專利名稱：抗人腫瘤壞死因子α的單克隆抗體的抗體可變區(qū)及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子-a的單克隆抗體的抗體可變區(qū)、編碼它 的基因、含有該基因的重組載體和轉(zhuǎn)化該重組載體的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
人腫瘤壞死因子-a (下文稱作"hTNFa")是由三個(gè)17 kDa蛋白質(zhì)亞基組成的 同源三聚體(Eck MJ et al.， JBC 267:2119-2122， 1992; Smith RA et al" 7BC 262 : 6951-6954,1987)。 hTNFa是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，在多種細(xì) 胞反應(yīng)如壞死和凋亡中作為信號(hào)傳遞物起作用(Beyaert R et al.， T^^J 340: 9-16,1994)。
hTNFa產(chǎn)生導(dǎo)致組織破壞的促炎作用，所述組織破壞例如分解軟骨和骨 (Saklatvala, Wfl,"M 322: 547-549,1986)，以及增加中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的粘附 (Pober et al.， K. /附m"wo/. 138 : 3319,1987)。此外，已知hTNFa在對(duì)抗感染性疾病 和腫瘤的防御機(jī)制中起著重要作用(Fiers W，F(xiàn)五aSi:戰(zhàn).285: 199-212,1991)。
hTNFa參與炎性疾病、自身免疫病、細(xì)菌感染、癌癥和退形性病變。在這些疾 病中，hTNFa已經(jīng)被當(dāng)作特異性生理治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和節(jié)段性回腸炎(Crohn's disease)的有用靶蛋白。
同時(shí)，還提示使用hTNFa抑制劑來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。已經(jīng)報(bào)道hTNFoc在分 離自早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)的滑膜細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(Buchan G et al.， /附m""o/. 73:
449-455,1988)，上述滑膜細(xì)胞用抗hTNFa單克隆抗體處理時(shí)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病 變相關(guān)的細(xì)胞因子下降(Butler DM et al.，五"f Q;toAi"e TVe加.6: 225-230,1995)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗hTNFot抗體或重組可溶性hTNFa受體抑制膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān) 節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)的炎癥和破壞(Wpiquet PF et al.， J附附""o/05y 77: 510-514,1992; Wooley PH et al" / J附腦,zo/. 151: 6602-6607, 1993; Williams RO et al" 7m聽(tīng)wo/柳 84: 433-439,1995)。此外，觀察到過(guò)表達(dá)hTNFa的轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了炎性關(guān)節(jié)炎 (Keffer J et al"皿必O /. 10: 4025-4031,1991 )。
這些結(jié)果表明hTNFa作為控制炎性細(xì)胞因子的直接或間接調(diào)節(jié)因子在類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎中起著重要作用。因此，需要開(kāi)發(fā)對(duì)hTNFa具有高度選擇性和反應(yīng)性的單克 隆抗體來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

發(fā)明內(nèi)容
因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供特異性結(jié)合hTNFot的單克隆抗體的抗體可變區(qū)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體的抗體可變區(qū)
的基因；包含該基因的重組載體；和轉(zhuǎn)化該重組載體的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體的抗體可變區(qū)，
其包含下列至少一種
包含SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和 包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體的重鏈
可變區(qū)的核酸分子，其中所述的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體的輕鏈 可變區(qū)的核酸分子，其中所述的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸 序列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體的抗體可變區(qū)及其編碼基因。 為了制備特異性結(jié)合hTNFa的單克隆抗體，用重組hTNFa(BiosourcePHC3011,Belgium)免疫小鼠。將從免疫小鼠獲得的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0-Ag14， ATCC CRL1581)融合，以制備雜交瘤細(xì)胞庫(kù)(pool)。將這種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的克隆 和選擇程序，以提供多種單克隆抗體。在這些單克隆抗體中，選擇特異性結(jié)合hTNFa 的某些單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果，獲得了雜交瘤細(xì)胞系TSKll，其產(chǎn)生特 異性結(jié)合hTNFoc并對(duì)TNFa表現(xiàn)出高度結(jié)合親和力的單克隆抗體。
從雜交瘤細(xì)胞系TSK11提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR),以合成單克隆抗體重鏈和輕鏈的cDNA分子。使用這種cDNA分子作 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),從而獲得編碼重鏈可變區(qū)并包括SEQ ID NO: 5 核苷酸序列的約470bp的cDNA分子；和編碼輕鏈可變區(qū)并包括SEQ ID NO: 6核苷 酸序列的約450bp的cDNA分子。
分析這種重鏈和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重鏈可變區(qū)具有三 個(gè)CDR，位于SEQIDNO: 7氨基酸序列中的31-35 (SEQ ID NO: 9)、 50-66 (SEQ ID NO: 10)和99-106 (SEQ ID NO: 11)氨基酸位置處。同樣，觀察到輕鏈可變區(qū) 具有三個(gè)CDR，位于SEQ ID NO: 8氨基酸序列中的24-35 (SEQ ID NO: 12)、 51-57 (SEQ ID NO: 13)和卯-98 (SEQ ID NO: 14)氨基酸位置處。
因此，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的cDNA分子編碼特異性結(jié)合hTNFa的單克隆 抗體的重鏈可變區(qū)，其中所述的重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸 序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明提供了編碼含SEQ ID NO: 7氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的 cDNA分子，更優(yōu)選的是具有SEQ ID NO: 5核苷酸序列的cDNA分子。
另外，根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的cDNA分子編碼特異性結(jié)合hTNFa的單克 隆抗體的輕鏈可變區(qū)，其中所述的輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基 酸序列。優(yōu)選的是，本發(fā)明提供了編碼含SEQIDNO:8氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的 cDNA分子，更優(yōu)選的是具有SEQ ID NO: 6核苷酸序列的cDNA分子。
編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的前述每一種cDNA分子可以插入到傳統(tǒng)載體中 以獲得重組載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包括SEQIDNO:5或6核苷酸 序列的cDNA分子可以插入到pCR2.1-TOPO (Invitrogen Co. U.S.A)中，以制備含 有重鏈可變區(qū)的重組載體pTSKll-Hv,或含有輕鏈可變區(qū)的重組載體pTSKll-Lv。另外,可以將這種重組載體導(dǎo)入合適的宿主中，如諸如TOP10F的微生物。 例如，用pTSKll-Hv或pTSKll-Lv轉(zhuǎn)化Eco/ZTOP10F,以獲得E.coli轉(zhuǎn)化體，稱 作Eco/; TOP 10F/pTSKll-Hv或五.co// TOP 10F/pTSKll-Lv，它們按照國(guó)際承認(rèn)用 于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52， Oun-dong， Yusong-ku， Taejon 305-333, Republic of Korea),保藏編號(hào)是KCTC 10514BP或KCTC 10515BP。
上述重組載體可以根據(jù)常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化體中恢復(fù)(J. Sambrook et al., 3/ofec"/flr c/卯'VigVo1. 1: 1.25-1.28)。例如，轉(zhuǎn)化體可以用溶液1(50,葡萄糖，25 mM Tris-HCl 和10 mM EDTA)處理以弱化其細(xì)胞膜，然后用溶液2 (0. 2 N NaOH和1% SDS) 處理以完全破壞細(xì)胞膜，變性所暴露的蛋白質(zhì)和染色體。然后，通過(guò)進(jìn)一步用溶液3 (5M醋酸鉀和醋酸)處理使重組載體之外的細(xì)胞組分聚集。然后，將所得的溶液進(jìn) 行離心以獲得含重組載體的上清液。重組載體可以通過(guò)乙醇沉淀從上清液中回收。
本發(fā)明的抗體可變區(qū)可以包含下列至少一種包含SEQ ID NO: 9、 10和11的 氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列的輕鏈可 變區(qū)。優(yōu)選的是，抗體可變區(qū)可以包含具有SEQIDNO:7氨基酸序列的重鏈可變區(qū) 和具有SEQ ID NO: 8氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)中的至少之一。
抗hTNFa的人源化單克隆抗體可以通過(guò)將人抗體基因和編碼含有SEQ ID NO: 9-11所示CDR的重鏈可變區(qū)或編碼含有SEQ ID NO: 12-14所示CDR的輕鏈可變區(qū) 的cDNA分子融合而得到。作為替代方案，人源化單克隆抗體可以將人抗體可變區(qū) 替換為這種cDNA分子而得到。
如上所述，由于本發(fā)明的抗體可變區(qū)特異性結(jié)合hTNFa,它可以有效地用來(lái)中 和并滅活hTNFa。
在下列實(shí)施例中進(jìn)一步解釋本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例雖然指出了本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案，但只是以說(shuō)明方式給出。
實(shí)施例1:用hTNFa免疫小鼠
將30嗎重組hTNFa (Biosource PHC3011, Belgium)溶解于150^1磷酸緩沖液(PBS)中，和150^1弗氏完全佐劑(Sigma F5881, U.S.A.)混合而乳化。將300^1 所得乳液腹腔注射(i.p.)到6周齡雄性BALB/c小鼠體內(nèi)。兩周后，小鼠腹腔注射 300^1含30嗎hTNFa和150|La弗氏不完全佐劑(Sigma F5506, USA)的乳液混合物。 第二次注射兩周后，將溶解于150nl PBS中的30嗎重組hTNFa靜脈注射(i.v.)到 小鼠體內(nèi)。第3次注射10天后，小鼠靜脈注射30嗎的重組hTNFa的PBS溶液而加 強(qiáng)免疫。
實(shí)施例2:產(chǎn)生抗hTNFa抗體的小鼠脾細(xì)胞的融合
將實(shí)施例中免疫的小鼠通過(guò)碳酸鉀窒息而處死，然后從中摘除脾臟。從小鼠脾 臟獲得脾細(xì)胞，并與非分泌性骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 (ATCC CRL1581)以10:1比例混合。 為了細(xì)胞融合，將預(yù)熱到37'C的lml50。/。聚乙二醇(PEG 1500， Roche 783641)加 到細(xì)胞混合物中。將融合細(xì)胞用含20V。胎牛血清(FBS， JRH， 12-10678P)、 50 ng/ml 慶大霉素(Gibco-BRL， 15750-060)、 lxDMEM (JRH， 56499-10L)和lxHAT補(bǔ) 充物(O.l mM次黃嘌呤鈉、0.4pM氨基蝶呤、16pM胸腺嘧啶；Gibco-BRL，31062-037) 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋，并以1.1xl()5細(xì)胞/孔的濃度、以0.2 ml小份分到96孔板(Nimc， 469949, Denmark)中。將融合細(xì)胞于37'C的濕化CO;j孵箱中以5% <:02培養(yǎng)2~3 周。
實(shí)施例3:產(chǎn)生抗hTNFa抗體的細(xì)胞系的篩選和克隆
一旦融合細(xì)胞形成集落，就取它們的上清液進(jìn)行ELISA分析以確證抗體產(chǎn)生。 為進(jìn)行ELISA分析，將孔用lpg/ml hTNFa于4'C包被過(guò)夜，向每個(gè)孔中加入200^1 0.5。/。酪蛋白-PBS溶液，然后在37'C進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。接著，向每個(gè)孔中加入100nl 上清液，在37'C進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。然后，向每個(gè)孔中加入100nL以1:1000比例稀釋 的偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Bio-Rad，170-6516)，于37'C保持1.5小時(shí)。 最后，向每個(gè)孔中加入100^1辣根過(guò)氧化物酶底物溶液(Bio-Rad， 172-1064)，將這 些孔于37'C保持3分鐘以誘導(dǎo)顯色。用ELISA酶標(biāo)儀(Dinatec inc.，USA)測(cè)定410nm 處的光吸收。實(shí)施例4:產(chǎn)生抗hTNFa抗體的細(xì)胞系的選擇
在實(shí)施例3克隆的細(xì)胞系中，獲得了比獲自hTNF-a免疫小鼠的陽(yáng)性對(duì)照血清表 現(xiàn)出更高光吸收的9個(gè)產(chǎn)生IgG的細(xì)胞系。在這些細(xì)胞系中，選擇表現(xiàn)出最高光吸 收的TSK11進(jìn)行進(jìn)一步分析。
實(shí)施例5:從雜交瘤細(xì)胞系TSK11獲得的單克隆抗體的同種型分析
通過(guò)如下的ELISA分析確認(rèn)從雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的同種型。向預(yù) 先包被100ng/ml TSK11抗體的孔中加入100^1的小鼠MonoAb ID kit HRP溶液 (Zymed，卯-6550),然后，將孔板保持于室溫下3分鐘，以誘導(dǎo)顯色。用ELISA 酶標(biāo)儀(Dinatec inc., USA)測(cè)定410nm處的光吸收。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSK抗體含有IgGl
型重鏈和K型輕鏈。
實(shí)施例6:來(lái)自雜交瘤細(xì)胞系TSK11的單克隆抗體的體外結(jié)合親和力
通過(guò)ELISA分析測(cè)定抗hTNFa的TSKll抗體的體外結(jié)合親和力。這里，將每 個(gè)孔用100^1濃度為4ng/ml的重組hTNFa包被。然后，在微管(Micro Tube) (AXYGEN， U.S.A.)中，將重組hTNFa用補(bǔ)充0.02%牛血清白蛋白的PBS稀釋， 以獲得5xl(T9M-lxl(T1QM的終濃度。將各濃度的hTNFa稀釋物和30 ng TSK11抗體 混合，于37'C保持2小時(shí)。將混合溶液分到用重組hTNFa包被的每個(gè)孔中，于37 'C孵育2小時(shí)。然后，向每個(gè)孔中加入100^1辣根過(guò)氧化物酶底物溶液(Bio-rad， 172-1064),于37'C保持3分鐘以誘導(dǎo)顯色。用ELISA酶標(biāo)儀(Dinatec inc., USA) 測(cè)定410nm處的光吸收。
根據(jù)Scatchard plot分析(Friguet E. etal., t / /挑挑訓(xùn)o/og/cfl/ Me,Aorf 77: 305-319， 1985)計(jì)算抑制競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中50。/。的最大結(jié)合所需的抗原濃度的倒數(shù)來(lái) 確定表觀親和力。結(jié)果，TSKll對(duì)hTNFa的親和力為1.95xl(T9M OW)。
實(shí)施例7:從雜交瘤細(xì)胞系TSK11的RNA分離和cDNA合成
8用RNeasy試劑盒(QIAGEN， U.S.A)從雜交瘤細(xì)胞系TSK11的lx108細(xì)胞中 提取總RNA，并使用Thermotranscript試劑盒(GibcoBRL, U.S.A)進(jìn)行cDNA合 成。將作為模板的5嗎RNA和0.5ng寡聚d(T)懸浮于蒸餾水中，并將終體積調(diào)至l(Hil。 將混合物保持于65'C下5分鐘以變性RNA，并冷卻到室溫以誘導(dǎo)引物退火。用于 cDNA合成的RT-PCR反應(yīng)溶液通過(guò)將1^1逆轉(zhuǎn)錄酶(1單位/pI)、 2.5pl 0.1M DTT、 2.5nl 10mM dNTP和1^1 RNase抑制劑(1單位/pl)混合而制備，其終體積用蒸餾水 調(diào)至25pl。 RT-PCR反應(yīng)于50'C進(jìn)行1小時(shí)，通過(guò)將反應(yīng)混合物于95'C加熱5分鐘 而終止。
使用2pg的合成cDNA作為模板和擴(kuò)增重鏈的一對(duì)引物(SEQ ID NO: 1和2) 或擴(kuò)增輕鏈的另一對(duì)引物(SEQ ID NO: 3和4)進(jìn)行PCR。 PCR反應(yīng)溶液含有0.5^1 AmpliTaq Gold聚合酶(5單位小1, Perkin-Elmer Biosystem Co.， U.S.A)、 lpl 10 mM dNTP和5nl25mMMgCl2,終體積用蒸餾水調(diào)至50nl。 PCR條件如下95'C初始變 性5分鐘，然后是94'C l分鐘，55'C l分鐘，72'C 2分鐘的30個(gè)循環(huán)，接著于72 'C最終延伸10分鐘。
將擴(kuò)增的DNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠用100 ml的0.5jig/ml溴化乙 錠溶液染色20分鐘。結(jié)果，鑒定到了兩個(gè)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物，對(duì)于重鏈在對(duì)應(yīng)于約 470bp的位置處，對(duì)于輕鏈在對(duì)應(yīng)于約450bp的位置處，參照100bp的標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder (Lifetechnology Co. U.S.A.)。
實(shí)施例8: cDNA克隆
利用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen， U.S.A.)從瓊脂糖凝膠回收并 純化實(shí)施例7中擴(kuò)增的470bp的重鏈DNA片段。將純化的DNA片段亞克隆到載體 pCR2.1-TOPO (Invitrogen Co.， U.S.A.)中，將所得的載體導(dǎo)入五.co// TOP10F (Invitrogen Co., U.S.A.),以獲得轉(zhuǎn)化體(Cohen, S. N. et al.， Prac. Ato.69: 2110,1972)。如此制備的Eco//轉(zhuǎn)化體在補(bǔ)充100ng/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過(guò)夜。從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA,并用限制酶&oRI (BioLabCo., USA) 處理，以獲得含470bp重鏈DNA片段的克隆TSKll-Hv。對(duì)于實(shí)施例7中擴(kuò)增的450bp的輕鏈DNA片段進(jìn)行同樣的程序，以獲得 TOP10F轉(zhuǎn)化體?！?co//轉(zhuǎn)化體在補(bǔ)充100pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。 從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒DNA,并用限制酶五"RI (BioLab Co.， USA)處理， 以獲得含450bp輕鏈DNA片段的克隆TSKll-Lv。
實(shí)施例9: cDNA核苷酸測(cè)序
使用Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, U. S. A.)純 化實(shí)施例8中獲得的克隆TSK11-Hv和TSK11-Lv，并進(jìn)行核苷酸測(cè)序。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的重鏈DNA片段含有SEQ ID NO: 5核苷酸序列和SEQ ID NO: 7 氨基酸序列。驗(yàn)證了屬于克隆TSKllHv的三個(gè)具體DNA片段(TSKllHvl、 TSKllHv2和TSKllHv3)，它們的核苷酸序列相同。從克隆TSKllHv獲得的質(zhì)粒 載體命名為pTSKll-Hv。另外，具有質(zhì)粒載體pTSKll-Hv的五.c^/轉(zhuǎn)化體命名為 TOP10F/pTSKll-Hv，按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約 的條款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52， Oun-dong，Yusong-ku， Taejon 305-333， Republic of Korea),保藏編號(hào)是KCTC 10514BP。
另外，發(fā)現(xiàn)獲得的輕鏈DNA片段含有SEQ ID NO: 6核苷酸序列和SEQ ID NO: 8氨基酸序列。驗(yàn)證了屬于克隆TSKllLv的兩個(gè)具體DNA片段(TSKllLvl和 TSKllLv3)，它們的核苷酸序列相同。從克隆TSKllLv獲得的質(zhì)粒載體命名為 pTSKll-Lv。另外，具有質(zhì)粒載體pTSKll-Lv的轉(zhuǎn)化體命名為五.co/Z TOP10F/pTSKll-Lv,按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條 款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52, Oun-dong，Yusong-ku， Taejon 305-333， R印ublic of Korea),保藏編號(hào)是KCTC 10515BP。
根據(jù)從雜交瘤細(xì)胞系TSK11獲得的單克隆抗體可變區(qū)的氨基酸序列分析 (Harris. L. et al" 5W. 4:306-310， 1995; Kabat. E. A. et al.， 5"甲e歸
/7ratoVw t>/ Z附附"訪/og/cfl/ ,' tems《.5th Ed.， 1991; Williams A. F. et al.， ifev./柳m"no/. 6: 381-406， 1988)，發(fā)現(xiàn)重鏈屬于由Kabat定義的11類之外的混雜類，輕
鏈屬于K6-型亞類。
重鏈中識(shí)別抗原的CDR發(fā)現(xiàn)位于氨基酸位置31-35(SEQ ID NO: 9)、50-66(SEQ ID NO: 10)和99-106 (SEQ ID NO: 11)，輕鏈中識(shí)別抗原的CDR發(fā)現(xiàn)位于氨基酸 位置24-35 (SEQ ID NO: 12)、 51-57 (SEQ ID NO: 13)和卯-98 (SEQ ID NO: 14)。
雖然描述并說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案，顯而易見(jiàn)的是，可以在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì) 的情況下進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，本發(fā)明實(shí)質(zhì)僅受所附權(quán)利要求范圍的限定。序 列 表
<110> (株)柳韓洋行
<120>抗人腫瘤壞死因子a的單克隆抗體的抗體可變區(qū)及其編碼基因
<130> P國(guó)171-YUH
<150> KR 1CH2003-0080950
<151> 2003-11-17
<160> 14
<170> Kopat印tln 1.71
<210> 1
<211> 39
<212> 薩
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈正向引物
< 1
actagtcgac atggcttggg tgtggaactt gccattcct
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈反向引物
<400> 2
cccaagcttc caggggccag gggatagacg ggtgg
<210> 3 <211> 3939
30
60 120 180 240 300 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈正向引物
< 3
actagtcgac atggatttac aagtgcagat tttcagctt
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
< 4
ccca柳tta ctggatggtg gga柳tgga
<210> 5 <211> 351 <212> DMA
<213> 編碼重鏈可變區(qū)的cDNA分子的核苷酸序列 <400> 5
caggtccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggag柳cagtcaagatc
tcctgcaaggcttctggatataccttcacacactatggaatgaactgggtgaagcaggct
ccaggag柳gtttaaagtggatgggctgg3ta3acacc3acactggsgagccaagatat
g3tg33g3gttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctat
ttacagatc3acaacctcag3cgtg3gg3cacggctacatatttctgtgcaagatatgat
tcca咖gatttgactgctggggccaaggcaccactctcacagtctcctc3
<210> 6 <211> 327
輕鏈反向引物
> >
o 3
2 2<212> DNA
<213> 編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA分子的核苷酸序列
< 6
caaattgttctC3CCC3gtCtccagcastcatgtctgcatctctagggga acgggtcacc60
atgacctgcactgccagctcjaagtataagttacaattactttc8ictggtEi tcsgcagagg120
ccaggatcctCCCCC幼3Ctctggatttatagctcatccaatctggcttc tggagtccca180
cctcgcatcagtggcagtgggtctggg3cctcttactctctcacaatcag cagcatggag240
gctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatg柳gttccccgtg gacgttcggt300
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgg327
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 編碼重鏈可變區(qū)的cDNA分子的氨基酸序列
<400> 7
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly T卬I le Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu化r Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Arg Arg Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gin Gly Thr Thr 化O 105 110Uu Thr Val Ser Ser 115
<2化> <211> <212> <213>
Gin lie
8
109 PBT
編碼輕鏈可變區(qū)的cDNA分子的氨基酸序列
8
Val
1
Glu
Arg Val
Leu Thr 5
Thr Met 20
Tyr Phe His Trp Tyr 35
lie Tyr Ser Ser Ser 50
Gin Ser Pro Ala
Thr Cys Thr Ala 25
Gin Gin Arg Pro 40
Asn l_eu Ala Ser 55
lie Met 10
Ser Ser
Ser Ala Ser Leu Gly 15
Gly 65
Ser
Gly Asp T卬Thr Phe
Ala Glu
Ser G[y Thr Ser 70
A(a Ala Thr Tyr 85
Gly Gly Gly Thr 100
Tyr Ser Tyr Cys
Lys l_eu 105
Gly Ser Gly Val
l_eu Thr 75
Ser Ile Ser 30
Ser Pro Lys 45
Pro Pro Arg 60
Tyr Asn Leu Trp Ile Ser
lie Ser Ser Met
His Gin 90
Tyr Glu Arg Glu Ile Lys Arg
Ser 95
Glu 80
Pro
<210> <211> <212> <213>
9 5
PRT
重鏈CDRl
<參 9 His Tyr Gly Met Asn 1 5
<210> 10 <211> 17 <212> PRT<213> 重鏈CDR2 < 10
Trp Me Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213>
11
8
PRT
重鏈CDR3
< 11
Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys 1 5
<210> <211> <212> <213>
12 12 PRT
輕鏈CDRl
< 12 Thr Ala Ser Ser Ser 1 5
Ile Ser Tyr Asn Tyr Phe His '10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 輕鏈CDR2
< 13
Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<2化> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 輕鏈CDR3
< 14His Gin Tyr Glu Arg Ser Pro Trp Thr 1 權(quán)利要求
1. 特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子-α的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO12、13和14的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求l的輕鏈可變區(qū)，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
3. 權(quán)利要求l的輕鏈可變區(qū)，其由包含SEQIDNO:6的核苷酸序列的cDNA分子 編碼。
4. 編碼特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子-a的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸分子，其中 所述的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列。
5. 權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序 列。
6. 權(quán)利要求4的核酸分子，其包含SEQIDNO:6的核苷酸序列。
7. 包含權(quán)利要求4的核酸分子的重組載體pTSKll-Lv。
8. 轉(zhuǎn)化體五."http://1^^1(^*181^11-1^,其保藏編號(hào)為KCTC 10515BP，轉(zhuǎn)化有權(quán)利 要求7的重組載體pTSKll-Lv。
全文摘要
特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子-α的單克隆抗體的抗體可變區(qū)，含有具有特異性互補(bǔ)決定區(qū)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的至少之一。還提供了編碼它的核酸分子、含有該核酸分子的重組載體和轉(zhuǎn)化該重組載體的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/28GK101440131SQ200810006270
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2004年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月17日
發(fā)明者姜熙日, 宋武泳, 樸相久, 李載善, 柳泰亨, 羅康仁, 金昶碩, 高仁泳 申請(qǐng)人:(株)柳韓洋行