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取長出的菌落，接種于20ml含lOOpg/ml 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。采用PCR擴增，I和Ato I 雙酶切鑒定陽性克隆。陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，凍于-80'C。重組質(zhì)粒命名為 pPIC9K-(BNP)2-HSA ,陽性重組子命名為JM109/pPIC9K-(BNP)2-HSA。提取JM109/pPIC9K-(BNP)2-HSA中的質(zhì)粒，經(jīng)Sa/I單酶切，DNA膠回收試劑盒回收后，電擊轉(zhuǎn)化畢 赤酵母GS115,提取重組畢赤酵母基因組DNA, PCR擴增鑒定，陽性重組子命名為 GS115/pPIC9K-(BNP)2-HSA 。(5)融合蛋白(BNP)2-HSA的表達將GS115/pPIC9K-(BNP)2-HSA接種至裝有10mlBMGY的50ml三角瓶中，250rpm, 30。C培養(yǎng)24小時， 離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有3mlBMMY的50ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度 2%，誘導(dǎo)3天，離心收集上清，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白(BNP)rHSA分子的BNP及 HSA免疫源性。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是宿主細胞是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是優(yōu)選的宿主細胞是酵母。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是優(yōu)選的酵母是畢赤酵母。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征是優(yōu)選的畢赤酵母是畢赤酵母GS115和KM71。
全文摘要
人腦鈉肽二聯(lián)體[(BNP)₂]與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制備，屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，將串聯(lián)的兩個BNP cDNA(簡稱(BNP)₂)和HSA cDNA進行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的(BNP)₂-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主表達系統(tǒng)中進行表達。本發(fā)明的融合蛋白包括與人腦鈉肽至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯拢M行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人腦鈉肽的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其溶解度，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK101280017SQ20081002498
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者丁月娣, 敏 儲, 張蓮芬, 英 李, 堅 金, 蘊 陳 申請人:江南大學(xué)