專利名稱：低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌菌株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
由于青霉素的廣泛使用，某些細(xì)菌對(duì)它產(chǎn)生了耐藥性。青霉素類和頭孢菌素類藥物均含
有一個(gè)共同的e—內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，屬e—內(nèi)酰胺類抗生素。當(dāng)使用具有這種結(jié)構(gòu)的抗生素時(shí)，
部分病原菌通過(guò)產(chǎn)生e—內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生耐藥性。克拉維酸(clavulanic acid， CA)又稱棒 酸，是棒狀鏈霉菌(分i-e/^咖7ces c7aw7ige/YA9)產(chǎn)生的一種高效0 —內(nèi)酰胺酶抑制劑。 克拉維酸可以大大提高上述病原菌對(duì)e —內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性?？死S酸本身的抗菌活
性很弱，但它是強(qiáng)力、廣譜且不可逆的e—內(nèi)酰胺酶抑制劑。不論在體外還是體內(nèi)都能同耐 藥的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的e」內(nèi)酰胺酶生成牢固不可逆的結(jié)合物，從而抑
制耐藥性細(xì)菌對(duì)e —內(nèi)酰胺類抗生素的分解作用，恢復(fù)青霉素類及頭孢菌素類抗生素對(duì)很多 產(chǎn)生P —內(nèi)酰胺酶的耐藥性細(xì)菌的抗菌活性。
自1976年英國(guó)Beecham公司Bromn等首次從棒狀鏈霉菌(5Yrepto/77/ces c7aw/h>e/Y/s ATCC27046)的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了天然的P —內(nèi)酰胺抑制劑克拉維酸以來(lái)，克拉維酸得到了廣 泛的應(yīng)用。在發(fā)酵生產(chǎn)中，棒狀鏈霉菌對(duì)氧氣要求較高，較高的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量消耗大量 的電能并且影響菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)。
在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐的能量消耗主要由如下三部分組成:攪拌器電機(jī)耗能、通入無(wú)菌 空氣的制備能量及培養(yǎng)基消毒和冷卻能量。培養(yǎng)基消毒和冷卻能量主要取決于工藝過(guò)程和菌 種特性，而攪拌功率和無(wú)菌空氣消耗能量?jī)烧叩哪康南嗤饕菫榱斯?yīng)微生物足夠的氧 氣。因此，在發(fā)酵過(guò)程中需要不斷地給發(fā)酵系統(tǒng)通入無(wú)菌空氣，通過(guò)發(fā)酵罐的攪拌進(jìn)一步分 散，使發(fā)酵液中保持適度的溶解氧濃度。長(zhǎng)期以來(lái)，人們都只從加大通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速這兩 方面來(lái)改善發(fā)酵液的溶解氧，提高發(fā)酵單位。但是，過(guò)于激烈地?cái)嚢钑?huì)產(chǎn)生很大的剪切力， 導(dǎo)致微生物菌種和產(chǎn)物的失活。另外，攪拌功率過(guò)大，也會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)運(yùn)行不經(jīng)濟(jì)，造成發(fā)酵 成本高。在一定限度的通氣量范圍內(nèi)，Kla隨通氣量的增加而增大，但當(dāng)超過(guò)一定限度時(shí)， 大量氣體會(huì)不經(jīng)分散而直接穿過(guò)攪拌器以大氣泡形態(tài)向上浮升，出現(xiàn)"氣泛"現(xiàn)象，攪拌功 率會(huì)大大下降，Kla也不再增加，盲目增加通氣量不一定就能增加溶氧，反而會(huì)增加空氣過(guò) 濾器的負(fù)擔(dān)和染菌的可能。在發(fā)酵過(guò)程中，空壓機(jī)供氣需要消耗大量電能，約占發(fā)酵生產(chǎn)總用電量的30% 70%，機(jī)械攪拌也消耗大量的電能。在克拉維酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，棒狀鏈霉 菌對(duì)氧氣要求較高，較高的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量消耗大量的電能并且影響菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)。顯 然，降低棒狀鏈霉菌菌種的耗氧量可以有效地降低發(fā)酵生產(chǎn)中的成本。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，目的在于為工業(yè)生產(chǎn)提供一種低耗氧菌株的方法，具體提供 了一種篩選低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌株的方法。本發(fā)明所涉及的一種低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌一 一棒狀鏈霉菌(5Yr印"y^ces c&w/7iger^)菌株的篩選方法，包括初篩、復(fù)篩和小型發(fā)酵罐試驗(yàn)。(1) 初篩將誘變處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，在低氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng)，限制氧氣的濃度在15%—21%之間，28T:培養(yǎng)10—12天，挑選生長(zhǎng)和產(chǎn)孢良好 的菌株接種斜面，28'C培養(yǎng)10—12天，斜面產(chǎn)孢后制成孢子懸浮液，接種種子搖瓶， 28'C培養(yǎng)20—40小時(shí)后接種發(fā)酵搖瓶，28'C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)較高 的菌株；(2) 復(fù)篩將效價(jià)較高的菌株接種種子搖瓶，降低搖床的轉(zhuǎn)速至50—100rpm， 28。C培養(yǎng) 40—48小時(shí)后，挑選菌絲生長(zhǎng)良好的菌株接種發(fā)酵搖瓶，控制搖瓶中的氧氣量。28 'C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)；(3) 小型發(fā)酵罐試驗(yàn)將效價(jià)較高的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)。將(2)中培養(yǎng)好的菌種 接到發(fā)酵罐中，接種量為5—10% (V/V)，在溫度為28'C，攪拌轉(zhuǎn)速為300—600轉(zhuǎn) /分，通氣量0. 5VVM-1. 2VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 05—0. 08MPa， pH為6. 5-7. 5， 補(bǔ)入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下，培養(yǎng)90—100小時(shí)。(1)步驟中所用平板和斜面培養(yǎng)基成分和含量為葡萄糖4-10g/L,麥芽提取物 4-10g/L，酵母膏4-10g/L，瓊脂20-25g/L， pH為6. 5-7. 5。 (1)和(2)步驟中所用的種子 搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為蛋白胨3-10g/L，麥芽提取物3-10g/L，酵母膏3-10g/L， pH為 6.5-7.5。 (1)和(2)步驟中所用的發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為甘油10-20g/L，黃豆 粉20—30g/L，麥芽提取物10-20g/L， KH2P041. 0-3. 5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-1.5g/L， FeS04 7H20 0. 0005-0. 0015g/L， MnCl2'4H20 0. 0005-0. 0015g/L， ZnS04*7H20 0. 0005-0. 0015g/L， MOPS 10-20g/L， pH為6. 5_7. 5。 (3)步驟中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和含量為甘油10-20g/L， 棉籽粉40-60g/L，淀粉IO-20g/L， KH2P04 1. 0-3. 5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-2. 5g/L， FeS04.7H20 0. 005-0. 035g/L， MnCl2*4H20 0. 005-0. 015g/L， ZnS04'7H20 0. 005-0. 045g/L，消泡劑2_5g/L， pH為6. 5-7.5。本發(fā)明所提供的篩選低耗氧菌株的方法操作簡(jiǎn)便易行，所涉及的培養(yǎng)基原料來(lái)源廣，成 本低，非常適合工業(yè)生產(chǎn)的需要。更重要的，在本發(fā)明中，篩選低耗氧的菌株，可以降低耗 氧量，有效地降低攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，降低用發(fā)酵中的電量，降低發(fā)酵生產(chǎn)中的成本。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l誘變將棒狀鏈霉菌(5Yrepfoz/^ces c7ara7i'《eru5)孢子懸浮液通過(guò)NTG誘變。初篩按照如下配方配制平板培養(yǎng)基3. 5L:葡萄糖8g/L，麥芽提取物6g/L，酵母膏4g/L， 瓊脂25g/L， pH為7.2。準(zhǔn)備無(wú)菌培養(yǎng)皿100個(gè)。培養(yǎng)基滅菌后倒入培養(yǎng)皿中做成平板。將 誘變處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，在氧氣濃度為16%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行 培養(yǎng)，28r培養(yǎng)10—12天。按照如下配方配制斜面培養(yǎng)基4L:葡萄糖8g/L，麥芽提取物 6g/L，酵母膏4g/L，瓊脂25g/L， pH為7. 2。準(zhǔn)備試管200支，制成斜面?zhèn)溆?。挑選平板中 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢良好的菌株接種斜面，在氧氣濃度為16%的三氣培養(yǎng)緝中進(jìn)行培養(yǎng)，28。C培養(yǎng) 10 — 12天，斜面產(chǎn)孢后制成孢子懸浮液，接種種子搖瓶。種子搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為 蛋白胨3g/L，麥芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH為7. 2。 28'C培養(yǎng)20 — 40小時(shí)后接種發(fā) 酵搖瓶。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為甘油15g/L，黃豆粉25g/L，麥芽提取物15g/L， KH2P042 . 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04'7H20 0. 001g/L， MnCl2*4H20 0. OOlg/L, ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH為7. 1。 28。C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)較高的菌株3個(gè)。 重復(fù)以上過(guò)程44次。將每次篩選出的菌株保存。復(fù)篩將效價(jià)較高的菌株接種種子搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為60rpm， 28。C培養(yǎng)40—48 小時(shí)后，接種發(fā)酵搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為60rpm， 28'C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)。挑選效價(jià)較 高的菌株3個(gè)，保存，備用。小型發(fā)酵罐試驗(yàn)將效價(jià)較高的菌株NTGM0702進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)。按如下配方配制 種子搖瓶培養(yǎng)基1.4L:蛋白胨3g/L，麥芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH為7. 2。將培養(yǎng)基 裝入7個(gè)2L三角瓶中，每瓶200mU滅菌后接種孢子懸浮液2毫升，28'C培養(yǎng)40小時(shí)后， 選取5瓶生長(zhǎng)良好并且無(wú)雜菌的種子，并瓶，備用。使用15L小型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。按 照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L,麥芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04'7H20 0. Olg/L, MnCl2'4H20 0. 01g/L， ZnS04*7H20 0. 01g/L， 消泡劑4g/L， pH為7. 1。配后體積7. 6L，實(shí)消后體積為9L。將搖瓶種子接種到15升發(fā)酵 罐中，接種量為10% (V/V)。起始條件為溫度28'C、轉(zhuǎn)速300rpm、通氣量為0. 5VVM、罐壓0.05MPa。在發(fā)酵過(guò)程中，將溶氧維持在30%以上。攪拌轉(zhuǎn)速為300 — 550轉(zhuǎn)/分，通氣量 0.5VVM-1. 1VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.05—0.07MPa， pH為6.9-7.4，補(bǔ)入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的 條件下，培養(yǎng)110小時(shí)。將挑選出的菌株分別按如上步驟進(jìn)行小型發(fā)酵罐試驗(yàn)，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速、 通氣量、OUR和效價(jià)等進(jìn)行綜合比較，篩選出耗氧少并且效價(jià)高的菌株1個(gè)。實(shí)施例2誘變將棒狀鏈霉菌(5Yr印toz/7/ces c7ai^&e7^)孢子懸浮液通過(guò)紫外線誘變。初篩按照如下配方配制平板培養(yǎng)基3. 5L:葡萄糖8g/L，麥芽提取物5g/L，酵母膏4g/L， 瓊脂24g/L， pH為7.2。準(zhǔn)備無(wú)菌培養(yǎng)皿100個(gè)。培養(yǎng)基滅菌后倒入培養(yǎng)皿中做成平板。將 誘變處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，在氧氣濃度為18%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行 培養(yǎng)，28'C培養(yǎng)10_12天。按照如下配方配制斜面培養(yǎng)基4L:葡萄糖8g/L,麥芽提取物 5g/L，酵母膏4g/L，瓊脂25g/L， pH為7. 2。準(zhǔn)備試管200支，制成斜面?zhèn)溆?。挑選平板中 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢良好的菌株接種斜面，在氧氣濃度為18%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，28'C培養(yǎng) 10_12天，斜面產(chǎn)孢后制成孢子懸浮液，接種種子搖瓶。種子搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為 蛋白胨3g/L,麥芽提取物7g/L，酵母膏5g/L， pH為7.2。 28'C培養(yǎng)20—40小時(shí)后接種發(fā) 酵搖瓶。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為甘油15g/L，黃豆粉25g/L，麥芽提取物15g/L， KH2P042. 5g/L， MgS04'7H20 0. 75g/L， FeS04*7H20 0. 001g/L， MnCl2'4H20 0. 001g/L， ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH為7. 1。 28'C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)較高的菌株2個(gè)。 重復(fù)以上過(guò)程34次。將每次篩選出的菌株保存。復(fù)篩將效價(jià)較高的菌株接種種子搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為70rpm， 2S'C培養(yǎng)40—48 小時(shí)后，接種發(fā)酵搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為70rpm， 28X:培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)。挑選效價(jià)較 高的菌株3個(gè)，保存，備用。小型發(fā)酵罐試驗(yàn)將效價(jià)較高的菌株ZWM0603進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)。按如下配方配制種子搖瓶培養(yǎng)基1.4L:蛋白胨3g/L，麥芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH為7.2。將培養(yǎng)基裝入7個(gè)2L三角瓶中，每瓶200mL。滅菌后接種孢子懸浮液2毫升，28'C培養(yǎng)40小時(shí)后，選取5瓶生長(zhǎng)良好并且無(wú)雜菌的種子，并瓶，備用。使用15L小型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L，麥芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L，MgS04*7H20 0. 75g/L， FeS(V7H20 0. 01g/L， MnCl2*4H20 0. 01g/L， ZnS04'7H20 0. 01g/L，消泡劑4g/L， pH為7.1。配后體積7.5L，實(shí)消后體積為9L。將搖瓶種子接種到15升發(fā)酵罐中，接種量為10% (V/V)，起始條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速300rpm、通氣量為0. 5VVM、罐壓0. 05MPa。在發(fā)酵過(guò)程中，將溶氧維持在30%以上。攪拌轉(zhuǎn)速為300 — 530轉(zhuǎn)/分，通氣量0.5VVM-L2VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 05—0. 07MPa， pH為6. 9-7. 4，補(bǔ)入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的 條件下，培養(yǎng)110小時(shí)。將挑選出的菌株分別按如上步驟進(jìn)行小型發(fā)酵罐試驗(yàn)，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速、 通氣量、OUR和效價(jià)等進(jìn)行綜合比較，篩選出耗氧少并且效價(jià)高的菌株l個(gè)。實(shí)施例3誘變將棒狀鏈霉菌(分r印t^ /ces c7ara7&ei7AS)孢子懸浮液通過(guò)微波誘變。初篩:按照如下配方配制平板培養(yǎng)基3. 5L:葡萄糖8g/L，麥芽提取物6g/L，酵母膏4g/L， 瓊脂25g/L， pH為7.2。準(zhǔn)備無(wú)菌培養(yǎng)皿100個(gè)。培養(yǎng)基滅菌后倒入培養(yǎng)皿中做成平板。將 誘變處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，在氧氣濃度為16%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行 培養(yǎng)，28。C培養(yǎng)10—12天。按照如下配方配制斜面培養(yǎng)基4L:葡萄糖8g/L，麥芽提取物 6g/L，酵母膏4g/L，瓊脂25g/L， pH為7.2。準(zhǔn)備試管200支，制成斜面?zhèn)溆?。挑選平板中 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢良好的菌株接種斜面，在氧氣濃度為17%的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，28'C培養(yǎng) 10—12天，斜面產(chǎn)孢后制成孢子懸浮液，接種種子搖瓶。種子搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為 蛋白胨3g/L，麥芽提取物8g/L，酵肯膏5g/L， pH為7.2。 28'C培養(yǎng)20_40小時(shí)后接種發(fā) 酵搖瓶。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基成分和含量為甘油15g/L，黃豆粉25g/L，麥芽提取物15g/L, KH2P042.5g/L, MgS04*7H20 0. 75g/L， FeS04,7H20 0. OOlg/L, MnCl2'4H20 0. 001g/L， ZnS04'7H20 0. 001g/L， MOPS 20g/L， pH為7. 1。 28。C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)較高的菌株2個(gè)。 重復(fù)以上過(guò)程28次。將每次篩選出的菌株保存。復(fù)篩將效價(jià)較高的菌株接種種子搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為60rpm, 28'C培養(yǎng)40—48 小時(shí)后，接種發(fā)酵搖瓶，控制搖床的轉(zhuǎn)速為80rpm， 28'C培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)。挑選效價(jià)較 高的菌株3個(gè)，保存，備用。小型發(fā)酵罐試驗(yàn)將效價(jià)較高的菌株WBM0703進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)。按如下配方配制種 子搖瓶培養(yǎng)基1.4L:蛋白胨3g/L，麥芽提取物8g/L，酵母膏5g/L， pH為7.2。將培養(yǎng)基裝 入7個(gè)2L三角瓶中，每瓶200mL。滅菌后接種孢子懸浮液2毫升，28'C培養(yǎng)40小時(shí)后，選 取5瓶生長(zhǎng)良好并且無(wú)雜菌的種子，并瓶，備用。使用15L小型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。按照 如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基10L:甘油15g/L，棉籽粉45g/L，麥芽提取物15g/L， KH2P04 2. 5g/L， MgS04'7H20 0爭(zhēng)75g/L, FeS04'7H20 0. 01g/L， MnCl2'4H20 0. 01g/L， ZnS04*7H20 0. 01g/L，消泡 劑4g/L, pH為7. 1。配后體積7. 6L,實(shí)消后體積為9L。將搖瓶種子接種到15升發(fā)酵罐中， 接種量為10% (V/V)。起始條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速300rpm、通氣量為0. 5VVM、罐壓0. 05MPa。 在發(fā)酵過(guò)程中，將溶氧維持在30%以上。攪拌轉(zhuǎn)速為300 — 530轉(zhuǎn)/分，通氣量 0.5VVM-1. 1VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0. 05—0. 07MPa， pH為6. 9-7. 4，補(bǔ)入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下，培養(yǎng)no小時(shí)。將挑選出的菌株分別按如上步驟進(jìn)行小型發(fā)酵罐試驗(yàn)，對(duì)攪拌轉(zhuǎn)速、 通氣量、OUR和效價(jià)等進(jìn)行綜合比較，篩選出耗氧少并且效價(jià)高的菌株1個(gè)。
權(quán)利要求
1. 一種低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌株的篩選方法，包括如下步驟(1)初篩將誘變處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布于平板上，在低氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，限制氧氣的濃度在15％-21％之間，28℃培養(yǎng)10-12天，挑選生長(zhǎng)和產(chǎn)孢良好的菌株接種斜面，28℃培養(yǎng)10-12天，斜面產(chǎn)孢后制成孢子懸浮液，接種種子搖瓶，28℃培養(yǎng)20-40小時(shí)后接種發(fā)酵搖瓶，28℃培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)，挑選出效價(jià)較高的菌株；(2)復(fù)篩將效價(jià)較高的菌株接種種子搖瓶，降低搖床的轉(zhuǎn)速至50-100rpm，28℃培養(yǎng)40-48小時(shí)后，挑選菌絲生長(zhǎng)良好的菌株接種發(fā)酵搖瓶，控制搖瓶中的氧氣量，28℃培養(yǎng)4天后測(cè)定效價(jià)；(3)小型發(fā)酵罐試驗(yàn)將效價(jià)較高的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)，將(2)中培養(yǎng)好的菌種接到發(fā)酵罐中，接種量為5-10％(體積百分比)，在溫度為28℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300-600轉(zhuǎn)/分，通氣量0.5VVM-1.2VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.05-0.08MPa，pH為6.5-7.5，補(bǔ)入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下，培養(yǎng)90-100小時(shí)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)步驟中所用平板和斜面培養(yǎng)基成分 和含量為葡萄糖4-10g/L，麥芽提取物4-10g/L，酵母膏4-10g/L，瓊脂20-25g/L， pH 為6. 5-7. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)或(2)步驟中所用的種子搖瓶培 養(yǎng)基成分和含量為蛋白胨3-10g/L，麥芽提取物3-10g/L，酵母膏3-10g/L， pH為6. 5-7. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的(1)和(2)步驟中所用的發(fā)酵搖瓶培 養(yǎng)基成分和含量為甘油10-20g/L，黃豆粉20—30g/L，麥芽提取物10-20g/L， KH2P04 1.0-3. 5g/L， MgS04'7H20 0. 5%-1.5g/L， FeS04'7H20 0. 0005-0. 0015g/L ， MnCl2*4H20 0.0005-0.0015g/L， ZnS04*7H20 0.0005-0. 0015g/L， MOPS 10-20g/L， pH為6. 5-7. 5。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的(3)步驟中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和含 量為甘油10-20g/L，黃豆粉40-60g/L，麥芽提取物10-20g/L， KH2P04 1.0-3.5g/L， MgS04*7H20 0. 5%-2. 5g/L， FeS04*7H20 0. 005-0. 035g/L， MnCl2*4H20 0. 005-0. 015g/L， ZnS04 7H20 0. 005-0. 045g/L，消泡劑2-5g/L， pH為6. 5-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種低耗氧克拉維酸生產(chǎn)菌菌株的篩選方法，其包括初篩、復(fù)篩和小型發(fā)酵罐試驗(yàn)等步驟。本發(fā)明所提供的篩選低耗氧菌株的方法操作簡(jiǎn)便易行，所涉及的培養(yǎng)基原料來(lái)源廣，成本低，非常適合工業(yè)生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101280336SQ20081001641
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者趙志全 申請(qǐng)人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司