專利名稱：：發(fā)酵制備高光學(xué)純度d-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，尤其是一種能夠高效率的高選擇性的生產(chǎn)高光學(xué)純度與高化學(xué)純度的D-乳酸菌株及其相應(yīng)的制造技術(shù)，所屬菌株在生產(chǎn)D-乳酸時(shí)不產(chǎn)生雜質(zhì)琥珀酸和富馬酸等；另外，本發(fā)明還涉及這種D-乳酸高產(chǎn)菌的發(fā)酵與代謝控制方法，屬于微生物發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：乳酸，是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，根據(jù)光學(xué)純度可以將乳酸分為L-乳酸、D-乳酸和DL-混合乳酸，由于D-乳酸及DL-混合乳酸因其影響細(xì)胞的正常生理代謝，1998年被世界衛(wèi)生組織禁止藥用和食用，L-乳酸及其衍生物主要用作食品添加劑、防腐劑、還原劑等用于食品、啤酒、白酒、醫(yī)藥、化工、石油和皮革加工等行業(yè)。近年來隨著對乳酸應(yīng)用研究的深入，特別是由乳酸聚合獲得生物可降解材料——聚乳酸的深入研究，D-乳酸的應(yīng)用前景和應(yīng)用需求也越來越廣泛。如1、通過向L-乳酸中添加一定量的D-乳酸，調(diào)節(jié)用于聚合的D-乳酸的含量而控制聚乳酸的物理特性，使聚乳酸逐步取代各種非降解的石化來源的塑料；2、可以用于研究乳酸抑制和作為酶法分析乳酸的標(biāo)準(zhǔn)品，作為一些反應(yīng)的試劑盒等；3、純的D-乳酸作為--個(gè)手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前提，在醫(yī)藥、農(nóng)藥制藥和除草劑方面的實(shí)際應(yīng)用正日益引起人們的重視。如鈣拮抗劑降壓藥，皮考啉酸衍生物以.及優(yōu)良除草劑——驃馬、威霸、二甲四氯丙酸、氟系等的重要合成前體；4、D-乳酸的一些衍生物也有較廣泛的應(yīng)用，以D-乳酸為原料的乳酸脂類廣泛用于香料、合成樹脂涂料、膠黏劑印刷油墨等生產(chǎn)中，而且可用石油管道清洗、電子工業(yè)清洗及S-2-氯丙酸除草劑DuplosanR的手性合成原料，等。隨著研究的深入，D-乳酸用途不斷擴(kuò)寬，市場需求量也將隨之不斷增加，但是D-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)幾乎沒有，究其原因，主要是由于缺乏高效的D-乳酸生產(chǎn)技術(shù)。不少微生物可以代謝葡萄糖形成D-乳酸或DL型混合乳酸，同時(shí)會(huì)形成乳酸以外的副產(chǎn)物例如醋酸、乙醇、丙酮酸等低分子量有機(jī)化合物。這些有機(jī)酸在純化過程中很難完全出去，導(dǎo)致最終產(chǎn)物乳酸的品質(zhì)下降并嚴(yán)重影響其后續(xù)運(yùn)用。另外，由于光學(xué)異構(gòu)體的混入導(dǎo)致光學(xué)純度下降也變成嚴(yán)重的問題。為了提高D-乳酸的化學(xué)純度，我們需要降低乳酸發(fā)酵時(shí)副產(chǎn)物特別是有機(jī)酸的含量。近年來基因重組技術(shù)飛速發(fā)展，可以敲出微生物的特定基因，從而可能特異性的阻礙副產(chǎn)物的合成。但是該方法并不適合多種微生物，所以在乳酸菌或絲狀真菌等原來能高效生產(chǎn)乳酸的微生物中并不適用。其原因是上述微生物基因組信息不充分，而且作為基因重組的宿主也不能廣泛適用。但是，大腸桿菌的基因組信息豐富，而且常被作為基因重組宿主。特別是從增殖迅速或培養(yǎng)容易等方面考慮，最優(yōu)選大腸桿菌。由于大腸桿菌只能合成D-乳酸，所以在得到光學(xué)純度高的D-乳酸時(shí)，也是最合適的宿主。但是，野生型大腸桿菌的D-乳酸生產(chǎn)效率很低，而且在發(fā)酵工程中伴生的低分子量有機(jī)酸等副產(chǎn)物含量很高，即不能高效地代謝底物(如葡萄糖)為單一D-乳酸產(chǎn)品。為了解決這些問題，采用基因重組方法，改變菌株的代謝途徑，選擇性地高效生產(chǎn)D-乳酸。如，通過基因突變及基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌合成同質(zhì)乳酸，乳酸的合成效率提高到6%;另一個(gè)例子是將大腸桿菌代謝葡萄糖過程中的丙酮酸脫氫酶編碼基因敲除，然后用乙酸進(jìn)行菌體生長，再用葡萄糖流加進(jìn)行乳酸的合成，乳酸的合成效率提高到8%。前一個(gè)例子說明了大腸桿菌乳酸合成途徑在基因水平上的可操作性；后一個(gè)例子則說明，在利用大腸桿菌合成乳酸時(shí)，于乳酸合成階段關(guān)閉乳酸前體物質(zhì)丙酮酸經(jīng)三羧酸循環(huán)被完全代謝掉的代謝途徑，對乳酸的合成是有意義的；但乙酸顯然不能作為工業(yè)化乳酸生產(chǎn)時(shí)的原料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，能夠合成高光學(xué)純度、少有機(jī)酸副產(chǎn)物、高選擇性的D-乳酸，且發(fā)酵工藝簡潔易控。本發(fā)明的技術(shù)方案是發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，利用D-乳酸高產(chǎn)重組菌，在2045。C條件下分階段發(fā)酵3050h，產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到12%，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到99.5。/。以上。進(jìn)一步地，上述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，先在203(TC下利用葡萄糖快速生長，形成菌體而但不形成D-乳酸，然后在3745-C下菌體停止生產(chǎn)，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有機(jī)酸。更進(jìn)一步地，上述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，其基因組中的一個(gè)或多個(gè)基因被刪除或表達(dá)，所涉及到的基因產(chǎn)物包括NAD依賴性D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性L-乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶，或蘋果酸合酶。更進(jìn)一步地，上述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，來源于大腸桿菌、芽孢桿菌類細(xì)菌、腸桿菌科細(xì)菌，或酵母。再進(jìn)一步地，上述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其中，在-發(fā)酵初期的1015h內(nèi)，培養(yǎng)溫度控制在2030。C，進(jìn)行菌體的快速生長；在余下的發(fā)酵階段，培養(yǎng)溫度控制在3745°C，進(jìn)行D-乳酸的快速合成。本發(fā)明的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步主要體現(xiàn)在1、本發(fā)明提供的重組菌具有明顯的高產(chǎn)高光學(xué)純度及高化學(xué)純度的D-乳酸能力，菌株在2045r的條件下發(fā)酵3045h，產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到12%,所產(chǎn)D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到99.5%以上；2、本發(fā)明的D-乳酸高產(chǎn)菌，在乳酸發(fā)酵中，基本沒有雜酸等副產(chǎn)物的合成，保障了D-乳酸的聚合級(jí)品質(zhì)；3、本發(fā)明的D-乳酸重組菌的發(fā)酵工藝技術(shù)D-乳酸高產(chǎn)菌生長溫度在2030'C下利用葡萄糖快速生長，形成菌體；在3745。C下菌體停止生產(chǎn)，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并幾乎不形成其它有機(jī)酸。即運(yùn)用本發(fā)明的重組菌及其發(fā)酵工藝，D-乳酸的生產(chǎn)過程僅需改變發(fā)酵溫度控制參數(shù)，即可實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為原料高效合成D-乳酸。圖l是發(fā)酵時(shí)間曲線；圖2是重組菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸和其它產(chǎn)物的HPLC分析。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，利用D-乳酸高產(chǎn)菌在203(TC下利用葡萄糖快速生長形成菌體，然后在3745°C下菌體停止生產(chǎn)，利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并幾乎不形成其它有機(jī)酸。其工藝特征是2045'C的條件下，發(fā)酵3045h，產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到12%，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到99.5。/。以上。上述D-乳酸高產(chǎn)菌，其基因組中的一個(gè)或多個(gè)基因被刪除或表達(dá)，所涉及到的基因產(chǎn)物包括NAD依賴性D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性L-乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶，或蘋果酸合酶等。本發(fā)明涉及的具體方法有基因刪除技術(shù)以合成的寡核苷酸引物，將^/特異性重組位點(diǎn)序列引入選擇性標(biāo)記(如KrnR或GmR)的兩側(cè)，形成可反復(fù)使用的選擇性標(biāo)記。運(yùn)用PCR(多聚酶鏈反應(yīng))從大腸桿菌基因組中擴(kuò)增獲得目標(biāo)刪除基因的上游及下游序列各50-200bp。將可反復(fù)使用的選擇性標(biāo)記克隆入目標(biāo)刪除基因的上游和下游序列之間，形成目的基因刪除序列，如;尸,-^T-GmK-W尸-;7/7、g卩//7,::GmV.,。將此基因刪除序列轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。在選擇性培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子。再在非選擇性培養(yǎng)基上傳代，篩選出選擇性標(biāo)記消失的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，用PCR對轉(zhuǎn)化子的目的基因突變進(jìn)行驗(yàn)證。由此獲得的突變株再用于下一個(gè)目的基因刪除的出發(fā)菌株?；蚩寺∨c表達(dá)丙酮酸脫氫酶和NAD依賴性D-乳酸脫氫酶的高表達(dá)。運(yùn)用PCR技術(shù)，從大腸桿菌基因組中分別克隆出所需表達(dá)基因，如P^和W/l4，將PCR產(chǎn)物酶切，并分別與溫控型表達(dá)載體如pTHcs18或pPL451連接，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPDH和pLDHa，再將此表達(dá)質(zhì)粒用CaCl2法轉(zhuǎn)化突變株，獲得高產(chǎn)D-乳酸的重組菌。利用上述重組方法，按照以下步驟完成對D-乳酸重組菌的構(gòu)建。①研究菌株大腸桿菌947(孫金鳳等。微生物學(xué)報(bào)2004)。②利用基因刪除技術(shù)，將步驟①所獲得的原始菌株中的目的基因如編碼丙酮酸脫氫酶的基因刪除，并獲得重組菌株EC947(A/^;0。③利用基因刪除技術(shù)，將步驟②所獲得的重組菌株中的目的-基因如編碼丙酮酸甲酸裂解酶的基因刪除，并獲得重組菌株EC947(W/^A//Z)。④利用基因刪除技術(shù)，將步驟③所獲得的重組菌株中的目的基因如編碼FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶的基因刪除，并獲得重組菌株EC947(Z^/Z;，4^/7,A淑)。⑤利用基因克隆與表達(dá)技術(shù)，提高步驟④所獲得的重組菌株的D-乳酸脫氫酶的表達(dá)量并表達(dá)丙酮酸脫氫酶，并獲得重組菌株如EC947(Ap氣A/y/,A亂pPDH，pLDHa)。⑥將步驟⑤所獲得的重組菌株15L全自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行乳酸發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵過程中定時(shí)取樣，分析細(xì)胞密度、糖耗、乳酸產(chǎn)率、代謝主要中間產(chǎn)物及其它有機(jī)酸分析等。下面以具體實(shí)例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1——?jiǎng)h除丙酮酸脫氫酶的編碼基因以合成的寡核苷酸引物Pl和P2為引物，Pl和P2分別為Pl:5'-ATAGGATCCTATCGAAATCAAAGTACCGGACATCGGGG誦3'P2:5'-CATCAGGATCCAGACGGCGAATGTCAGA畫3'以大腸桿菌947染色體DNA為模板，運(yùn)用PCR(多聚酶鏈反應(yīng)，Maties，1989)從基因組中擴(kuò)增獲得丙酮酸脫氫酶基因，將此PCR產(chǎn)物克隆入pUC18的5flmffl位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pUC-PDH。用五coRV酶切去除其中的963bp的片段并與^/^-GmK連接，獲得丙酮酸脫氫酶的基因刪除序列，力'尸-GmR-fiT/尸-/必、g卩p必。Gm;。將此基因刪除序列轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。在選擇性培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子。再在非選擇性培養(yǎng)基上傳代，篩選出選擇性標(biāo)記消失的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，用PCR驗(yàn)證目的基因突變，獲得轉(zhuǎn)化子947(A^//2)并用于后續(xù)研究的出發(fā)菌株。實(shí)施例2—?jiǎng)h除丙酮酸甲酸裂解酶的編碼基因以合成的寡核苷酸引物P3和P4為引物，P3和P4分別為P3:5'國ATAGGATCCTGATTACCGCTGGCAACAACGA國3'P4:5'-CATCAGGATCCATTGGCAACCAGGCAAGCGA國3'以大腸桿菌947染色體DNA為模板，運(yùn)用PCR從基因組中擴(kuò)增獲得丙酮酸甲酸裂解酶基因，將此PCR產(chǎn)物克隆入pUC18的^w2ffl位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pUC-PFL。用&oRV酶切去除其中的1773bp的片段并與^4rGmR連接，獲得丙酮酸甲酸裂解酶的基因刪除序列，/7尸,-&'尸-GmR-^T-/7/7、g卩/7/7^:GmRrf,,。將此基因刪除序列轉(zhuǎn)化入大腸桿菌947(A^//2)。在選擇性培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子。再在非選擇性培養(yǎng)基上傳代，篩選出選擇性標(biāo)記消失的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，用PCR驗(yàn)證目的基因突變，獲得轉(zhuǎn)化子947(ApW、~/7)并用于后續(xù)研究的出發(fā)菌株。實(shí)施例3—?jiǎng)h除FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶的編碼基因以合成的寡核苷酸引物P5和P6為引物，P5和P6分別為P5:5'國ATAGGATCCGCGATGTCTTCCATGACAACAACTG-3'P6:5'-CATCAGGATCCGGATTCATGCTGTTGGTCGGATC-3'以大腸桿菌947染色體DNA為模板，運(yùn)用PCR從基因組中擴(kuò)增獲得丙酮酸甲酸裂解酶基因，將此PCR產(chǎn)物克隆入pUC18的5amHI位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pUC-DLD。用5M和五coRV酶切去除其中的700bp的片段并與^fe-GmK連接，獲得FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶的基因刪除序列，fl7cr-GmR-^T-cTW，即cT/^::Gm、,。將此基因刪除序列轉(zhuǎn)化入大腸桿菌947(A/W/2、A^/Z)。在選擇性培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)出轉(zhuǎn)化子。再在非選擇性培養(yǎng)基上傳代，篩選出選擇性標(biāo)記消失的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，用PCR驗(yàn)證目的基因突變，獲得轉(zhuǎn)化子947(A/W/z、~W、AdW)并用于后續(xù)研究的出發(fā)菌株。實(shí)施例4——D-乳酸合成途徑工程以一組寡核苷酸為引物，LDHal:5'腸CATGAATTCATGAAACTCGCCGTTTATAGCAC曙3'LDHa2:5'-TTTGAATTCAAAGGAGTTCGTTCGGGCAGGT-3'從菌株947基因組中克隆出NAD依賴性的D-乳酸脫氫酶編碼基因(W/l4)，克隆入pPL451中，獲得表達(dá)質(zhì)粒pLDHa。相似地，將丙酮酸脫氫酶編碼基因從菌株947基因組中克隆出，克隆入pTH18csl中，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPDH。將表達(dá)質(zhì)粒pLDHa和表達(dá)質(zhì)粒pPDH轉(zhuǎn)化入菌株947(4pdA、A//7、AdW)中，獲得D-乳酸高產(chǎn)重組菌947(ApW、Ap/Z、zWW、pLDHa、pPDH)。實(shí)施例5~15L發(fā)酵罐中發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乳酸重組菌947(A/W、Apy/、2WW、pLDHa、pPDH)產(chǎn)D-乳酸性能分析和鑒定在15L發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母膏15，蛋白胨0.5,無水MgS040.25，輕質(zhì)CaC0375，pH7.07.2。葡萄糖初始濃度為100g/L，以500g/L進(jìn)行流加。發(fā)酵第一階段的溫度為2030。C，第二階段為3745。C，發(fā)酵周期為3050h。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到10%12%，光學(xué)純度達(dá)到99.5%以上，詳見圖1、圖2和表1。其中圖1當(dāng)中，10h以內(nèi)菌體在3(TC下生長，此時(shí)不產(chǎn)乳酸；然后在菌體生長完成后，發(fā)酵溫度升為45'C，此階段產(chǎn)乳酸但菌體不生長。表l:15L發(fā)酵罐中不同批次乳酸發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>綜上所述，本申請通過基因工程技術(shù)在獲得D-乳酸高產(chǎn)重組菌的基礎(chǔ)上，對重組菌的丙酮酸脫氫酶編碼基因和NAD依賴性D-乳酸脫氫酶編碼基因的表達(dá)實(shí)行發(fā)酵參數(shù)控制下表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了重組菌從葡萄糖高效單一生產(chǎn)D-乳酸的簡潔發(fā)酵工藝。本發(fā)明經(jīng)適當(dāng)修改后，也可用于從葡萄糖高效單一生產(chǎn)L-乳酸及其它有機(jī)酸。權(quán)利要求1、發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特征在于利用D-乳酸高產(chǎn)重組菌，在20～45℃條件下分階段發(fā)酵30～50h，產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到12％，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到99.5％以上。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特征在于所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，先在203(TC下利用葡萄糖快速生長，形成菌體而但不形成D-乳酸，然后在3745'C下菌體停止生產(chǎn)，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有機(jī)酸。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特征在于所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，其基因組中的一個(gè)或多個(gè)基因被刪除或表達(dá)，所涉及到的基因產(chǎn)物包括NAD依賴性D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性的D-乳酸脫氫酶、FAD依賴性L-乳酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶，或蘋果酸合酶。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特征在于所述D-乳酸高產(chǎn)重組菌，來源于大腸桿菌、芽孢桿菌類細(xì)菌、腸桿菌科細(xì)菌，或酵母。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特征在于在發(fā)酵初期的1015h內(nèi)，培養(yǎng)溫度控制在203(TC，進(jìn)行菌體的快速生長；在余下的發(fā)酵階段，培養(yǎng)溫度控制在3745'C，進(jìn)行D-乳酸的快速合成。全文摘要本發(fā)明提供一種發(fā)酵制備高光學(xué)純度D-乳酸的方法，其特點(diǎn)是利用D-乳酸高產(chǎn)重組菌，在20～45℃條件下分階段發(fā)酵30～50h，產(chǎn)D-乳酸水平達(dá)到12％，D-乳酸的光學(xué)純度達(dá)到99.5％以上。本發(fā)明通過對D-乳酸高產(chǎn)重組菌的丙酮酸脫氫酶編碼基因和NAD依賴性D-乳酸脫氫酶編碼基因?qū)嵭邪l(fā)酵參數(shù)控制下表達(dá)，使得D-乳酸的生產(chǎn)過程僅需改變發(fā)酵溫度即可控制，達(dá)到以葡萄糖為原料高效合成光學(xué)純度D-乳酸的目的和效果。文檔編號(hào)C12R1/07GK101544992SQ200810024559公開日2009年9月30日申請日期2008年3月26日優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日發(fā)明者王正祥,石貴陽申請人:蘇州普瑞信生物技術(shù)有限公司