專(zhuān)利名稱(chēng)：Tnf超家族受體的剪接轉(zhuǎn)換寡聚物，以及它們治療疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體內(nèi)或體外制備TNF α受體(TNFR)的剪接變體的組合物和方法，以及 所得到的TNFR蛋白質(zhì)變體。利用剪接轉(zhuǎn)換(splice switching)寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚 物(SSOs)控制前信使RNA分子的剪接和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)可以制備這種變體。依照本發(fā) 明的優(yōu)選的 SSOs 靶向 TNFRl (TNFRSF1A)或 TNFR2 (TNFRSF1A)前信使 RNA (pre-mRNA)的夕卜 顯子7或8，典型地會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生分別包含部分或全部外顯子7或8缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn) 靶向外顯子7的SSOs會(huì)產(chǎn)生治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特 征在于它們基本上不能或不能補(bǔ)充RNaseH。
背景技術(shù)：
在此引入作為參考的W02007/05889記載了與前信使RNA剪接、TNF-α在炎癥和 炎性病癥中的作用以及經(jīng)由TNFl和TNF2介導(dǎo)的TNF- α活性的媒介作用有關(guān)的背景技術(shù)。TNF-α是以膜結(jié)合的同型三聚體形式存在的炎性細(xì)胞因子原，由蛋白酶TNF-α 轉(zhuǎn)換酶(TACE)釋放到循環(huán)中。被引入循環(huán)中的TNF-α是損傷和感染引起的炎性反應(yīng)的 介質(zhì)。炎性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、牛皮癬和牛皮癬關(guān)節(jié)炎 的進(jìn)展都涉及 TNF-α 的作用(Palladino, Μ. A.，et al.，2003，Nat. Rev. Drug Discov. 2 736-46)。短時(shí)間(acute)接觸高水平的TNF-α將導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生，這一現(xiàn)象在重感染期 間已經(jīng)發(fā)生；膿毒癥的癥狀包括休克、缺氧、多器官衰竭和死亡。長(zhǎng)期(chronic)低劑量的 TNF-α可以導(dǎo)致一種特征在于體重減輕、脫水和脂肪減少的與惡性腫瘤有關(guān)的疾病一惡 病質(zhì)。TNF-α的活性主要由兩個(gè)不同基因TNFRl和TNFR2編碼的兩個(gè)受體介導(dǎo)。TNFRl 是分子量為大約55千道爾頓(kDa)的膜結(jié)合蛋白，而TNFR2是分子量為75kDa的膜結(jié)合 蛋白。在金屬蛋白酶的作用下，兩個(gè)受體的可溶性細(xì)胞外域在一定程度上可以從細(xì)胞膜上 脫落下來(lái)。此外，TNFR2的前信使RNA進(jìn)行選擇性剪接，可以產(chǎn)生有活性的全長(zhǎng)膜結(jié)合受 體(mTNFR2)或缺乏外顯子7和8的包含跨膜區(qū)的編碼序列的被分泌的假(decoy)受體 (sTNFR2)。STNFR2結(jié)合TNF-α，但不引發(fā)生理反應(yīng)，因此會(huì)降低TNF-α的活性。雖然還沒(méi) 有鑒定內(nèi)源性的被分泌的TNFRl剪接變體，但這兩個(gè)受體相似的基因結(jié)構(gòu)明確表明存在產(chǎn) 生這種TNFRl同種型(isotype)的可能性。TNF超家族成員活性過(guò)強(qiáng)所產(chǎn)生的效應(yīng)，導(dǎo)致控制TNFR受體的可選擇性剪接是有 用的，這樣分泌形式的量就增加了，完整膜形式的量就減少了。本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo) 的剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)。SSOs類(lèi)似于反義寡核苷酸(ASONs)。然 而，與ASON相反，SSOs能與靶RNA雜交，但不會(huì)導(dǎo)致靶RNA被RNase H降解。SSOs已經(jīng)被用于修飾某些地中海貧血中發(fā)現(xiàn)的異常剪接(KoIe的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，976，879 ；Lacerra, G.，et al.，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 9591)。對(duì) IL-5 受體 α-鏈(IL-5RCI)的研究表明靶向跨膜外顯子的SSOs會(huì)增加分泌形式的合成，同時(shí)會(huì)抑制 完整膜形式的合成(Bennett 的美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，210，892 ；Karras, J. G.，et al.，2000，MoL Pharm, 58 380)。W000/58512也公開(kāi)了將IL-5R剪接修改為可溶形式的實(shí)施例(實(shí)施例25 和 30)。SSOs已經(jīng)被用于產(chǎn)生Tone中檢測(cè)到的主要的⑶40剪接變體，Tone中跨膜區(qū)上游 的外顯子6的缺失導(dǎo)致蛋白質(zhì)的閱讀框發(fā)生了改變。在SSO產(chǎn)生預(yù)期的mRNA剪接變體時(shí)， 變體mRNA的翻譯產(chǎn)品也變得好象不穩(wěn)定，因?yàn)闆](méi)有檢測(cè)到分泌的受體(Siwkowski，A.M.， et al. ,2004,Nucleic Acids Res. 32 ;2695)。Tone et al.，PNAS，2001，98(4) :1751_1756 預(yù)計(jì)缺乏外顯子6的小鼠剪接變體不是穩(wěn)定的分泌形式的⑶40 (參見(jiàn)1756頁(yè)，右欄)。W002/088393公開(kāi)了具有2' MOE翼和脫氧缺口的靶向小鼠TNFR2的gapmer寡核 苷酸，這些寡核苷酸被用來(lái)補(bǔ)充(recruit) RNAseH以降解TNFR2mRNA(mRNA下調(diào))。本發(fā)明 的SSO寡核苷酸不是設(shè)計(jì)用來(lái)用來(lái)補(bǔ)充RNaseH的，而是用來(lái)破壞TNFR前信使RNA的加工 的，因此會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生穩(wěn)定分泌形式的結(jié)合配體的TNFR剪接變體。 US2005/202531教導(dǎo)了反義寡核苷酸可以用來(lái)改變⑶40的可選擇的剪接模式的 內(nèi)容，但它沒(méi)有教導(dǎo)或提供任何有關(guān)應(yīng)被SSOs靶向的CD40剪接元件或區(qū)域的啟示，也沒(méi)有 教導(dǎo)或提供任何有關(guān)應(yīng)該使用哪個(gè)序列的啟示。發(fā)明概述本發(fā)明使用剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)控制來(lái)自TNFR超家族受 體的可選擇性剪接，這樣，被分泌的穩(wěn)定可溶的配體結(jié)合形式的數(shù)量就增加了，完整膜形式 的數(shù)量就減少了。本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和16個(gè)核苷酸堿基之間的寡聚物，包含由長(zhǎng)度在8和16個(gè) 堿基之間的核苷酸組成的毗連(contiguous)核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與 SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID N04中存在的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域 互補(bǔ)，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個(gè)或5個(gè)以上毗連的DNA (2’ -脫氧核糖核苷) 單體單位，其包含選自由β -D-氧LNA，硫代-LNA，氨基-LNA和ena-LNA組成的組的至少一 個(gè)核苷酸類(lèi)似物。任選地，在上述實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列包含或由至少一個(gè)更進(jìn)一步另外的 (further)核苷酸類(lèi)似物(X)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，更進(jìn)一步的核苷酸類(lèi)似物單位獨(dú)立地選自由2' -OMe-RNA單 位，2 ‘-氟-DNA單位，2 ‘ -MOE RNA單位和LNA組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物或毗連核堿基序列由長(zhǎng)度在8和15個(gè)堿基之間的核堿 基序列組成，例如，由9、10、11、12、13或14個(gè)核堿基組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于其中。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 245-SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 251-263、SEQ ID NO 264-SEQ ID NO 279 和 SEQ ID N0280-SEQ ID NO 295 組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的毗連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 130、SEQ ID NO146和SEQ ID NO 162組成的組的核堿基序列或核堿基基序相同，或者存在于其中。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 244、SEQ ID NO 264和SEQ ID NO 280組成的組。本發(fā)明涉及剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的 SSOs靶向TNFRl (TNFRSF1A)或TNFR2 (TNFRSF1A)前信使RNA的外顯子7，典型地會(huì)導(dǎo)致 產(chǎn)生分別包含部分或全部外顯子7缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn)靶向外顯子7的SSOs會(huì)產(chǎn)生 治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它們基本上不能補(bǔ)充 (recruiting)RNaseH0本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和50個(gè)核苷酸堿基之間的寡聚物，例如長(zhǎng)度在 8和16個(gè) 核苷酸堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由長(zhǎng)度在8和50個(gè)堿基之間的核苷酸組成 的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與SEQID NO 1,SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 4中存在的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)，優(yōu)選完全互補(bǔ)，而且所述的毗連核堿 基序列不包含5個(gè)或5個(gè)以上毗連的DNA(2’ -脫氧核糖核苷)單體單位。SEQ ID NO USEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 與 PCT/US2006/043651 中的 SEQ ID NO U SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3 或 SEQID NO 4 相同。SEQ ID NO 247 與 SEQ ID NO 1 反向互補(bǔ)。SEQ ID NO 248 與 SEQ ID N02 反向互 補(bǔ)。SEQ IDNO 249 與 SEQ ID NO 3 反向互補(bǔ)。SEQ ID NO 250 與 SEQID NO 4 反向互補(bǔ)。因此，本發(fā)明優(yōu)選包含或由與SEQ ID NO 247、SEQ ID NO 248、SEQID NO 249或 SEQ ID NO 250的對(duì)應(yīng)區(qū)域(即一部分)同源(優(yōu)選100%同源)的毗連核堿基序列組成 的寡聚物。本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和50個(gè)核苷酸堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由 長(zhǎng)度在8和50個(gè)堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列存 在于 SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249 或 SEQ ID NO 250 中存在的毗連核苷 酸的(對(duì)應(yīng))區(qū)域，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個(gè)或5個(gè)以上毗連的DNA(2’ -脫 氧核糖核苷)單體單位。本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和50個(gè)核苷酸堿基(nucleobase)之間的寡聚物，包含(或 由其組成)由長(zhǎng)度在8和50個(gè)核堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗 連核堿基(nucleobase)序列與 SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 中存在的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)，優(yōu)選完全互補(bǔ)，當(dāng)在具有互補(bǔ)mRNA分子的復(fù)合物的 雙鏈體(duplex)中形成時(shí)，其中所述的寡聚物基本上不能或不能補(bǔ)充RNAseH。本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和50個(gè)核堿基之間的寡聚物，包含(或由其組成)由長(zhǎng)度 在8和50個(gè)堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列存在于 SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249 或 SEQ ID NO 250 中存在的毗連核苷酸的 (對(duì)應(yīng))區(qū)域，其中當(dāng)在具有互補(bǔ)mRNA分子的復(fù)合物的雙鏈體中形成時(shí)，所述的寡聚物基本 上不能或不能補(bǔ)充RNAseH。更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的寡聚物和共價(jià)附著于所述寡聚物的至少 一個(gè)非核苷酸部分的偶聯(lián)物。更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的寡聚物或偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的 載體的藥物組合物。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了改變TNFa受體前信使RNA mRNA剪接的方法，其中前 信使RNA mRNA選自表達(dá)TNFRSFIA TNFa受體或TNFRSF1BTNF α受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 TNFRSF1A或TNFRSF1A，所述方法包括給細(xì)胞施用本發(fā)明的寡聚物、偶聯(lián)物或藥物組合物。本發(fā)明也涉及了在表達(dá)所述TNF α受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備TNFRSF1A TNFa 受體或TNFRSF1B TNFa受體的可溶形式的方法，所述方法包括給細(xì)胞施用本發(fā)明的寡聚 物、偶聯(lián)物或藥物組合物。上述方法可以更進(jìn)一步地包括純化TNFRSF1A TNFa受體或TNFRSF1BTNF α受體 的可溶形式的步驟。本發(fā)明也提供了在表達(dá)所述TNF α受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增加TNFRSF1A TNFa 受體或TNFRSF1B TNFa受體的可溶形式表達(dá)的方法，所述方法包括給細(xì)胞施用本發(fā)明的寡 聚物、偶聯(lián)物或藥物組合物。上述方法可以在體內(nèi)或體外實(shí)施。 本發(fā)明提供了用本發(fā)明的寡聚物制備用于治療炎性疾病或狀態(tài)(condition)的 藥物制劑的用途。本發(fā)明提供了用于治療炎性疾病或狀態(tài)的偶聯(lián)物。本發(fā)明提供了治療或預(yù)防炎性疾病或狀態(tài)的方法，所述方法包括給患有或很可能 患有所述炎性疾病的病人施用本發(fā)明的藥物組合物的步驟。本發(fā)明提供了在外顯子7編碼的跨膜結(jié)合域包含缺失的TNF α受體的分離或純化 的可溶形式，其中所述TNF α受體選自TNF α受體TNFRSF1A或TNFRSF1B。本發(fā)明提供了缺乏外顯子7編碼的跨膜結(jié)合域的TNF α受體的分離或純化的可溶 形式，其中所述TNF α受體選自TNF α受體TNFRSF1A或TNFRSF1B。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了編碼TNF α受體的可溶形式的核酸。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了包含本發(fā)明的核酸的載體，例如表達(dá)載體。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了制備可溶形式的TNFa受體的方法，所述方法包括在允 許本發(fā)明的核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞的步驟，以及隨后從所述宿主細(xì)胞分離 所述的可溶形式的TNF α受體的步驟。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了包含本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或 依照本發(fā)明的方法制備的TNFa受體，以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了利用本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或 依照本發(fā)明的方法制備的TNFa受體制備用于治療炎性疾病或狀態(tài)的藥物制劑的用途。本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體或依照 本發(fā)明的方法制備的TNFa受體用于治療炎性疾病或狀態(tài)的用途。相關(guān)案件PCT/US2006/043651、PCT/US2007/10557、US 11/595，485 和 US 11/799，117在此都全部引入作為參考。附圖簡(jiǎn)述下列附圖與PCT/US2007/10557中描述的那些附圖相同。圖20對(duì)本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)是新 的。

圖1概略地描述了人TNFR2的結(jié)構(gòu)。相應(yīng)的外顯子和內(nèi)含子分別用盒(box)和線(xiàn)代表。信號(hào)序列和跨膜區(qū)域用陰影表示。形成信號(hào)序列和跨膜區(qū)邊界的殘基，以及最后的 殘基在圖下面標(biāo)出。外顯子邊界在圖上面標(biāo)出；如果外顯子的3’端和下面外顯子的5’端 具有相同的殘基編號(hào)，那么剪接接點(diǎn)將位于編碼該殘基的密碼子內(nèi)。圖2A用圖表解釋了來(lái)自SSO處理的原代(primary)人肝細(xì)胞的可溶性TNFR2的 數(shù)量。所標(biāo)示的SSO以50nM的濃度被轉(zhuǎn)染到原代人肝細(xì)胞中。48小時(shí)之后，利用從R&D 系統(tǒng)(Minneapolis，MN)獲得的Quantikine 人 sTNFRII ELISA 試劑盒(Quantikine(R) Human sTNF RII ELISA kit)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析細(xì)胞外培養(yǎng)基中的可溶 性TNFR2。誤差線(xiàn)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖2B利用人TNFR2特異的引物，通過(guò)RT-PCR 分析總RNA中的TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換。靶向外顯子七的SSOs導(dǎo)致從全長(zhǎng)TNFR2mRNA (FL)轉(zhuǎn) 變成TNFR2 Δ 7mRNA ( Δ 7)。SSO 3083是沒(méi)有TNFR2剪接轉(zhuǎn)換能力的對(duì)照SS0。圖3顯示了用靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSO 10-mers處理的L929細(xì)胞的剪接產(chǎn) 物。用標(biāo)示的SSO濃度(50或IOOnM)轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，并在24小時(shí)后用RT-PCR評(píng)估TNFR2 的剪接轉(zhuǎn)換。PCR引物用來(lái)擴(kuò)增外顯子5到外顯子9，這樣486bp的條帶就可以代表"全 長(zhǎng)〃(FL)TNFR2。408bp的條帶代表缺乏外顯子7(Δ7)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 圖4Α和4Β顯示了用靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSO 10-mers處理的小鼠的剪接 產(chǎn)物。先將標(biāo)示的SSOs再次懸浮在鹽水中，然后以25mg/kg/天的劑量通過(guò)腹腔(i. p.)注 射到小鼠體內(nèi)，共注射5天。在SSO注射之前，以及最后的SSO注射之后的10天對(duì)小鼠進(jìn) 行預(yù)放血處理，并處死小鼠。在處死小鼠時(shí)，通過(guò)RT-PCR分析來(lái)自肝臟的總RNA中的TNFR2 剪接轉(zhuǎn)換。FL-全長(zhǎng) TNFR2 ； Δ 7-TNFR2 Δ 7 (圖 4Α)。利用從 R&D 系統(tǒng)(Minneapolis，MN) 獲得的Quantildne 小鼠 sTNF RII ELISA 試劑盒(Quantikine(R)Mouse sTNF RIIELISA kit)，通過(guò)ELISA確定在SSO注射之前(前)和之后(后)所獲得的血清中的TNFR2A7的 濃度(圖4B)。誤差線(xiàn)表示來(lái)自相同樣品的3個(gè)獨(dú)立讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖5描述了不同長(zhǎng)度的SSOs的剪接轉(zhuǎn)換能力。與圖2相同，用標(biāo)示的SSO轉(zhuǎn)染原 代人肝細(xì)胞并通過(guò)RT-PCR(上部網(wǎng)格)和ELISA(下部網(wǎng)格)分析TNFR2的表達(dá)。誤差線(xiàn) 表示來(lái)自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖6A和6B圖解了 SSO處理小鼠肝臟中的TNFR2 Δ 7mRNA的誘導(dǎo)情況。圖6A 對(duì) 來(lái)自SSO 3274處理小鼠肝臟的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，在1. 5 %的瓊脂糖凝膠上使產(chǎn)物顯 影。外顯子6-外顯子8接合點(diǎn)的序列顯示在圖6B中。圖7A和7B圖解了 SSO處理的原代人肝細(xì)胞中的TNFR2 Δ 7mRNA的誘導(dǎo)情況。圖 7A 對(duì)來(lái)自SSO 3379處理細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，在1. 5%的瓊脂糖凝膠上使產(chǎn)物 顯影。外顯子6-外顯子8接合點(diǎn)的序列顯示圖7B中。圖8A和8B圖解說(shuō)明了 SSO 3378、3379和3384所產(chǎn)生的TNFR2前信使RNA剪接轉(zhuǎn) 換的劑量依賴(lài)性。用所示的1-150ηΜ的SSO轉(zhuǎn)染原代人肝細(xì)胞。48小時(shí)后，收獲細(xì)胞以獲 取總RNA，并收集細(xì)胞外培養(yǎng)基。圖8A 利用人TNFR2特異的引物，通過(guò)RT-PCR分析總RNA 中的TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換。對(duì)每種SS0，都以剪接轉(zhuǎn)換數(shù)量作為SSO濃度的函數(shù)進(jìn)行繪圖。圖 8B 通過(guò)ELISA確定細(xì)胞外培養(yǎng)基中的可溶性TNFR2的濃度，并將其作為SSO的函數(shù)繪圖。 誤差線(xiàn)表示至少2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖9圖解說(shuō)明了來(lái)自L(fǎng)929細(xì)胞的分泌的TNFR2剪接變體的檢測(cè)情況。用標(biāo)示的 SSOs轉(zhuǎn)染細(xì)胞。72小時(shí)以后，除去細(xì)胞外培養(yǎng)基并通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為pg可溶性TNFR2/mL。圖10顯示了腹腔內(nèi)(i.p.)注射SSO 3274 (上部)和3305 (底部)的小鼠體內(nèi)的 剪接產(chǎn)物。以25mg/kg/天的劑量腹膜內(nèi)注射SSO 32744天(4/1和4/10)或10天(10/1)。 在最后一次注射后1天(4/1和10/1)或10天(4/10)處死小鼠，并通過(guò)RT-PCR分析來(lái)自 肝臟的總RNA中的TNFR2剪接轉(zhuǎn)換。每天按照標(biāo)示劑量注射SSO 3305，共注射4天。第二 天處死小鼠，并采用與3274處理動(dòng)物相同的方法分析肝臟。圖IlA圖解說(shuō)明了 SSO處理10天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的數(shù)量。以 25mg/kg/天的劑量給小鼠腹膜內(nèi)注射標(biāo)示的SSO或生理鹽水(每組η = 5)，共10天。在 注射開(kāi)始前4天和最后一次注射后所標(biāo)示的天數(shù)收集血清。在第10天，通過(guò)圖22描述的 ELISA方法分析血清，處死小鼠并按照?qǐng)D30的描述通過(guò)RT-PCR分析肝臟的TNFR2的剪接轉(zhuǎn) 換(圖11Β)。
圖12Α圖解了 SSO處理27天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的數(shù)量。采用圖11 的描述處理小鼠，除了在最后一次注射后的第27天收集血清樣品外。SSOs 3083和3272是 沒(méi)有TNFR2剪接轉(zhuǎn)換能力的對(duì)照。在第27天，處死小鼠并按照?qǐng)D11的描述通過(guò)RT-PCR分 析肝臟的TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換(圖11Β)。圖13Α和13Β描述了以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測(cè)試中，來(lái)自SSO處理小鼠的血清的抗 TNF-α活性，其中在SSO處理后第5天(圖16Α)和第27天(圖16Β)收集血清樣品。用 0. Ing/mL的TNF- α，或TNF- α ]和從標(biāo)示SSO處理小鼠獲取的10%血清處理L929細(xì)胞。 24小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞生存能力，并參照未處理細(xì)胞將其標(biāo)準(zhǔn)化。圖14利用圖13中描述的細(xì)胞存活試驗(yàn)，比較了來(lái)自標(biāo)示SSO寡核苷酸處理小鼠 血清的抗TNF-alpha活性與來(lái)自Sigma 和Enbrel 的重組的可溶性TNFR2 (rsTNFR2)細(xì) 胞外域的活性。圖15A和15B比較了 muTNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)(圖15A)禾口 mRNA(圖15B)的穩(wěn)定性。以 25mg/kg/天的劑量，每天給小鼠注射SSO 3272、SSO 3274或SSO 3305 (η = 5) 0最后一次 注射后，在所標(biāo)示的那天對(duì)小鼠進(jìn)行放血處理，并測(cè)量血清的TNFR2濃度。在最后一次注射 SSO后所標(biāo)示的那一天處死小鼠，按照?qǐng)D10的描述對(duì)獲得的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析。圖16描繪了最后一次注射10天后，分別以蛋白質(zhì)或mRNA含量的百分比表示的 TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)(虛線(xiàn))和mRNA(實(shí)線(xiàn))水平隨時(shí)間的變化。圖17圖解了用TNFR2 Δ 7哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HeLa細(xì)胞表達(dá)的TNFR2 Δ 7的 抗TNF-alpha活性的劑量依賴(lài)性。用標(biāo)示的小鼠或人TNFR2 Δ 7轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48小時(shí)后 收集細(xì)胞外培養(yǎng)基。通過(guò)ELISA確定培養(yǎng)基(media)中的TNFR2 Δ 7的濃度，并制備系列稀 釋液。通過(guò)圖14中的L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定這些稀釋液的抗TNF-alpha活性。圖18顯示了通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離的已表達(dá)的小鼠㈧和人(B) TNFR2D7蛋白。用標(biāo)示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。48小時(shí)后，收集并濃縮細(xì)胞外培養(yǎng)基，并 將細(xì)胞收集在RIPA溶解緩沖劑中。通過(guò)PAGE分離樣品中的蛋白質(zhì)，并利用識(shí)別人和小鼠 TNFR2D7蛋白質(zhì)C末端的TNFR2第一抗體(Abeam)進(jìn)行western印跡。培養(yǎng)基，用標(biāo)示質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的細(xì)胞外培養(yǎng)基樣品；裂解物，用標(biāo)示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的細(xì)胞裂解 物。CM，來(lái)自未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)基；CL，來(lái)自未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的對(duì)照細(xì)胞裂 解物。+，分子量標(biāo)記(kDal)。
圖19顯示了純化的His標(biāo)記的人和小鼠TNFR2D7。按照?qǐng)D18制備包含標(biāo)示的 TNFR2D7蛋白質(zhì)的未濃縮的細(xì)胞外培養(yǎng)基。大約32mL培養(yǎng)基被用到ImL HisPur鈷離心柱 (HisPur cobalt spin column) (Pierce)上，用包含150mM咪唑的ImL緩沖劑洗脫結(jié)合的蛋 白質(zhì)。通過(guò)PAGE分析每個(gè)樣品，按照?qǐng)D18進(jìn)行western印跡分析。1144-4和1319-1道的 多條條帶表明出現(xiàn)了不同糖基化形式的TNFR2D7。圖20本發(fā)明的寡聚物基序與它們的靶序列SEQ ID NO 1 (圖20A)、SEQID NO 2 (圖 20B)、SEQ ID NO 3(圖 20C)和 SEQ ID NO 4(圖 20D)的比對(duì)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過(guò)控制編碼TNF受體(TNFR1和TNFR2)和來(lái)自TNFR超家族的其 他細(xì)胞因子受體的前信使RNA的剪接來(lái)控制所述受體表達(dá)的組合物和方法。更具體地說(shuō)， 本發(fā)明導(dǎo)致分泌形式的表達(dá)增加，完整膜形式的表達(dá)減少。此外，本發(fā)明可用于治療與細(xì)胞 因子活性過(guò)度相關(guān)的疾病。存在于完整膜形式mRNA中，但從初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(前信使RNA)中被除去以產(chǎn)生分泌 形式的mRNA的外顯子被稱(chēng)為"跨膜外顯子"。本發(fā)明涉及與跨膜外顯子和/或受體前信使 RNA的鄰近內(nèi)含子這兩者中的任何一個(gè)互補(bǔ)的核酸和核酸類(lèi)似物?；パa(bǔ)性可以以存在于覆 蓋剪接位點(diǎn)的前信使RNA序列中的序列為基礎(chǔ)，包括但不局限于，以覆蓋(或跨越span)外 顯子_內(nèi)含子接合點(diǎn)的序列為基礎(chǔ)，或者單獨(dú)地以?xún)?nèi)含子的序列或外顯子的序列為基礎(chǔ)。存在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種可選擇的化學(xué)過(guò)程0。一個(gè)重要的特征是能夠與 靶RNA雜交，不會(huì)導(dǎo)致靶被RNase H降解為2’ -脫氧寡核苷酸(“反義寡核苷酸"在下文 中被稱(chēng)為"AS0N")。為了清楚起見(jiàn)，這種化合物將被稱(chēng)為剪接-轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)。本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解SSO包括，但是不局限于2’0_修飾的寡核苷酸、硫代磷酸核糖核苷、 以及肽核酸和缺乏基于呋核亞硝脲(ribofuranosyl)的連接的其他聚合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及給病人或活的受試者施用SSOs以治療炎性疾病或狀 況的方法。施用的SSOs會(huì)改變前信使RNA的剪接，會(huì)產(chǎn)生編碼TNFR超家族受體的穩(wěn)定分 泌的配體結(jié)合形式的剪接變體，因此會(huì)降低配體結(jié)合受體的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明涉及通過(guò)給細(xì)胞施用SSOs，在細(xì)胞中產(chǎn)生TNFR超家族受體的穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形 式的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及可以結(jié)合TNF的全長(zhǎng)或成熟的蛋白質(zhì)，其由來(lái)源于哺 乳動(dòng)物TNFR基因的cDNA編碼，在該cDNA中，外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏 外顯子7(" TNFR δ 7〃)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含TNFR δ 7的藥物組合 物。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)施用包含TNFR δ 7的藥物組合物治療炎性 疾病或狀況的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼TNFR δ 7的核酸。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及包含編碼TNFR δ 7的核酸的藥物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達(dá)載體。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)增加哺乳動(dòng)物血清中的可溶性TNFR水平的方法。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明涉及用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在適合于表達(dá)TNFR δ 7情況下，通過(guò)培養(yǎng)用包含編碼TNFR 57的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)TNFR δ 7的方法。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)施用包含編碼TNFR δ 7的核酸的表達(dá)載體來(lái)治療炎性疾病或狀況 (condition)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了改變哺乳動(dòng)物TNFR2前信使RNA剪接的能產(chǎn)生哺乳 動(dòng)物TNFR2蛋白質(zhì)的剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)，所述TNFR2蛋白質(zhì)可以結(jié)合TNF，而且其外顯 子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7 (“ TNFR2 δ 7")。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案涉及給病人或活的受試者施用SSOs以治療炎性疾病或狀況的方法。所施用的SSOs能夠 改變哺乳動(dòng)物TNFR2前信使RNA的剪接以產(chǎn)生TNFR2 δ 7。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及通過(guò)給細(xì)胞施用SSOs以在細(xì)胞中產(chǎn)生TNFR2 δ 7的方法。在此處的附圖和下文的說(shuō)明書(shū)中將詳細(xì)討論本發(fā)明的上述目標(biāo)及其他方面。
寡聚物在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物由毗連的核酸堿基序列組成。然而，寡聚物可能包括側(cè)接在毗連的核酸堿基序列的5’或3’端的其他的核酸堿 基序列，或者5’和3’端的更遠(yuǎn)的核酸堿基序列，這一點(diǎn)也是能夠想象到的。這些5’和/ 或3’'側(cè)接'區(qū)的合適長(zhǎng)度為1、2、3、4、5或6個(gè)核酸堿基。在體內(nèi)使用時(shí)，預(yù)計(jì)位于本發(fā) 明的寡聚物末端的DNA或RNA核堿基可以被內(nèi)源性外切核酸酶從寡聚物上切割下來(lái)，因此， 包含側(cè)接的DNA或RNA單位不影響寡聚物的體內(nèi)性能。在一個(gè)實(shí)施方案中，毗連核堿基序列3 ’末端側(cè)接了 1、2或3個(gè)DNA或RNA單位。 在固相合成寡聚物期間經(jīng)常使用3’ DNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列5’末端側(cè)接了 1、2或3個(gè)DNA或RNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了長(zhǎng)度在8和50個(gè)核堿基之間的寡聚物，包含由 長(zhǎng)度在8和50個(gè)堿基之間的核苷酸組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與 存在于SEQ ID NO 1,SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū) 域(即所述的毗連核堿基序列存在于SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249或 SEQ ID NO 250中的毗連核苷酸區(qū)域(‘對(duì)應(yīng)'或部分))互補(bǔ)，而且所述的毗連核堿基序 列不包含5個(gè)或5個(gè)以上毗連的DNA (2’ -脫氧核糖核苷)單體單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)寡聚物在具有互補(bǔ)mRNA分子的復(fù)合物的雙鏈體中形成時(shí)， 所述的寡聚物基本上不能補(bǔ)充RNAseH。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列包含或由核苷酸類(lèi)似物(X)組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物⑴獨(dú)立地選自由2’ -0-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA單位，2，-氨基-DNA單位、2 ‘-氟-DNA單位，LNA單位、PNA單位、HNA單位、 INA單位組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，毗連核堿基序列包含核苷酸類(lèi)似物(X)和核苷酸(X)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列不包含多于7個(gè)毗連核苷酸類(lèi)似物單位(X) 的區(qū)域，例如不超過(guò)6個(gè)、不超過(guò)5個(gè)、不超過(guò)4個(gè)、不超過(guò)3個(gè)、不超過(guò)2個(gè)的毗連核苷酸 類(lèi)似物單位(X)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列最靠近5’端(5’ most)的核堿基是核苷酸類(lèi) 似物(X)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列最靠近5’端的核堿基是核苷酸單位(X)，例如DNA(2’ 一脫氧核糖核苷)單體單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列最靠近3’端的核堿基是核苷酸類(lèi)似物(X)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列最靠近3’端的核堿基是核苷酸單位(X)，例 如DNA(2’一脫氧核糖核苷)單體單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列包含或由核苷 酸和核堿基的交替(alternating)序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸和核堿基的交替 序列選自由 Xx，xX，Xxx，xXx, xxX, XXx，XxX，xXX, XXXx，XXxX，XxXX，xXXX, xxxX, xxXx, xXxx, Xxxx，XXXXx, XXXxX，XXxXX, XxXXX, χΧΧΧΧ, χχχχΧ, χχχΧχ, χχΧχχ, χΧχχχ, Xxxxx 組成的組的 序列，其中所述的交替序列可任意重復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在毗連核堿基序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)重復(fù)的序列，其中可以任意 截短5’和或3’端的重復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含所述的至少一個(gè)LNA類(lèi)似物單位和至少一 個(gè)不同于LNA的更進(jìn)一步的核苷酸類(lèi)似物單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸由至少一個(gè)X1X2X1或X2X1X2序列組成，其中X1 是 LNA, X2是不同于LNA的核苷酸類(lèi)似物，例如2，-OMe RNA單位和2，-氟DNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸的核堿基序列由交替的(alternative)X1和X2 單位組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物單位，例如X，獨(dú)立地選自由2’ -OMeRNA單位、 2，-氟-DNA單位和LNA單位組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物單位(X)是LNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA單位選自由氧-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA和ena_LNA組 成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列不包含毗連的由5個(gè)或5個(gè)以上獨(dú)立地選 自DNA和LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列，其中存在于毗連子序列中的LNA呈 α -L-構(gòu)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列不包含毗連的由5個(gè)或5個(gè)以上獨(dú)立地選 自DNA和LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列，其中存在于毗連子序列中的LNA是 α -L-氧-LNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有LNA單位都是β -D構(gòu)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，毗連核堿基序列只由LNA和DNA單位組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，毗連核堿基序列只由LNA和DNA單位組成。優(yōu)選β -D構(gòu)型的 LNA單位，例如β-D-氧或β-D-硫代或β-D-氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，LNA選自由β -D-氧-LNA、β -D-硫代-LNA、β -D-氨基-LNA、 ena-LNA組成的組，任選地包括由α -L-氧-LNA、α -L-硫代-LNA或α -L-氨基-LNA組成 的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列在8和16之間，例如長(zhǎng)度為9、10、11、12、13、 14、15或16個(gè)核堿基，或者在10-14、11-14或12-14之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列在8和15之間，例如長(zhǎng)度為8、9、10、11、12、 13、14或15個(gè)核堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列包含與存在于SEQ ID NO 1或SEQID NO 3中的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)的核堿基，即存在于SEQ ID NO 247或SEQ ID N0249中的毗連核苷酸的 (對(duì)應(yīng))區(qū)域的核堿基。在一個(gè)實(shí)施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 1的51_164、SEQ ID NO 2的51-79、SEQ ID NO 3的51-127和SEQ ID NO 4的51-85所組成的組中的序列中存在 的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO
1的 1-50、SEQ ID NO 1 的 165-215、SEQID NO 2 的 1-50、SEQ ID NO 2 的 80-130、SEQ ID NO 3 的 1-50、SEQ ID NO 3 的 128_178、SEQ ID NO 4 的 1-50 和 SEQ ID NO 4 的 86-136 所 組成的組中的序列中存在的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，B比連核堿基序列包含與5’外顯子/內(nèi)含子3’或3’內(nèi)含子/ 外顯子5’邊界互補(bǔ)的核堿基序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，5’外顯子/內(nèi)含子3’或3’內(nèi)含子/外顯子5’邊界選自由 SEQ ID NO 1 的核堿基 50-51、SEQ ID NO 1 的 164-165、SEQ ID NO 2 的 50-51、SEQ ID NO
2的 79-80、SEQ ID NO 3 的 51_52、SEQ ID NO 3 的 129_139、SEQ ID NO 4 的 50_51、SEQ ID No 4的81-82所組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 74到SEQ IDN0105組成 的組的序列中存在的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 74,SEQ IDN075、SEQ ID NO 77,SEQ ID NO 78,SEQ ID NO 80,SEQ ID NO 82 禾口 SEQ ID NO 84 組成的組的核堿基序 列相同，或者存在于該序列中。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 85、SEQ IDNO 86、SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 89組成的組的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 82 和 SEQ ID NO 84 組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物選自由SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQID NO 88和 SEQ ID NO 89組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列包含與選自SEQ ID No 3的核苷酸區(qū)域 47-49,54-56和122-124互補(bǔ)的核堿基序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 130-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 146-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 162-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于該序列中。在一個(gè)實(shí)施方案中，B比連核堿基序列與選自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145,SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177組成的組的核堿基序列或核堿基基序相 同，或者存在于該序列中。一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物選自由 SEQ ID NO 243,SEQ ID NO 244,SEQID NO 245 或 SEQ ID NO 246組成的組。一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含共價(jià)附著于所述寡聚物上的至少一個(gè)非核苷酸部 分。剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)另一個(gè)方面，本發(fā)明使用剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)控制TNFR2的選擇性剪接，以致缺乏外顯子7的可溶性配體結(jié)合形式的數(shù)量增加，完整膜形式的數(shù)量 減少。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療與tnf活性過(guò)度相關(guān)的疾病。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及給病人施用SSOs以治療炎性疾病或狀況的方 法。所施用的SSOs能夠改變前信使RNA的剪接以產(chǎn)生缺乏外顯子7的哺乳動(dòng)物TNFR2蛋 白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)給細(xì)胞施用SSOs以在細(xì)胞中產(chǎn)生缺乏外 顯子7的哺乳動(dòng)物TNFR2蛋白質(zhì)的方法。SSO的長(zhǎng)度(即寡聚物中單體的數(shù)目)與反義寡核苷酸(ASON)相似，典型地在大 約8-30之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案，SSO在大約10-16個(gè)核苷酸之間。可以利用SSOs能與 RNA雜交，但不會(huì)象傳統(tǒng)的反義2’-脫氧寡核苷酸那樣激活RNAseH引起的RNA破壞的幾種 化學(xué)過(guò)程來(lái)實(shí)施本發(fā)明?？梢岳?’0修飾的核酸寡聚物，例如2’0被-0-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-0-CH2-CH2-CH2-NH2、-0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 的修飾的核酸寡聚物來(lái)替代(!^placed with)實(shí)施本發(fā)明，優(yōu)選2’ 0-甲基或2’ 0-甲氧乙基修飾的核酸寡聚物。核堿基不必 連接 到糖上；可以使用被稱(chēng)為肽核酸寡聚物或基于嗎啉的寡聚物。在SaZani，p.et al. ,2001, nucleic acids res. 29 :3695中發(fā)現(xiàn)了對(duì)這些不同的化學(xué)連接過(guò)程的比較。術(shù)語(yǔ)剪接轉(zhuǎn)換 寡核苷酸預(yù)計(jì)包括上述形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解反義寡核苷酸gapmers和SSOs之 間的關(guān)系。Gapmers是包含RNAse H活化區(qū)域(典型地為2’ -脫氧核糖核苷硫代磷酸酯 (deoxyribonucleoside))的AS0N，其中活化區(qū)域與不活化的核酸酶抵抗寡聚物的側(cè)接。通 常，在SSO中可以使用適合于gapmerASON中的側(cè)接序列的任何化學(xué)過(guò)程。可以通過(guò)公知的固相合成技術(shù)制備本發(fā)明的SSOs?？梢粤硗馐褂没蛱鎿Q使用其他 的任何適合這種合成的工具。已經(jīng)公知可利用類(lèi)似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯 和烷基衍生物。SSO的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。 或者，可以使用修飾的堿基。特別有價(jià)值的是結(jié)合親合力增加的修飾堿基。優(yōu)選的修飾堿 基的非限制性例子有被稱(chēng)為g-clamp或9_(氨基乙氧基)吩惡嗪(phenoxazine)的核苷 酸、與鳥(niǎo)嘌呤核苷形成4個(gè)氫鍵的胞嘧啶類(lèi)似物。(Flanagan，W. Μ.，et al.，1999，proc. Natl. Acad. Sci. 96 3513 ；Holmes, S. C, 2003，Nucleic Acids Res. 31 2759)。其他堿基的 具體例子包括，但不限于5-甲基胞嘧啶(fcC)、異胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿 嘧啶(propynyluracil)、5-丙炔(propyny)_6、5_甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基 嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)、7_丙炔 (propyne) -7-去氮鳥(niǎo)嘌呤(deazaguanine)和2_氯6_氨基嘌呤。當(dāng)在SSO中使用LNA核苷酸時(shí)，也存在非LNA核苷酸的情形是優(yōu)選的。LNA 核苷酸在有非常明顯的非特異性結(jié)合的雜交中具有如此高的親合力，因此可以降低 游離SSO的有效濃度。當(dāng)使用LNA核苷酸時(shí)，也可以用2’ -脫氧核苷酸方便地替換 (alternate)它們?？梢允褂每商鎿Q的(alternating)核苷酸、可替換的二核苷酸或 其混合形式，例如LDLDLD、LDDLDD或LLDLLD。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸包含 選自由 LDLDDLLDDLDLDLL， LDLDLLLDDLLLDLL, LMLMMLLMMLMLMLL, LMLMLLLMMLLLMLL, LFLFFLLFFLFLFLL, LFLFLLLFFLLLFLL, LDDLDDLDDL, DLDDLDDLDD, DDLDDLDDLD, LMMLMMLMML, MLMMLMMLMM, MMLMMLMMLM, LFFLFFLFFL, FLFFLFFLFF, FFLFFLFFLF, DLDLDLDLDL, LDLDLDLDL,MLMLMLMLML, LMLMLMLML, FLFLFLFLFL, LFLFLFLFL 組成的組的核苷酸序列，其中 L 是 LNA 單 位，D是DNA單位，M是2' Moe，F(xiàn)是2，氟代。當(dāng)2' _脫氧核苷酸或2’-脫氧核苷硫代磷酸酯與LNA核苷酸混合時(shí)，避免RNAse H活化是非常重要的。預(yù)計(jì)SSO的LNA核苷酸在大約三分之一和三分之二之間比較合適。 當(dāng)使用增強(qiáng)親合力的修飾，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 認(rèn)識(shí)到增加這種增強(qiáng)親合力的修飾的比例是必需的?？梢允褂貌换罨疪NAse H的多種可替換的化學(xué)過(guò)程。例如適當(dāng)?shù)腟SOs可以是其 中至少一個(gè)核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經(jīng)過(guò)修飾的磷酸鹽，例如膦酸甲酯、甲基硫代膦酸 酉旨(methyl phosphonothioate)、phosphoromorpholidate、phosphoropiperazidate禾口氛基 磷酸酯(phosphoroamidate)的寡核苷酸。
例如依照所描述的內(nèi)容可以每隔(every other) 一個(gè)地修飾核苷酸間橋接的磷 酸鹽殘基。在另一個(gè)非限制性例子中，這種SSO是其中至少一個(gè)核苷酸包含2’位置的低級(jí) 烷基部分(例如，C1-C4,線(xiàn)性的或分支的，飽和或不飽合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙 基、1-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的寡核苷酸。例如依照所描述的內(nèi)容可以每隔一個(gè)地 修飾核苷酸(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，976，879中的第4欄)。在體內(nèi)使用時(shí)，優(yōu)選硫代磷 酸酯連接。SSO的長(zhǎng)度為大約8-30個(gè)堿基。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解當(dāng)使用增加親合力的 化學(xué)修飾時(shí)，SSO可以短些，但仍然保持特異性。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)該能更進(jìn)一步地理 解SSO長(zhǎng)度的上限是通過(guò)保持特異性識(shí)別靶序列，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)形成SSO的自身雜交，以及 獲取進(jìn)入細(xì)胞的限制來(lái)限定的。這些限制意味著長(zhǎng)度增加(超過(guò)(above and beyond)依賴(lài) 于SSO親合力的一定長(zhǎng)度)的SSO經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)是特異性較低、沒(méi)有活性或活性很差的SS0。本發(fā)明的SSOs包括，但不局限于涉及通過(guò)化學(xué)連接將增強(qiáng)SSO活性、細(xì)胞分布或 細(xì)胞吸收的一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)物連接到SSO上的SSO修飾。這種部分包括，但不局限 于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫 膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙 銨-二 -氧-十六烷基-rac-甘油基-3-h-磷酸鹽化合物(phosphonate)、多胺或聚乙二醇 鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨_羰基-羥膽固醇部分。不必均勻地改變給定SSO中的所有位置，實(shí)際上可以在單個(gè)化合物，乃至SSOs內(nèi) 部的單個(gè)核苷中引入一種以上的上述修飾。SSOs可以與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、包封、偶聯(lián)在一起，或者 與它們有關(guān)聯(lián)，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收的脂質(zhì)體、受體靶向的分子，口服劑 型、直腸給藥劑型、局部給藥劑型或其他劑型。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解細(xì)胞分化包括，但不局限于剪接體的分化。因此，任何 特殊SSO的活性取決于將其引入其中的細(xì)胞類(lèi)型。例如，在一種細(xì)胞類(lèi)型中有效的SSOs在 另一種細(xì)胞類(lèi)型中可能是無(wú)效的。本發(fā)明的方法、寡核苷酸和劑型(formulation)也是有用的調(diào)查人或動(dòng)物基因剪 接的體外或體內(nèi)工具。通過(guò)此處描述的步驟或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的所述步驟的修飾可以 實(shí)施這種方法。此處公開(kāi)的SSOs可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制tnf作用或tnf活化的信號(hào)路徑的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述狀態(tài)是炎性系 統(tǒng)性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種疾病是炎性肝 病。炎性肝病的實(shí)例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎，酒精性肝 病和非酒精性脂肪變性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。補(bǔ)充RNAseH本發(fā)明的寡聚物不介導(dǎo)基于RNAseH的互補(bǔ)單鏈RNA分子的切割。能有效補(bǔ)充 RNAseH的寡核苷酸需要至少5個(gè)毗連的DNA核堿基的延伸(stretch)。EP 1222309提供了確定RNaseH活性的體外方法，該方法可以用來(lái)確定補(bǔ)充 RNaseH的能力。與互補(bǔ)RNA靶一起提供時(shí)，利用EP 1222309的實(shí)施例91-95提供的方法進(jìn) 行測(cè)定時(shí)，如果以pmol/L/min計(jì)，化合物具有同等DNA寡核苷酸至少1 %，例如至少5%，例 如至少10%或小于20%的初始速率，則認(rèn)為該化合物能夠補(bǔ)充RNase H，其中同等DNA寡核 苷酸沒(méi)有2’位點(diǎn)的取代，寡核苷 酸中所有核苷酸之間都是磷酸二酯連接基團(tuán)的。當(dāng)與互補(bǔ)RNA靶和RNaseH —起提供時(shí)，利用EP 1222309的實(shí)施例91_95提供的 方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，如果以pmol/L/min計(jì)，化合物的RNaseH初始速率小于利用同等DNA寡核 苷酸確定的初始速率的20%，例如小于10%，例如小于5%或優(yōu)選小于0. 1% (甚至小于 0. 1% )，則認(rèn)為該化合物基本上不補(bǔ)充RNase H，其中同等DNA寡核苷酸沒(méi)有2’位點(diǎn)的取 代，寡核苷酸中所有核苷酸之間都是磷酸二酯連接基團(tuán)的。核苷酸類(lèi)似物當(dāng)提到只由核苷酸組成的優(yōu)選的核苷酸序列基序或核苷酸序列時(shí)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到由 該序列限定的本發(fā)明的寡聚物可以包含替換所述序列中存在的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的對(duì)應(yīng) 的核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位或其他的核苷酸類(lèi)似物，所述核苷酸類(lèi)似物提高寡聚物/靶 雙鏈體的雙鏈體穩(wěn)定性/Tm(即增強(qiáng)親合力的核苷酸類(lèi)似物)。此外，核苷酸類(lèi)似物可以在體內(nèi)增強(qiáng)寡聚物的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物(X)獨(dú)立地選自由2’-氧-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA 單位、2 ‘ -MOE RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2 ‘-氟-DNA 單位，LNA 單位、 PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，Btt連核堿基序列不包含2’ OMe核糖核苷酸類(lèi)似物或2’ -MOE 核糖核苷酸類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物是2’M0E，即2’氧-2甲氧乙基RNA。因此，在一 個(gè)實(shí)施方案中，此處提到核堿基基序中的X2或M可以是Μ0Ε。在寡聚物中引入增強(qiáng)親合力的核苷酸類(lèi)似物，例如LNA或T-取代的糖可以允許降 低特異性結(jié)合寡聚物的大小，也可以降低非特異性或異常結(jié)合發(fā)生前，寡聚物大小的上限。寡聚物的核堿基序列或毗連核堿基序列與TNFR靶序列的對(duì)應(yīng)區(qū)域不完全互補(bǔ)也 是合適的，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)寡聚物包含增強(qiáng)親合力的核苷酸類(lèi)似物，這種核苷酸類(lèi)似 物與TNFR靶中的對(duì)應(yīng)核苷酸形成互補(bǔ)體。因此寡聚物可以包含或由天然核苷酸，優(yōu)選2’ _脫氧核苷酸(在這里通常被稱(chēng) 為"DNA")，但也可能由核糖核苷酸(在這里通常被稱(chēng)為"RNA")的簡(jiǎn)單序列組成，或者 它可以包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸"類(lèi)似物"(也可能完全由其組成)。核苷酸類(lèi)似物是由糖、和/或堿基和/或磷酸鹽部分的修飾所產(chǎn)生的天然DNA或RNA核苷酸的變體。術(shù)語(yǔ)"核堿基"包括天然核苷酸(DNA或RNA類(lèi)型)，以及它們的這種" 類(lèi)似物"。原則上類(lèi)似物可以只是"沉默的"，或者"等同于"寡核苷酸上下文中的天然 核苷酸，即對(duì)寡核苷酸抑制聯(lián)蛋白表達(dá)的作用方式?jīng)]有功能性的影響。如果，例如這 種"等同"類(lèi)似物更容易制造或者制造起來(lái)更便宜，或者在存儲(chǔ)或制造期間更穩(wěn)定，或者 帶有標(biāo)記或標(biāo)簽，那么它們無(wú)論如何都是有用的。然而，優(yōu)選那些對(duì)寡聚物抑制表達(dá)的作用 方式有功能性影響的類(lèi)似物；例如，通過(guò)增加對(duì)靶的結(jié)合親合力、增加對(duì)胞內(nèi)核酸酶的抗性 和/或增加轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的容易性來(lái)產(chǎn)生影響的類(lèi)似物。 這種核苷酸修飾的實(shí)例包括改變糖部分以提供2’ _取代基或產(chǎn)生增強(qiáng)結(jié)合親 合力和可能提供一些增強(qiáng)的核酸酶抗性的橋接(鎖定的核酸)結(jié)構(gòu)；將核苷酸間連接 由正常的磷酸二酯鍵變?yōu)閷?duì)核酸酶攻擊抗性更強(qiáng)的連接，例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯 (boranophosphate)。 優(yōu)選的核苷酸類(lèi)似物是LNA，例如β -D-氧-LNA、α -L-氧-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫代-LNA，，β -D-氧-LNA是最優(yōu)選的。
在一些實(shí)施方案中，寡聚物包含3-8個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如6或7個(gè)核苷酸類(lèi)似 物。到目前為止，最優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)所述的核苷酸類(lèi)似物是鎖定的核酸(LNA)； 例如，至少3或至少4個(gè)，或者至少5個(gè)，或者至少6個(gè)，或者至少7個(gè)或8個(gè)核苷酸類(lèi)似物 是LNA。在一些實(shí)施方案中，所有的核苷酸類(lèi)似物都是LNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物內(nèi)部存在的核苷酸類(lèi)似物獨(dú)立地選自，例如 2，-氧-烷基-RNA單位、2，-氨基-DNA單位、2 ‘-氟-DNA單位、LNA單位、阿拉伯糖核酸 (ANA)單位、2’ -氟-ANA單位、HNA單位、INA (插入核酸)單位和2 ‘ -MOE RNA單位。2’-氧-甲氧乙基-RNA(2’M0E)、2’_氟-DNA單體和LNA是優(yōu)選的核苷酸類(lèi)似物， 因此本發(fā)明的寡核苷酸可以包含獨(dú)立地選自這三種類(lèi)似物的核苷酸類(lèi)似物，或者可以只包 含選自這三種中的一種類(lèi)似物。依照本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選包含至少一個(gè)鎖定的核酸(LNA)單位，例如1、2、3、4、5、 6、7或8個(gè)LNA單位，優(yōu)選4-8個(gè)LNA單位，最優(yōu)選4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)LNA單位。寡聚物包含 β -D-氧-LNA和一個(gè)或多個(gè)下列LNA單位D_ β、L- α構(gòu)型或其組合構(gòu)型的硫代-LNA、氨 基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α -LNA是合適的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物可以包含LNA和DNA單位。LNA和DNA單位組 合的總數(shù)優(yōu)選為8-24，例如8-15、或10-25，或10-20或12-16。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物的核堿基序列，例如毗連核堿基序列由至少 一個(gè)LNA組成，剩余的核堿基單位是DNA單位。在依照本發(fā)明的寡聚物的一些實(shí)施方案，例如包含LNA的反義寡核苷酸中，所有 LNA C單位都是5-甲基胞嘧啶。在一些實(shí)施方案中，所有核苷酸類(lèi)似物都是LNA。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡聚物只包含LNA核苷酸類(lèi)似物和核苷酸(RNA或DNA，最 優(yōu)選DNA核苷酸，具有任意修飾的核堿基間連接，例如硫代磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸類(lèi)似物的至少一個(gè)是2’ -M0E-RNA，例如2、3、4、5、 6、7或8個(gè)2’ -MOE-RNA核堿基單位。在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸類(lèi)似物的至少一個(gè)是2’ -氟-DNA，例如2、3、4、5、 6、7或8個(gè)2，氟-DNA核堿基單位。
Freier&Altmann ；Nucl. Acid Res. ，1997，25，4429—4443 禾口 Uhlmann ;Curr. Opinion in Drug Development，2000，3 (2)，293-213，以及略圖 1 描述了核苷類(lèi)似物的具體實(shí)例。 略圖1術(shù)語(yǔ)"LNA"指被稱(chēng)為"鎖定核酸"的二環(huán)核苷酸類(lèi)似物。它可以指LNA單體， 在"LNA寡核苷酸"的上下文中使用時(shí)可以指包含一個(gè)或多個(gè)這種二環(huán)核苷酸類(lèi)似物的
寡核苷酸。特別優(yōu)選的化學(xué)過(guò)程由鎖定核酸(LNA)提供(Koshkin, Α. A.，et al.，1998， Tetrahedron 54 3607 ；Obika, S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett. 39 5401)。此處使 用的術(shù)語(yǔ)〃 LNA單位〃、“LNA單體〃、“LNA殘基〃、“鎖定的核酸單位〃、“鎖定 的核酸單體〃或〃鎖定的核酸殘基〃指二環(huán)核苷類(lèi)似物。WO 99/14226、WO 00/56746、WO00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475 和 WO 03/095467 中描述了 LNA 單位 和它們的合成方法。也可以根據(jù)化學(xué)式來(lái)限定LNA單位。因此，此處使用的"LNA單位" 具有下文式1所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)。式1 其中X選自由0、S和NRH組成的組，R是H或C1-C4烷基；Y 是(-CH2) r，r 是 1-4 的整數(shù);B是如上所述的天然或非天然來(lái)源的堿基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，r是1或2，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，r是1。本發(fā)明的寡核苷酸化合物中使用的LNA優(yōu)選具有如下通式的結(jié)構(gòu) 其中X和Y獨(dú)立地選自群組-ο-、-S-、-N(H) -、N(R) -、-CH2-或-CH-(如果是雙鍵 的一部分)、-CH2-0-、-CH2-S-, -CH2-N (H) -、-CH2-N (R) -、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是雙鍵 的一部分)、-CH = CH-、其中R選自氫和Cy-烷基；Z和t獨(dú)立地選自核苷酸間連接、末端 基團(tuán)或保護(hù)基團(tuán)；B組成天然或非天然核苷酸堿基部分；在兩個(gè)方向的任意一個(gè)方向可以 發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)的基團(tuán)。本發(fā)明使用的寡聚物中的LNA優(yōu)選包含符合下式中的任何一個(gè)的至少一個(gè)LNA單
位 其中，Y是-0-、-S-、-N(H)-, N(Rh)-;Z和t獨(dú)立地選自核苷酸間連接、末端基團(tuán)或保護(hù)基團(tuán)；B組成天然或非天然核苷酸堿基部分，Rh選自氫和CV4-烷基。本發(fā)明的寡聚物中使用的LNA優(yōu)選包含選自-O-P (0) 2_0_，-O-P (0，S) _0 -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P (0, S)-0", -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P (0,
S) -S-, -S-P (0) 2-S-，-O-PO (Rh) -ο-，O-PO (OCH3) _0_，-0-P0 (NRh) _0_，-0-P0 (OCH2CH2S-R) -0-，-0-P0 (BH3) -0-，-0-P0 (NHRH) _0_，-O-P (0) 2_NRH_，-NRH-P (0) 2_0_，-NRH-CO-O-,其中 Rh 選自 氫和Cy烷基。具體優(yōu)選的LNA單位如略圖2所示 β-D-氨基酸-LNA略圖(scheme) 2術(shù)語(yǔ)〃硫代-LNA 〃包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個(gè)選自S 或-CH2-S-的鎖定核苷酸。硫代LNA可以是β -D和a -L構(gòu)型。術(shù)語(yǔ)〃氨基-LNA"包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個(gè)選自-N(H)-， N(R) -，CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-的鎖定核苷酸，其中R選自氫和C^4-烷基。氨基-LNA可 以是β-D禾口 a-L構(gòu)型。術(shù)語(yǔ)〃氧-LNA 〃包含其中上述通式中的X或Y中的至少一個(gè)代 表-0-或-CH2-O-的鎖定核苷酸。氧LNA可以是β -D和a -L構(gòu)型。
術(shù)語(yǔ)〃 ena-LNA〃包含其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子附 于與堿基B相對(duì)的2’ -位置)的鎖定核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，LNA選自β -D-氧-LNA、α -L-氧-LNA、β -D-氨基-LNA和 β -D-硫代、特別是β -D-氧-LNA。依照本發(fā)明的寡聚物優(yōu)選包含至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如鎖定的核酸(LNA)單 位，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如鎖定的核酸(LNA)單位，優(yōu)選3_9 個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位，例如4-8個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位，例如6_9個(gè)核苷 酸類(lèi)似物，例如LNA單位，優(yōu)選6、7或8個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位。 依照本發(fā)明的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14或15個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位，特別是3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸類(lèi)似 物，例如LNA單位。優(yōu)選的LNA單位包含至少一個(gè)0-0-氧-1^離單位，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10 個(gè)β -D-氧-LNA單位。本發(fā)明的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含一種以上的LNA單位?；衔锇?β -D-氧-LNA和一個(gè)或多個(gè)下列LNA單位D_ β、L- α構(gòu)型或其組合構(gòu)型的硫代-LNA、氨 基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α -LNA是合適的。優(yōu)選的寡聚物，例如反義寡核苷酸，可以包含或由核苷酸類(lèi)似物，例如LNA和DNA 單位組成。優(yōu)選LNA和DNA，但是也可以使用M0E、2’-0_Me，以及其他2’取代的類(lèi)似物和RNA。優(yōu)選的DNA類(lèi)似物包括其中2，-H被OH(RNA)以外的基團(tuán)，例如被-0-CH3，-0-CH2 -CH2-0-CH3, -0-CH2-CH2-CH2-NH2, -0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 替換的 DNA 類(lèi)似物。優(yōu)選的RNA類(lèi)似物包括其中2’_0H已經(jīng)改變，例如被-H(DNA)以外的基團(tuán)，例如-0-CH3, -0-CH2-CH2-0-CH3, -0-CH2-CH2-CH2-NH2, -0-CH2-CH2-CH2-0H 或-F 基團(tuán)取代的 RNA 類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物是〃 ΕΝΑ"。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物不包含任何RNA單位。與同等的DNA核苷酸的結(jié)合親合力相比，高親和性核苷酸類(lèi)似物是產(chǎn)生與互補(bǔ) RNA核苷酸形成具有較高熱穩(wěn)定性的雙鏈體的寡核苷酸的核苷酸類(lèi)似物。典型地通過(guò)測(cè)量 Tm來(lái)確定這一點(diǎn)。與同等的核苷酸相比，增加寡聚物/靶核酸靶的Tm的核苷酸類(lèi)似物是優(yōu)選的(增 強(qiáng)親合力的核苷酸類(lèi)似物)。寡聚物可以適當(dāng)?shù)氐嘏c靶核酸，例如TNFR mRNA雜交，形成Tm 為至少30°C，例如37°C，例如至少40°C，至少50°C，至少55°C或至少60°C的雙鏈體。例如， 在一個(gè)方案中，Tm在30-80°C之間，例如在40-70°C之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明寡聚物的核堿基的至少30%，例如至少33%，例如至 少40 %，例如至少50 %，例如至少60 %，例如至少66 %，例如至少70 %，例如至少80 %，例 如至少90%是核苷酸類(lèi)似物核堿基，例如LNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物的所有 核堿基都是核苷酸類(lèi)似物核堿基，例如LNA。對(duì)于較短的寡核苷酸，可能需要增加(高親合力)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA的比 例，這一點(diǎn)是能夠認(rèn)識(shí)到的。
與術(shù)語(yǔ)"寡聚物"互換使用的術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸(或簡(jiǎn)單地"低聚"oligo)“在 本發(fā)明上下文中指由兩個(gè)或多個(gè)核堿基的共價(jià)鍵形成的分子。當(dāng)在本發(fā)明的寡核苷酸(也 稱(chēng)為單鏈寡核苷酸)的上下文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"在一個(gè)實(shí)施方案中可能具有， 例如8-26個(gè)核堿基，例如12-26個(gè)核堿基。在此處詳述的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡 核苷酸具有10-16個(gè)核堿基或8-15個(gè)核堿基的長(zhǎng)度。寡聚物長(zhǎng)度的變化本發(fā)明寡核苷酸的長(zhǎng)度可以變化。甚至認(rèn)為較短的寡核苷酸，例如10-17或10-15 個(gè)堿基的寡核苷酸更有利。
在這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸具有10、11、12、13、14、15或16個(gè)核堿基
的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸的長(zhǎng)度為8-24個(gè)核堿基，例如10-24 個(gè)，12-24 個(gè)核苷酸之間，例如長(zhǎng)度為 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或24個(gè)核苷酸，優(yōu)選的長(zhǎng)度為10-22個(gè)，例如12-22個(gè)核苷酸之間，例如長(zhǎng)度為10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20或21個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的長(zhǎng)度為10-20個(gè)，例如12-20個(gè)核苷酸 之間，甚至更優(yōu)選的長(zhǎng)度為10-19個(gè)，例如12-19個(gè)核苷酸之間，例如長(zhǎng)度為10、11、12、13、
14、15、16、17、18或19個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為10-18個(gè)，例如12-18個(gè)核苷酸之間，例如長(zhǎng)度 為10、11、12、13、14、15、16、17或18個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的長(zhǎng)度為10-17個(gè)，例如12-17個(gè)核 苷酸之間，例如長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的長(zhǎng)度為10-16個(gè)， 例如12-16個(gè)核苷酸之間，例如長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15或16個(gè)核苷酸。核苷酸間連接基團(tuán)術(shù)語(yǔ)"核苷酸間連接基團(tuán)"被用來(lái)指能夠?qū)蓚€(gè)核堿基共價(jià)連接在一起的基團(tuán)， 例如，DNA單位之間、DNA單位和核苷酸類(lèi)似物之間、兩個(gè)非LNA單位之間、非LNA單位和LNA 單位之間、兩個(gè)LNA單位之間的基團(tuán)等等。優(yōu)選的實(shí)例包括磷酸鹽、磷酸二酯基團(tuán)和硫代磷
酸酯基團(tuán)。核苷酸間連接基團(tuán)可以選自由如下基團(tuán)組成的組-0-P(0)2-0-，-0-P(0，S)-0-，_ O-P(S)2-0，-S-P(0)2-0，-S-P(CS)_0_，-S-P(S)2-0,-O-P(0)2_S_，-O-P(CS)-S-,-S-P(0)2-S-，-0-P0(RH)-0-，O-PO(0CH3)_0_，-0-P0(NRH)_0_，-0-P0(0CH2CH2S-R)_0_，-0-P0(BH3)_0_，-O-PO (NHRH) -0-，-O-P (0) 2-NRH-, -NRH-P (0) 2-0-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-,和 / 或核苷酸 間連接基團(tuán)可以選自由如下基團(tuán)組成的組-0-C0-0-，-O-CO-NRH-, -NRH-C0-CH2-, -0-CH2-CO-NRH-,-0-CH2-CH2-NRH-,-C0-NRH-CH2-,-CH2-NRH-C0-,-0-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-0-，-S -CH2-CH2-S-,-CH2-S02-CH2-,-CH2-C0-NRH-，-0-CH2-CH2-NRH-C0-, -CH2-NCH3-0-CH2-，其 中RH選自氫和C1-4烷基。合適地，在一些實(shí)施方案中，上文提供的包含硫的核苷酸間連接 是優(yōu)選的。核苷酸間連接的修飾寡核苷酸中的核苷酸間連接基團(tuán)是磷酸基，但是可以用不同于磷酸鹽的核苷酸間 連接基團(tuán)取代這些磷酸基。在本發(fā)明的一個(gè)有趣的更進(jìn)一步地實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核 苷酸的核苷酸間連接基團(tuán)的結(jié)構(gòu)被改變，即修飾的寡核苷酸包含不同于磷酸鹽的核苷酸間 連接基團(tuán)。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含至少一個(gè)不同于磷酸鹽 的核苷酸間連接基團(tuán)。
不同于磷酸鹽(-0-P (0) 2-0-)的核苷酸間連接基團(tuán)的具體實(shí)例包括-0-P (0， S) -0", -0-P(S)2-0-, -s-p (0)2-0-，-s-p (0, S)_0_，-S-P(S)2_0-，-0-P(0)2_S-，_0_P(0， S)-S-,-S-P(0)2-S-,-0-P0(RH)-0-，0-P0(0CH3)-0-，-0-P0(NRH)-0-，-0-P0(0CH2CH2S-R)-0-，-0-P0(BH3)-0-，-0-P0(NHRH)-0-，_0_P(0)2-NRH-，-NRH-P(0)2-0-,-NRH-CO-O-，-NRH-CO-NRH-,-0-C0-0-,-O-CO-NRH-，-NRH-C0-CH2-，-0-CH2-C0-NRH-，-0-CH2-CH2-NRH-，-CO-NRH-C H2-,-CH2-NRH-C0-,-0-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-0-，-S-CH2-CH2-S-，-CH2-S02-CH2-，-CH2-C0 -NRH-, -0-CH2-CH2-NRH-C0-, -CH2-NCH3-0-CH2，其中 RH 是氫或 Cl_4_ 烷基。當(dāng)修飾核苷酸間連接基團(tuán)時(shí)，優(yōu)選的核苷酸間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯基團(tuán) (-0-p(0, s)-o-)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸的所有核苷酸間連接 基團(tuán)都是硫代磷酸酯。寡核苷酸完全被硫代磷酸酯化在大多數(shù)治療應(yīng)用中是優(yōu)選的，但在CNS，例如其中 硫代磷酸酯化可能有毒的腦或脊柱(spine)中使用的治療性寡核苷酸除外，因?yàn)槿狈怂?酶，甚至可以在毗連的DNA單位之間使用磷酸二酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含交替的LNA和DNA單位(Xx)或(xX)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含后面連接有2個(gè)DNA單位的交替的LNA基序 (Xxx)、xXx 或 xxX0在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)DNA或非LNA核苷酸類(lèi)似物單位在選自上文所述的 任何一個(gè)實(shí)施方案中被確定為L(zhǎng)NA核堿基單位的位置被LNA核堿基取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，“X"代表LNA單位。 在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含至少3個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位，例如至少4個(gè)核苷酸 類(lèi)似物單位，例如至少5個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位，例如至少6個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位，例如至少7 個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位，例如至少8個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位，例如至少9個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位， 例如至少10個(gè)，例如至少11個(gè)，例如至少12個(gè)核苷酸類(lèi)似物單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含至少3個(gè)LNA單位，例如至少4個(gè)LNA單位，例如 至少5個(gè)LNA單位，例如至少6LNA單位，例如至少7個(gè)LNA單位，例如至少8個(gè)LNA單位， 例如至少9個(gè)LNA單位，例如至少10個(gè)LNA單位，例如至少11個(gè)LNA單位，例如至少12個(gè) LNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤，例 如核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位中的1-10個(gè)是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤，例如核苷酸類(lèi)似物，例如 LNA單位中的2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在 一個(gè)實(shí)施方案中，至少三個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方 案中，至少四個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少 五個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少六個(gè)核苷酸 類(lèi)似物，例如LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少七核苷酸類(lèi)似物，例如 LNA單位是胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少八個(gè)核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位是 胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與同等DNA核苷酸對(duì)互補(bǔ)RNA核苷酸的結(jié)合親合力相 比，核苷酸類(lèi)似物與所述互補(bǔ)RNA核苷酸形成具有較高熱穩(wěn)定性的雙鏈體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物賦予單鏈寡核苷酸增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性。更進(jìn)一步地設(shè)計(jì)本發(fā)明的寡聚物在一個(gè)實(shí)施方案中，從3’末端開(kāi)始數(shù)起的話(huà)，依照本發(fā)明的寡聚物的第一個(gè)核堿 基是核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，從3’末端開(kāi)始數(shù)起的話(huà)，依照本發(fā)明的寡聚物的第二個(gè)核堿 基是核苷酸類(lèi)似物，例如LNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，‘‘x〃表示DNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物在5’末端包含核苷酸類(lèi)似物單位，例如LNA單位。 在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物單位，例如X獨(dú)立地選自由2’ -氧-烷基-RNA單位、 2 ‘ -OMe-RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2，-氟-DNA 單位，2 ‘ -M0E RNA 單位、LNA 單位、 PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物的所有核堿基都是核苷酸類(lèi)似物單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物單位，例如X獨(dú)立地選自由2 ‘ -OMe-RNA單位， 2'-氟-DNA單位和LNA組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含所述的至少一個(gè)LNA類(lèi)似物單位和至少一個(gè)另外 的不同于LNA的核苷酸類(lèi)似物單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，非LNA核苷酸類(lèi)似物單位獨(dú)立地選自2’ -OMe RNA單位和 2，-氟-DNA單位。在一個(gè)實(shí)施方案中寡聚物由XTX1或X2X￥中的至少一個(gè)序列組成，其中X1是 LNA, X2 是 2，-OMe RNA 單位或 2，-氟-DNA 單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物的核堿基序列由交替的X1和X2單位組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)5個(gè)毗連DNA核苷酸單位的 區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)6個(gè)毗連DNA核苷酸單位的區(qū) 域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)7個(gè)毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。 在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)8個(gè)毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在 一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)3個(gè)毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在一 個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)2個(gè)毗連DNA核苷酸單位的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含至少一個(gè)由至少兩個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位， 例如至少兩個(gè)毗連的LNA單位組成的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物包含至少一個(gè)由至少三個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位， 例如至少三個(gè)毗連的LNA單位組成的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)7個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單 位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)6個(gè)毗連的 核苷酸類(lèi)似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含 超過(guò)5個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明 的寡聚物不包含超過(guò)4個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位，例如LNA單位的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方 案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)3個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位，例如LNA單位的區(qū) 域。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡聚物不包含超過(guò)2個(gè)毗連的核苷酸類(lèi)似物單位，例 如LNA單位的區(qū)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含的至少50%，例如55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或例如100%的寡聚物的核堿基單位(優(yōu)選具有高親合 力)是核苷酸類(lèi)似物，例如鎖定的核酸(LNA)核堿基單位，下文的表3和4提供了可以被本發(fā)明的寡核苷酸方便靶向的短microRNA序列的 非限制性實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的寡核苷酸具有選自由下列基序組成的組的
5，-3，走向的核堿基序列
LxLxxLLxxLL
LxLxLLLxxLL
LxxLxxLxxL
xLxxLxxLxx'每:三個(gè)
xxLxxLxxLx'每:三個(gè)
xLxLxLxLxL'每?jī)蓚€(gè)
LXLXLXLXL’ 每?jī)蓚€(gè)，
Ld Ld d LLddLL
LdLdLLLddLLL
LMLMMLLMMLL
LMLMLLLMMLL
LFLFFLLFFLL
LFLFLLLFFLLL
LLLLLL
LLLLLLL
LLLLLLLL
LLLLLLLLL
LLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLL
LMMLMMLMML
MLMMLMMLMM'每:三個(gè)
MMLMMLMMLM'每:三個(gè)
LFFLFFLFFL’每:三個(gè)
FLFFLFFLFF，每:三個(gè)
FFLFFLFFLF，每:三個(gè)
dLdLdLdLdL，每?jī)蓚€(gè)
LdLdLdLdL’ 每?jī)蓚€(gè)’
MLMLMLMLML，每?jī)蓚€(gè)
LMLMLMLML，每?jī)蓚€(gè)，
FLFLFLFLFL，每?jī)蓚€(gè)
LFLFLFLFL’ 每?jī)蓚€(gè)，
(third)
Ld Ld d LLd d Ld Ld LLLdLdLLLddLLLdLLLMLMMLLMMLMLMLLLMLMLLLMMLLLMLLLFLFFLLFFLFLFLLLFLFLLLFFLLLFLLLddLddLddL(d) (d) (L) (d) (d) (L) (d)dLddLddLdd(L) (d) (d) (L) (d) (d) (L)ddLddLddLd(d) (L) (d) (d) (L) (d) (d)LMMLMMLMML (M) (M) (L) (M) (M) (L) (M)MLMMLMMLMM(L) (M) (M) (L) (M) (M) (L)MMLMMLMMLM(M) (L) (M) (M) (L) (M) (M)LFFLFFLFFL (F) (F) (L) (F) (F) (L) (F)FLFFLFFLFF (L) (F) (F) (L) (F) (F) (L)FFLFFLFFLF (F) (L) (F) (F) (L) (F) (F)dLdLdLdLdL(d) (L) (d) (L) (d) (L) (d)LdLdLdLdL(d) (L) (d) (L) (d) (L) (d) (L)MLMLMLMLML (M) (L) (M) (L) (M) (L) (M)LMLMLMLML (M) (L) (M) (L) (M) (L) (M) (L)FLFLFLFLFL (F) (L) (F) (L) (F) (L) (F)LFLFLFLFL (F) (L) (F) (L) (F) (L) (F) (L)其中L = LNA 單位，D = DNA 單位，M = 2' MOE RNA, F = 2，氟代，‘x，為此處所 限定的形式。對(duì)于較長(zhǎng)的寡聚物，可以重復(fù)上述模式，對(duì)于較短的寡聚物，可以從5’末端或 3’末端使用上述基序的對(duì)應(yīng)部分，同時(shí)任選括號(hào)內(nèi)的殘基，這一點(diǎn)是大家能夠認(rèn)識(shí)到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了其中所述寡聚物(或毗連核堿基序 列)包含至少一個(gè)硫代磷酸酯連接，和/或至少一個(gè)3’末端LNA單位，和/或至少一個(gè)5’ 末端LNA單位的寡聚物。蛋白質(zhì)本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了在外顯子7編碼的跨膜結(jié)合域包含缺失的分離或純化 的可溶形式的TNF a受體，其中所述TNF a受體選自TNF a受體TNFRSF1A或TNFRSF1B，其 變體，片段或同系物。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的分離或純化的可溶形式的TNFa受體缺乏外顯 子7編碼的跨膜結(jié)合域。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa受體是人TNFR1TNF a受體 (SEQ ID NO 123的殘基1-455，殘基30-455，其變體，片段或同系物。)，其中所述缺失在殘 基209和246之間(或相當(dāng)于SEQ ID No 123的殘基209和246的區(qū)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa具有由SEQ ID N0119的殘基 1-208，殘基30-208，其變體，片段或同系物組成的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離或純化的可溶形式的TNFa受體是人TNFR2TNF a受體(SEQ ID NO 127的殘基1-435，殘基23-435，其變體，片段或同系物，其中所述缺失在殘基 263和289之間(或相當(dāng)于SEQ ID No 123的殘基209和246的區(qū)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離或純化的可溶形式的TNF a受體具有由SEQ IDN0 127的 殘基1-262或23-262組成的序列，或者是其變體，片段或同系物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶形式的TNF a受體是分離純化的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是由來(lái)源于哺乳動(dòng)物TNFR基因的cDNA編碼的全長(zhǎng)或成熟 的蛋白質(zhì)，其中cDNA的外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7。此外，蛋白 質(zhì)可以結(jié)合TNF，優(yōu)選TNF-alpha，可以作為T(mén)NF，優(yōu)選TNF-alpha的拮抗劑。與單獨(dú)的可溶 性細(xì)胞外域相比，本發(fā)明的TNFR優(yōu)選能夠抑制TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性到更大程度，更優(yōu)選地 到與TNFR :Fc相當(dāng)或超過(guò)它的程度。本發(fā)明公開(kāi)的哺乳動(dòng)物TNFR包括，但不局限于人、靈 長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、鼠科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、牛、羊、馬和豬TNFR。此外，本發(fā)明公開(kāi)的哺乳動(dòng) 物TNFR包括，但不局限于由一個(gè)或多個(gè)單核苷酸多態(tài)性，例如EP專(zhuān)利申請(qǐng)1，172，444中公 開(kāi)的那些實(shí)例產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列，只要蛋白質(zhì)保持與用于進(jìn)行比較的參考序列可比的生物 活性就可以。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物TNFR是哺乳動(dòng)物TNFR1，優(yōu)選人TNFR1。對(duì)于人 TNFR1，如SEQ ID NO 122所示的包括信號(hào)序列的huTNFRl A 7和缺乏信號(hào)序列的成熟 huTNFRl A 7 (SEQ ID NO 122的氨基酸30-417)給出了實(shí)施方案中的兩個(gè)非限制性實(shí)例。這 些huTNFRl八7蛋白質(zhì)的序列是包含信號(hào)序列的野生型人1順1 1(3￡0 ID No 118)的氨基酸 1-208或缺乏信號(hào)序列的成熟huTNFRl A 7的序列，即野生型人TNFR1的氨基酸30-208，兩 種情況下上述序列都是直接連接野生型人TNFR1的氨基酸247-455。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物TNFR是哺乳動(dòng)物TNFR2，最優(yōu)選人TNFR2。對(duì) 于人TNFR2，如SEQ ID NO 126所示的包括信號(hào)序列的huTNFR2 A 7或缺乏信號(hào)序列的成熟 huTNFR2 A 7 (SEQ ID NO 126的氨基酸23-435)給出了實(shí)施方案中的兩個(gè)非限制性實(shí)例。這 些huTNFR2A7蛋白質(zhì)的序列是包含信號(hào)序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No 120)的氨基酸 1-262或缺乏信號(hào)序列的成熟huTNFR2 A 7的的序列，即野生型人TNFR2的氨基酸23-262， 兩種情況下，上述序列后都因?yàn)橥怙@子6-8接合點(diǎn)處獨(dú)特密碼子的形成而直接連接氨基酸 谷氨酸，外顯子6-8接合點(diǎn)的后面連接有野生型人TNFR2的氨基酸290-461。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也包含被化學(xué)修飾的那些蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾是指其中至 少一個(gè)氨基酸殘基被自然過(guò)程，例如加工或其他的翻譯后修飾，或者本領(lǐng)域已知的化學(xué)修 飾方法改變的蛋白質(zhì)。這種修飾包含，但不局限于乙?；?、?；Ⅴ０坊?、ADP核糖基化、糖 基化、甲基化、聚乙二醇化、異戊烯化、磷酸化或偶聯(lián)膽固醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)的變體、片段和 同系物。然而，這種蛋白質(zhì)在此處解釋的外顯子7或外顯子8編碼的氨基酸序列中包含缺失。核酸本發(fā)明更進(jìn)一步地提供了編碼本發(fā)明的TNF a受體的可溶形式的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸選自由下列核酸組成的組SEQ ID NO 121的核苷酸 1-1251，SEQ ID NO 121 的 88-1251，SEQ ID NO 125 的 1-1305 和 SEQID NO 125 的 67-1305， 或者其變體，同系物或片段，包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與該核酸編碼相同的原始氨基酸序列的核酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是編碼由來(lái)源于哺乳動(dòng)物TNFR基因的cDNA編碼的全長(zhǎng)或 成熟蛋白質(zhì)的核酸，其中cDNA的外顯子6的后面直接連接外顯子8，因此缺乏外顯子7。優(yōu)選以開(kāi)放閱讀框未被內(nèi)部的非翻譯序列或典型地存在于真核基因中的內(nèi)含子 中斷的形式提供這種序列。也可以使用包含相關(guān)序列的基因組DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，核 酸是mRNA或cDNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它是基因組DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物TNFR是哺乳動(dòng)物TNFR1。適合于該實(shí)施方案的哺乳 動(dòng)物TNFR1優(yōu)選是人TNFR1。對(duì)于人TNFR1，如SEQ ID NO 122所示的包含信號(hào)序列的編碼 huTNFRl A 7和缺乏信號(hào)序列的成熟huTNFRl A 7 (SEQ ID NO 122的氨基酸30-417)的核酸 給出了實(shí)施方案中的兩個(gè)非限制性實(shí)例。這些huTNFRl A 7核酸的序列優(yōu)選是包含信號(hào)序 列的SEQ ID NO :121的核苷酸1-1251和缺乏信號(hào)序列的SEQ ID NO :121的核苷酸88-1251。 這些huTNFRl A 7核酸的序列是包含信號(hào)序列的野生型人TNFR1 (SEQ IDNo 117)的核苷酸 1-625或野生型人TNFR1的核苷酸88-625，即缺乏信號(hào)序列的成熟huTNFR2 A 7，兩種情況下 上述序列的后面都直接連接野生型人TNFR1的核苷酸740-1368。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物TNFR是哺乳動(dòng)物TNFR2，最優(yōu)選人TNFR2。對(duì) 于人TNFR2，如SEQ ID NO 126所示的包含信號(hào)序列的編碼huTNFR2 A 7或缺乏信號(hào)序列的 成熟huTNFR2 A 7 (SEQ ID NO 126的氨基酸23-435)的核酸給出了實(shí)施方案中的兩個(gè)非限 制性實(shí)例。這些huTNFR2A7核酸的序列優(yōu)選是包含信號(hào)序列的SEQ ID NO 115的核苷酸 1-1305和缺乏信號(hào)序列的SEQ ID NO :115的核苷酸67-1305。這些huTNFR2 A 7核酸的序 列是包含信號(hào)序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No 119)的核苷酸1-787或野生型人TNFR2 的核苷酸67-787，即缺乏信號(hào)序列的成熟huTNFR2 A 7，兩種情況下上述序列的后面都直接 連接野生型人TNFR2的氨基酸866-1386。本發(fā)明的核酸的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶 脫氧核苷堿基?；蛘撸梢允褂眯揎椀膲A基。其他適當(dāng)?shù)膲A基包括，但不限于5-甲基胞嘧 啶(fcC)、異胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔_6、5_甲基噻唑尿嘧 啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6_ 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤 (deazaadenine)、7_ 丙塊 _7_ 去氣鳥(niǎo)口票吟(deazaguanine)、2_氣(aminoethoxy) _6_ M■基口票 呤和9_(氨乙氧)吩惡嗪。本發(fā)明合適的核酸包括許多的選擇性化學(xué)變化。例如本發(fā)明適當(dāng)?shù)暮怂岚?，?不局限于其中至少一個(gè)核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經(jīng)過(guò)修飾的磷酸鹽，例如硫代磷酸酯、 膦酸甲酯、甲基硫代膦酸酯、phosphoromorpho 1 idate、phosphoropiperazidate和氨基磷酸 酯(phosphoroamidate)的核酸。在另一個(gè)非限制性例子中，本發(fā)明適當(dāng)?shù)暮怂岚切┢?中至少一個(gè)核苷酸包含2’位置的低級(jí)烷基部分(例如，(；_(；，線(xiàn)性的或分支的，飽和或不飽 合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和異丙基)的核酸。本發(fā)明的核酸也包括，但不局限于那些其中至少一個(gè)核苷酸是核酸類(lèi)似物的 核酸。這種類(lèi)似物的實(shí)例包括，但不局限于己糖醇(HNA)核苷酸、2’ 0-4’ C-連接的二 環(huán)的呋核亞硝脲(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)類(lèi)似物、N3’ 一 P5’的氨基磷酸酯類(lèi)似物、 phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類(lèi)似物和它們的組合。本發(fā)明的核酸包括，但不局限于涉及將一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)物化學(xué)連接到核酸上的核酸修飾。這種部分包括，但不局限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己 基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、 磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙銨、1，2- 二-氧-十六烷基-rac-甘油-硫-H-磷 酸鹽化合物、多胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨-羰基-羥膽固醇 部分。表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的核酸的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包含能夠驅(qū)動(dòng)所述核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)盒。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的核酸或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供了制備可溶形式的TNFa受體的方法，所述方法包括在允許所述核 酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞的步驟，以及隨后從所述宿主細(xì)胞分離所述的可溶形 式的TNFa受體的步驟。本發(fā)明提供的表達(dá)載體能夠擴(kuò)增或表達(dá)編碼本發(fā)明的哺乳動(dòng)物TNFR的DNA。本發(fā) 明也提供了用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其具有合 成的或cDNA衍生的編碼哺乳動(dòng)物TNFR或生物等效類(lèi)似物的DNA片段，所述DNA片段與來(lái)源 于哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒或昆蟲(chóng)基因的適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件操作性連接。轉(zhuǎn)錄單位通 常包含(a)在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳成分，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(b)被轉(zhuǎn)錄 成mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和(c)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列的組 合。這種調(diào)節(jié)元件包括控制轉(zhuǎn)錄的操縱序列，編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核醣體結(jié)合部位的序列。可 以另外整合通常賦予在宿主細(xì)胞中復(fù)制能力的復(fù)制起點(diǎn)和有助于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。DNA區(qū)域在功能上彼此相關(guān)時(shí)，可以將它們操作性的連接。例如如果表達(dá)物順序 參與多肽分泌的前體，那么編碼信號(hào)肽(分泌引導(dǎo)物)的DNA操作性地與編碼多肽的DNA 連接；如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就操作性地與編碼序列連接；或者如果將 核糖體結(jié)合部位定位使其允許翻譯，那么核糖體結(jié)合部位就操作性地與編碼序列連接。通 常操作性連接意味著鄰接，而且對(duì)分泌引導(dǎo)物來(lái)說(shuō)，也意味著鄰接和位于閱讀框內(nèi)。設(shè)計(jì)的 在酵母表達(dá)系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)元件優(yōu)選包括允許宿主細(xì)胞將翻譯的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外 的引導(dǎo)序列。換句話(huà)說(shuō)，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)沒(méi)有引導(dǎo)或運(yùn)輸序列，它可以包含N末端甲硫氨 酸殘基。隨后可以任意地從表達(dá)的蛋白質(zhì)上切割該殘基以提供終產(chǎn)品。可以在基本上包含適當(dāng)宿主微生物，例如細(xì)菌，例如大腸桿菌或酵母，例如啤酒酵 母的均一的單一培養(yǎng)物的重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)或擴(kuò)增哺乳動(dòng)物TNFR DNA，其中所述的重組 表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)穩(wěn)定將重組轉(zhuǎn)錄單位整合(通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)到染色體DNA上，或者攜帶有 作為固有質(zhì)粒組分的重組轉(zhuǎn)錄單位。此處限定的重組表達(dá)系統(tǒng)將組成性地表達(dá)或者在與表 達(dá)的DNA序列或人工基因有聯(lián)系的調(diào)節(jié)元件的誘導(dǎo)下表達(dá)異種蛋白。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的哺乳動(dòng)物TNFR載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通常表達(dá)TNFR，但對(duì)克隆或擴(kuò)增TNFR DNA來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不需 要表達(dá)TNFR。表達(dá)哺乳動(dòng)物TNFR的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包含原核生物、酵母、真菌或高級(jí)真核 細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或芽胞桿菌。高級(jí)的 真核細(xì)胞包括，但不局限于已建立的昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。利用來(lái)源于本發(fā)明DNA構(gòu)建 體的RNAs，還可以使用沒(méi)有細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)哺乳動(dòng)物TNFR。供細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體在本領(lǐng)域是公知的。原核表達(dá)宿主可以用來(lái)表達(dá)不需要廣泛蛋白水解作用和二硫化物加工的TNFR。 原核表達(dá)載體通常包含一個(gè)或多個(gè)表型的可選擇標(biāo)記物，例如編碼賦予抗生素抗性或供給 自養(yǎng)需求的蛋白質(zhì)的基因，以及宿主可以識(shí)別的保護(hù)在宿主內(nèi)部擴(kuò)增的復(fù)制起點(diǎn)。轉(zhuǎn)化的 適當(dāng)?shù)脑怂拗靼ù竽c桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌，以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和 Staphyolococcus屬內(nèi)的不同種細(xì)菌，不過(guò)也可以使用其他細(xì)菌作為選擇的宿主。供細(xì)菌使用的有用的表達(dá)載體可以包含可選擇的標(biāo)記物和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，其中復(fù) 制起點(diǎn)來(lái)源于包含公知的克隆載體PBR322的遺傳成分的可商業(yè)獲得的質(zhì)粒(ATCC37017)。 這些PBR322"骨架"部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合。pBR322包含對(duì)氨芐 青霉素和四環(huán)素具有抗性的基因，因此提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)單方式。這種商業(yè)載體包 括，例如Novagen pET 載體系列(EMD Biosciences, Inc.，Madison, Wis.)。通常在重組的微生物表達(dá)載體中使用的啟動(dòng)子包括乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、啟動(dòng) 子、T7啟動(dòng)子和T71ac啟動(dòng)子。特別有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，Novagen p ET系統(tǒng)(EMD Biosciences, Inc.，Madison, Wis.)使用了 T7或T71ac啟動(dòng)子和大腸桿菌菌株，例如包含 T7RNA聚合酶基因的染色體拷貝的BL21 (DE3)。TNFR蛋白質(zhì)也可以在酵母和真菌宿主中表達(dá)，優(yōu)選在來(lái)自酵母菌種，例如其他屬 的啤酒酵母中表達(dá)，例如也可以使用畢赤氏酵母或克魯維酵母菌。酵母載體通常包含來(lái)自 2U酵母質(zhì)?；蜃灾鲝?fù)制序列(ARS)的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、編碼TNFR的DNA、多聚腺苷酸化 和終止轉(zhuǎn)錄的序列，以及選擇基因。酵母載體優(yōu)選包括允許酵母和大腸桿菌轉(zhuǎn)化的復(fù)制起 點(diǎn)和可選擇的標(biāo)記物，例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因、為在色氨酸或尿嘧啶中分別 缺乏生長(zhǎng)能力的酵母突變株提供可選擇標(biāo)記物的啤酒酵母的TRP1或URA3基因，以及來(lái)源 于高表達(dá)酵母基因的用于誘導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。酵母宿主細(xì)胞基因組中TRP1 或URA3病變的存在為通過(guò)分別不存在色氨酸或尿嘧啶時(shí)的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化提供了有效環(huán)
^Mi o酵母載體中適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖 酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡 糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)化酶、磷酸葡糖異構(gòu) 酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。在酵母表達(dá)中使用的適當(dāng)載體和啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是公知的。可以使用來(lái)自pUC18的用于在大腸桿菌中選擇和復(fù)制的DNA序列(An^基因和復(fù) 制起點(diǎn))，以及包含葡萄糖可抑制的ADH2啟動(dòng)子和[a ]_因子分泌引導(dǎo)物的酵母DNA序列 組裝優(yōu)選的酵母載體。以在啟動(dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因之間插入指導(dǎo)異種蛋白質(zhì)分泌的酵 母因子引導(dǎo)物(leader)。可以修飾引導(dǎo)序列，使其在靠近3’末端的地方包含一個(gè)或 多個(gè)有用的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)以促進(jìn)引導(dǎo)序列與外源基因的融合。適當(dāng)?shù)慕湍皋D(zhuǎn)化操作方 法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的。用包含ADH2啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)化的宿主菌株可以生長(zhǎng)在由酵母抽提物、2%蛋 白胨、以及補(bǔ)充有80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的1 %或4%葡萄糖組成的豐富培養(yǎng)基 中進(jìn)行表達(dá)。培養(yǎng)基中的葡萄糖一耗盡，ADH2啟動(dòng)子就會(huì)發(fā)生去阻遏。在更進(jìn)一步地提純 之前，通過(guò)過(guò)濾收獲粗提的酵母上清液，并保持在4°C。也可以方便地使用多種哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)表達(dá)TNFR蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)，因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)通常能夠正確折疊，適當(dāng)修飾，并 且是完全有功能的。適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括猴腎臟細(xì)胞的C0S-7系，以及 其他能夠表達(dá)適當(dāng)載體的細(xì)胞系，例如，包括L細(xì)胞，例如L929、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO)、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以包含非轉(zhuǎn)錄元件，例如復(fù)制起點(diǎn)，適當(dāng)?shù)?啟動(dòng)子，例如CMVie啟動(dòng)子、雞0 -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或合成的hEFl-HTLV啟動(dòng)子，與要表達(dá) 的基因相連的增強(qiáng)子，以及其他5’或3’端側(cè)接的非轉(zhuǎn)錄序列，5’或3’端的非翻譯序列，例 如必需的核糖體結(jié)合部位，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。在 昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)異種蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢酝ㄟ^(guò)病毒源提供在轉(zhuǎn)化脊椎動(dòng)物細(xì)胞中使用的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制 序列。例如，通常使用的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子來(lái)源于多瘤、腺病毒2、猴腎病毒40(SV40)、人巨細(xì) 胞病毒，例如CMVie啟動(dòng)子、HTLV，例如合成的hEFl-HTLV啟動(dòng)子。來(lái)源于SV40病毒基因組 的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)，早期和晚期啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，剪接和多腺苷酸化位點(diǎn)可以用于 提供另一種表達(dá)異源DNA序列所需要的遺傳成分。更進(jìn)一步地，可以使用哺乳動(dòng)物基因組TNFR啟動(dòng)子，例如控制和/或信號(hào)序列，如 果這種控制序列與所選擇的宿主細(xì)胞相容的話(huà)。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，包含TNFR cDNAs的重組表達(dá)載體被穩(wěn)定地整合到宿主細(xì) 胞的DNA中。蛋白質(zhì)表達(dá)和純化當(dāng)使用哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，適當(dāng)表達(dá)的TNFR蛋白質(zhì)將被分泌到細(xì)胞外培養(yǎng) 基中。利用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)技術(shù)從培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)，并進(jìn)行濃縮和純化。在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中通過(guò)慢病毒(lentiviral)轉(zhuǎn)導(dǎo)、AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或任何類(lèi)似的程序進(jìn)行表達(dá)后， 或者在昆蟲(chóng)細(xì)胞中通過(guò)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)后，利用具有合適的濾過(guò)分子量的濃縮過(guò)濾 器，例如Amicon 過(guò)濾單元濃縮這些細(xì)胞的細(xì)胞外培養(yǎng)基，為了避免TNFR蛋白質(zhì)的損失， 過(guò)濾器應(yīng)允許等于或低于50kDal的蛋白質(zhì)流過(guò)。當(dāng)在細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)TNFR蛋白質(zhì)時(shí)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)進(jìn)行純化。溶 解細(xì)菌，除去包含TNFR的細(xì)胞提取物中的鹽分并使其濃縮。在兩種情況下都優(yōu)選通過(guò)親和層析法純化TNFR蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用具有包含 TNF-a的親合基質(zhì)的柱層析。換句話(huà)說(shuō)，親合力純化標(biāo)記可以被添加到TNFR蛋白質(zhì)的N或 C末端。例如聚組氨酸標(biāo)記(His-標(biāo)記)可以用于實(shí)現(xiàn)這一目的，其中聚組氨酸標(biāo)記是具 有至少六個(gè)組氨酸的氨基酸基序(Hengen，P.，1995，Trends Biochem. Sci. 20 :285_86)。通 過(guò)框內(nèi)添加將編碼His-標(biāo)記的核苷酸序列直接添加到表達(dá)載體中的TNFR開(kāi)放閱讀框的5’ 或3，端可以實(shí)現(xiàn)His-標(biāo)記的添加。SEQ ID NO: 126中給出了這樣一種適合于添加羧基末 端His標(biāo)記的核苷酸序列。當(dāng)His標(biāo)記被整合到蛋白質(zhì)中時(shí)，使用鎳或鈷親和層析柱來(lái)純 化標(biāo)記的TNFR，然后可以任意地將His標(biāo)記切割下來(lái)。其他適當(dāng)?shù)挠H合純化標(biāo)記和具有這 種標(biāo)記的蛋白質(zhì)的提純方法是本領(lǐng)域公知的?；蛘?，可以使用基于非親合力的純化方案，包括在基于大小(分子篩色譜)、電荷 (陰離子和陽(yáng)離子交換色譜法)和疏水性(反相色譜法)的一系列柱上分級(jí)分離TNFR提取 物。高效液相色譜法可用于簡(jiǎn)化這些步驟。表達(dá)和純化TNFR蛋白質(zhì)的其他方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)，例如，Jacobs的美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，605，690)。定義術(shù)語(yǔ)"核苷酸間連接基團(tuán)"被用來(lái)指能夠?qū)蓚€(gè)核堿基共價(jià)連接在一起的基團(tuán)， 例如，DNA單位之間、DNA單位和核苷酸類(lèi)似物之間、兩個(gè)非LNA單位之間、非LNA單位和LNA 單位之間、兩個(gè)LNA單位之間的基團(tuán)等等。優(yōu)選的實(shí)例包括磷酸鹽、磷酸二酯基團(tuán)和硫代磷
酸酯基團(tuán)。此處，使用的術(shù)語(yǔ)〃含氮堿基〃(nitrogenous base)包括嘌呤和嘧啶，例如DNA 核堿基A、C、T和G，RNA核堿基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核堿基，例如5-甲基胞嘧啶 (fcC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻 唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黃嘌呤核苷、2，6- 二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮籃 嘌呤(deazaadenine)、7_丙炔_7_去氮鳥(niǎo)嘌吟(deazaguanine)和2_氯6_氨基嘌呤，特別 是MeC。應(yīng)理解非DNA/RNA核堿基的實(shí)際選擇將取決于寡核苷酸用來(lái)靶向的小RNA鏈中存在 的對(duì)應(yīng)(或匹配)核苷酸。例如，如果對(duì)應(yīng)的核苷酸是G，選擇能夠與G建立氫鍵的非DNA/ RNA核堿基通常是必需的。在這種具體情況下，對(duì)應(yīng)核苷酸是G時(shí)，優(yōu)選的非DNA/RNA核堿 基的典型實(shí)例為fec。這里使用的術(shù)語(yǔ)〃腫瘤壞死因子受體〃、“TNF受體〃和〃 TNFR"指具有天然哺 乳動(dòng)物TNF受體序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或基本上與天然哺乳動(dòng)物TNF受體序列相似的 蛋白質(zhì)，它能夠結(jié)合TNF分子。在上下文中，這種受體的"天然"受體或基因指天然存在的 受體或基因，以及這種受體和基因天然存在的等位基因變化。與TNFR結(jié)合使用的術(shù)語(yǔ)"成熟"指以缺乏可能存在于天然基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 中的引導(dǎo)序列或信號(hào)序列的形式表達(dá)的蛋白質(zhì)。這里使用的TNFR蛋白質(zhì)的命名法遵循蛋白質(zhì)的命名(例如TNFR2)放在種類(lèi)命 名，例如hu(適合于人)或mu(適合于鼠科動(dòng)物)之前，后面是△(指缺失)和刪除的外顯 子的數(shù)目的慣例。例如huTNFR2 A 7指缺乏外顯子7的人TNFR2。缺少任何物種指定時(shí)， TNFR從種屬上來(lái)說(shuō)是指哺乳動(dòng)物TNFR。術(shù)語(yǔ)"分泌的"指蛋白質(zhì)是可溶的，也就是說(shuō)，它不與細(xì)胞膜結(jié)合。在上下文中， 如果利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)試驗(yàn)，在不與膜相關(guān)聯(lián)的組分，例如細(xì)胞上清液或血 清中可以檢測(cè)到大部分的某種形式，那么這種形式就是可溶性的。術(shù)語(yǔ)〃穩(wěn)定的〃是指利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)試驗(yàn)，例如western印跡、 ELISA試驗(yàn)在收獲的細(xì)胞、細(xì)胞上清液或血清中可以檢測(cè)到的分泌形式的TNFR。這里使用的術(shù)語(yǔ)"腫瘤壞死因子"和"TNF"指結(jié)合TNF受體的天然發(fā)生的蛋白 質(zhì)配體。TNF包括，但不局限于TNF- a和TNF- 3。這里使用的術(shù)語(yǔ)"炎性疾病或狀態(tài)"指至少部分由TNF與其受體結(jié)合引起，或者 因?yàn)檫@種結(jié)合而加重的疾病、紊亂或其他的醫(yī)學(xué)狀況。這種疾病或狀態(tài)包括，但不局限于與 升高的TNF水平、升高的TNF受體水平、增強(qiáng)的致敏性或?qū)?yīng)信號(hào)路徑的失調(diào)有關(guān)的那些疾 病。該術(shù)語(yǔ)也包括其中已知的TNF拮抗劑已經(jīng)顯示有用的疾病和狀態(tài)。炎性疾病或狀態(tài)包 括，但不局限于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊 柱炎(ankylosing spondylitis)、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、肝炎、敗 血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性。
這里使用的術(shù)語(yǔ)"肝炎"指以至少部分肝臟發(fā)炎為特征的胃腸疾病、狀態(tài)或紊 亂。肝炎的實(shí)例包括，但不局限于與甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒有關(guān)的肝 炎，或者與局部缺血/再灌注有關(guān)的肝臟炎癥。這里使用的術(shù)語(yǔ)"TNF拮抗劑"指利用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測(cè)量時(shí)，能夠可測(cè) 量性地抑制TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)(例如參見(jiàn)下文實(shí)施例中描述的L929細(xì)胞毒性 試驗(yàn))。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合TNF"指通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定時(shí)，蛋白質(zhì)可以結(jié) 合可檢測(cè)水平的TNF,優(yōu)選TNF-a (參見(jiàn)，例如Smith的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，945，397的16-17 欄)。在使用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測(cè)試實(shí)驗(yàn)時(shí)，本發(fā)明的每納摩爾受體優(yōu)選能夠結(jié)合大于0. 1納摩爾 的TNF-alpha，更優(yōu)選能結(jié)合大于0. 5納摩爾的TNF- a。這里使用的術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"指涉及分子相互作用的有助于核酸功能調(diào)節(jié)，包括 但不限于核酸復(fù)制、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯或降解調(diào)節(jié)的核苷酸序列。在自然界中，調(diào)節(jié)可 以是增強(qiáng)或抑制。本領(lǐng)域已知的調(diào)節(jié)元件包括，例如翻譯調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。 啟動(dòng)子是在一定條件下，能幫助通常位于啟動(dòng)子下游(3’方向)的編碼區(qū)域開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的DNA 區(qū)域。表達(dá)載體典型地包含與本發(fā)明的核酸操作性連接的這種調(diào)節(jié)元件。術(shù)語(yǔ)〃寡聚物〃、“剪接轉(zhuǎn)換寡聚物〃和〃寡核苷酸〃在此處可交換使用。這里使用的術(shù)語(yǔ)"操作性連接"指遺傳元件的并置，其中元件的關(guān)系允許它們以 預(yù)期方式發(fā)生作用。例如，如果啟動(dòng)子幫助編碼序列開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子與編碼區(qū)域就是 操作性連接的(例如在表達(dá)載體中)。只要維持了這種功能關(guān)系，就可以在啟動(dòng)子和編碼區(qū) 域之間插入殘基。這里使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)染"指將外源核酸插入細(xì)胞，不考慮插入所使用 的方法，例如脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或電穿孔。外源核酸可以保持在非整合載體，例如質(zhì)粒中， 或者可以整合到細(xì)胞基因組中。這里使用的術(shù)語(yǔ)"載體"指能運(yùn)輸另一個(gè)核酸到已經(jīng)被連接的分子上的核酸分 子。一種載體是"質(zhì)粒"，指附加的DNA序列可以連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種 載體是病毒載體，其中附加的DNA部分可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在將它們 引入其中的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物 載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動(dòng)物載體)被引入宿主細(xì)胞時(shí)，會(huì)整合到宿主細(xì)胞 的基因組中，因此能夠隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體、表達(dá)載體能夠指導(dǎo)與它們 操作性連接的基因的表達(dá)。通常，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)?；虿《据d 體形式(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)。這里使用的術(shù)語(yǔ)"分離的蛋白質(zhì)"指非天然發(fā)生的蛋白質(zhì)或多肽，或者從與其天 然有關(guān)的一種或多種組分中分離的蛋白質(zhì)或多肽。這里使用的術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"指非天然發(fā)生的核酸，和/或處于分離片段形式 或作為較大的構(gòu)建體的組分的核酸，其中所述的片段或組分來(lái)源于至少分離一次的基本上 純的核酸，即沒(méi)有污染的內(nèi)源性原料，而且其數(shù)量或濃度允許通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)方法，例如 使用克隆載體的方法鑒別和操作。這里使用的術(shù)語(yǔ)"純化的蛋白質(zhì)"指基本上沒(méi)有其他蛋白質(zhì)存在的蛋白質(zhì)。然 而，這種純化的蛋白質(zhì)可以包含作為穩(wěn)定劑、載體、賦形劑或共同治療劑添加的其他蛋白質(zhì)。這里使用的術(shù)語(yǔ)"純化的"優(yōu)選指占存在的蛋白質(zhì)的干重的至少50%，例如至少 80%，更優(yōu)選占存在的蛋白質(zhì)的重量的95-99%，最優(yōu)選99.8%，其中存在的蛋白質(zhì)排除了 作為穩(wěn)定劑、載體、賦形劑或共同治療劑添加的蛋白質(zhì)。這里使用的術(shù)語(yǔ)"改變前信使RNA的剪接"指改變細(xì)胞前信使RNA靶的剪接，導(dǎo) 致剪接產(chǎn)品的比率改變?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種技術(shù)檢測(cè)這種剪接改變。例 如，總細(xì)胞RNA的RT-PCR可用于檢測(cè)存在和缺少SS0時(shí)的剪接產(chǎn)物的比率。這里使用的術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"用來(lái)指互補(bǔ)性如此充分或配對(duì)如此精確以致寡核苷 酸和包含靶序列的DNA或RNA之間發(fā)生了穩(wěn)定和特異性的結(jié)合。應(yīng)理解在本領(lǐng)域，寡核苷 酸序列不必與靶序列100%互補(bǔ)。例如，對(duì)于SS0來(lái)說(shuō)，在允許剪接的情況下，如果存在充分 的互補(bǔ)性，就會(huì)發(fā)生與靶的結(jié)合，而且會(huì)避免非特異性結(jié)合。然而，優(yōu)選與靶序列(例如這 里提到的SEQ ID N01-4的區(qū)域)完全互補(bǔ)(即完全)的寡核苷酸或毗連核堿基序列。在寡核苷酸的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"相當(dāng)于"和"相當(dāng)"指本發(fā)明的化合物的 核堿基和其反向互補(bǔ)序列之間的比較，在一個(gè)實(shí)施方案中指核堿基序列和同等的(相同 的)核堿基序列之間，或者它們的互補(bǔ)序列之間的比較，其中同等的(相同的)核堿基序列 可以包含，例如其他的核堿基，但保持相同的堿基序列。核苷酸類(lèi)似物可以直接地與它們的 同等物或?qū)?yīng)的自然核苷酸進(jìn)行比較。與一條序列形成反向互補(bǔ)的序列被稱(chēng)為該序列的互 補(bǔ)序列。當(dāng)提到這里涉及的核苷酸分子的長(zhǎng)度時(shí)，長(zhǎng)度相當(dāng)于單體單位，即核堿基的數(shù)目， 不考慮那些單體單位是核苷酸還是核苷酸類(lèi)似物。就核堿基而言，術(shù)語(yǔ)單體和單位在此處 可交換使用。應(yīng)理解，當(dāng)在比值或數(shù)值范圍的上下文中使用術(shù)語(yǔ)"大約"時(shí)，讀出的公開(kāi)內(nèi)容 應(yīng)包括提到的比值或范圍。此處在蛋白質(zhì)或多肽(序列)的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"變體"指通過(guò)在原始(親 本)多肽中插入、缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即至少一個(gè)氨基酸，但優(yōu)選少于50個(gè)氨基 酸，例如少于40，少于30，少于20或少于10個(gè)氨基酸，例如1個(gè)氨基酸，1-2個(gè)氨基酸，1-3 個(gè)氨基酸，1-4個(gè)氨基酸，1-5個(gè)氨基酸，從所述多肽制備的多肽，或者利用來(lái)自所述多肽的 序列信息制備的多肽。此處在蛋白質(zhì)或多肽(序列)的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"同系物"指與所述多肽序 列至少70%同源，例如至少80%同源，例如至少85%同源或至少90%同源，例如至少95%， 96 %，97 %，98 %或99 %同源的多肽?？梢岳肂losum62算法，用ClustalW比對(duì)算法確定兩 個(gè)多肽之間的同源性，其中缺口程度(Gap Extent) =0.5，缺口開(kāi)放(Gap open) = 10(參 jAL,http://www. ebi. ac. uk/emboss/align/index. html)。比對(duì)在一個(gè)實(shí)施方案中可以是局 部比對(duì)(水)，或者在分開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方案可以是整體比對(duì)(針))。因?yàn)榇颂幪岬降耐?顯子缺失的TNFR蛋白質(zhì)的同系物包括各自外顯子中的缺失，因此更優(yōu)選整體比對(duì)。此處在蛋白質(zhì)或多肽(序列)的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)"片段"指只由多肽序列的 一部分組成的多肽。因此片段可以包含所述多肽序列的至少5%，例如所述多肽序列的至少 10%，包括至少 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90% 或 95%。上述變體、片段和同系物的定義也適合核酸序列，但同源性算法使用的是 DNAfull。顯而易見(jiàn)地是，當(dāng)提到核酸變體、片段或同系物時(shí)，術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸應(yīng)相應(yīng)地替換為核酸、多核苷酸或核堿基/核苷酸。這里使用的術(shù)語(yǔ)"膜結(jié)合形式"或"整體膜形式"指具有跨越細(xì)胞膜的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)，氨基酸序列在膜的兩邊。這里使用的術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形式"或有時(shí)所稱(chēng)的"穩(wěn)定可溶的配體 結(jié)合形式"(此處術(shù)語(yǔ)"分泌"和"可溶的"是同義詞，而且可以交換使用)指通過(guò)被分 泌，保持穩(wěn)定以及仍然能結(jié)合對(duì)應(yīng)的配體而與天然膜結(jié)合形式的受體相關(guān)的蛋白質(zhì)。應(yīng)注 意這些形式不是由這種分泌形式是否具有生理活性限定的，只要這種剪接變體產(chǎn)物在產(chǎn)生 時(shí)是被分泌的，穩(wěn)定的，而且仍能結(jié)合配體就可以。術(shù)語(yǔ)"分泌的"指可溶形式，也就是說(shuō)，它不再與細(xì)胞膜結(jié)合。在上下文中，如果 利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種形式是可溶的，那么就可以在不與膜關(guān)聯(lián)的 部分，例如細(xì)胞上清液或血清中檢測(cè)到大部分這種形式。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定的"指本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)試驗(yàn)可檢測(cè)的分泌形式。例如，蛋白 質(zhì)印跡、ELISA試驗(yàn)可用于檢測(cè)收獲的細(xì)胞，細(xì)胞上清液或病人血清中的這種形式。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合配體"指所述形式雖然未必保持了對(duì)應(yīng)整體膜形式的全部特異性配 體結(jié)合活性，但至少保持了一些顯著水平的特異性配體結(jié)合活性。這里使用的術(shù)語(yǔ)"降低配體的活性"指導(dǎo)致由配體結(jié)合或與受體的相互作用產(chǎn) 生的胞內(nèi)信號(hào)傳輸下降的任何作用。例如，配體與它的受體的可溶形式的結(jié)合或者降低有 效結(jié)合配體的膜形式的受體的數(shù)量可以降低活性。藥物組合物和制劑本發(fā)明其他的實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的寡聚物、蛋白質(zhì)和核酸的藥物組合物。本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質(zhì)可以通過(guò)摻合，包封，共軛結(jié)合或其他方式聯(lián)合到 其他分子，分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物中，具體實(shí)例有有助于攝取，分布和/或吸收的脂質(zhì) 體，受體靶分子，口服劑型，直腸給藥劑型，局部給藥劑型或其他劑型。本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學(xué)上可接受的載體，例如水性載體中的本發(fā)明的 寡聚物、核酸或蛋白質(zhì)。因此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合于腸胃外給藥的 劑型，包括關(guān)節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合于 局部給藥、眼用、經(jīng)陰道，口服、經(jīng)直腸或肺給藥的劑型，包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入， 包括通過(guò)噴霧器、氣管內(nèi)和鼻內(nèi)遞送的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也 可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當(dāng)?shù)慕o藥途徑取決于受 試者待治療的狀態(tài)的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學(xué)上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產(chǎn)生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實(shí)例有(a) 用陽(yáng)離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無(wú)機(jī)酸， 例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽；(c)用有機(jī)酸，例如乙酸、草酸、 酒石酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、安息香酸、丹寧酸、棕 櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P-甲苯磺酸、萘二磺酸(naphthalene disulfonic acid)、多聚半乳糖醛酸等等形成的鹽。本發(fā)明提供了利用上述的寡聚物、蛋白質(zhì)和核酸制備用于治療患有下文討論的涉 及TNF活性過(guò)強(qiáng)的炎性病癥的病人的藥物制劑的用途。在制造依照本發(fā)明的藥物時(shí)，本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質(zhì)典型地與其它的可接受的載體混合。當(dāng)然，載體必須是可接受 的，也就是與劑型中的任何其他成分相容，而且必須對(duì)病人沒(méi)有害處。載體可以是固體或液 體。本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質(zhì)被摻入到通過(guò)任何基本上由混合組分組成的公知制藥 技術(shù)制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一種或多種附加的治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無(wú)菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預(yù)期的接受者的血液等滲，而且基本上無(wú)熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預(yù)期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)。水性和非水性的無(wú)菌的懸浮液可以包 括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安 瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加無(wú)菌液體載體，例如鹽水或注射 用水的凍干條件下。在該制劑中，本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質(zhì)可以包含在粒子或囊，例如適合于 腸胃外給藥的脂質(zhì)體或微晶內(nèi)。粒子可以是任何適當(dāng)結(jié)構(gòu)，例如單層或多層的粒子，只要 本發(fā)明的寡聚物、核酸和蛋白質(zhì)包含在其中就可以。這種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的 脂質(zhì)，例如 N-[l-(2，3-dioleoyloxy)丙基]-N，N，N_ 三甲基-ammoniummethy 1 sulfate 或"DOTAP"。這種脂質(zhì)粒子的制備是公知的(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5，976，879的第 6欄)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)施用穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形式的TNF受體 降低該受體的TNF活性，從而治療炎性疾病或狀態(tài)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及通過(guò)施用編碼穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形式的TNF受體的寡核苷酸降低該受體的TNF活性， 從而治療炎性疾病或狀態(tài)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)穩(wěn)定分泌的配體 結(jié)合形式的TNF受體的方法。下文討論的本發(fā)明的以下方面可應(yīng)用到上述的實(shí)施方案中。本發(fā)明的方法、核酸、蛋白質(zhì)和劑型也是有用的體外或體內(nèi)工具。本發(fā)明的實(shí)施方案可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制TNF作用或TNF活化的信號(hào)路徑 的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述狀態(tài)是炎性系 統(tǒng)性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是炎性肝 病。炎性肝病的實(shí)例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎，酒精性肝 病和非酒精性脂肪變性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經(jīng)顯示有用的疾 病。三個(gè)具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準(zhǔn)。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( Remicade )和adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個(gè)或多個(gè)已被批 準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結(jié)腸炎)。利用蛋白質(zhì)治療炎性疾病本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)給病人施用SSOs治療炎性疾病或狀態(tài)的方法， 所施用的SSOs能改變前信使RNA的剪接以產(chǎn)生編碼穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形式的TNFR超家 族受體的剪接變體，因此能降低該配體對(duì)那種受體的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉 及通過(guò)給細(xì)胞施用SSOs在細(xì)胞中生產(chǎn)穩(wěn)定分泌的配體結(jié)合形式的TNFR超家族受體的方 法。
在用于治療用途時(shí)，將本發(fā)明的純化的TNFR蛋白質(zhì)施用給患者，優(yōu)選施用給人， 以治療依賴(lài)TNF的炎性疾病，例如關(guān)節(jié)炎。在對(duì)人進(jìn)行治療時(shí)，優(yōu)選使用huTNFRs?？梢酝?過(guò)彈丸注射、啦連輸注、從植入物持續(xù)釋放或其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)施用本發(fā)明的TNFR蛋白質(zhì)。 典型地，以包含純化蛋白質(zhì)和生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合物的形式施用 TNFR治療蛋白質(zhì)。所使用的這種載體的劑量和濃度對(duì)接受者無(wú)毒性。通常，這種組合物的 制備需要將TNFR與緩沖液，抗氧化劑，例如抗壞血酸，多肽，蛋白質(zhì)，氨基酸，包括葡萄糖， 蔗糖或糊精的糖類(lèi)，如EDTA的螯合劑，谷胱甘肽及其他穩(wěn)定劑和賦形劑組合。作為示例的 適當(dāng)稀釋劑有與同種血清白蛋白混合的中性緩沖鹽水或鹽水。優(yōu)選利用適當(dāng)?shù)馁x形劑溶 液，例如作為稀釋劑的蔗糖將產(chǎn)物配制成凍干劑。也可以添加防腐劑，例如苯甲醇。當(dāng)然， 給藥的數(shù)量和頻率將取決于這種因子的性質(zhì)，待治療適應(yīng)癥的嚴(yán)重性，期望的反應(yīng)，病人的 狀態(tài)等等。系統(tǒng)施用的本發(fā)明的TNFR蛋白質(zhì)的治療有效量的優(yōu)選范圍為0. lmg/kg/周到大 約100mg/kg/周。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用的TNFR的量為大約0. 5mg/kg/周到大約50mg/ kg/周。局部應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選劑量為每次注射大約0. 0lmg/kg到大約1. Omg/kg。利用表達(dá)載體升高哺乳動(dòng)物中TNF拮抗劑的水平本發(fā)明提供了升高哺乳動(dòng)物中TNF拮抗劑水平的方法。該方法包括用此處描述的 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟，其中表達(dá)載體驅(qū)動(dòng)此處描述的TNFR的表達(dá)。該方法對(duì) 大型哺乳動(dòng)物，例如家庭寵物，用于生產(chǎn)食物的哺乳動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物特別有用。大型哺乳 動(dòng)物的實(shí)例有狗，貓、馬、奶牛、羊、鹿和豬。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的實(shí)例有猴、猿和人?？梢栽隗w內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。當(dāng)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化時(shí)，表達(dá)載體被直接施用，例 如通過(guò)注射施用給哺乳動(dòng)物。在體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方式在本領(lǐng)域是公知的。當(dāng)在體外轉(zhuǎn)化時(shí)， 先從哺乳動(dòng)物獲取細(xì)胞，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再移植到哺乳動(dòng)物中。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經(jīng)顯示有用的疾 病。三個(gè)具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準(zhǔn)。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( Remicade )和adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個(gè)或多個(gè)已被批 準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結(jié)腸炎)。利用開(kāi)發(fā)的適合AS0N的步驟可以完成給受試者施用SS0的過(guò)程。通過(guò)靜脈內(nèi)施 用已經(jīng)成功地將鹽水中的AS0N以高達(dá)6mg/kg的劑量施用給了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和受試驗(yàn)的人，每 周施用三次(Yacysyhn，B. R.，et al, 2002,Gut 51 :30(治療 Crohn 氏病的抗 ICAM-1AS0N)； Stevenson, J.，et al.，1999，J. ClinicalOncology 17 :2227 (靴向 PBMC 的抗RAF-1AS0N))。 已經(jīng)報(bào)告靶向于TNF- a的2'o-MOE硫代磷酸酯AS0N的藥物動(dòng)力學(xué)(Geary, R. S.，et al.， 2003，DrugMetabolism and Disposition 31 :1419)。也已經(jīng)報(bào)告了混合的 LNA/DNA 分子的 系統(tǒng)有效性(Fluiter, K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31 953)。利用2’ 0-M0E硫代磷酸酯和PNA化學(xué)作用調(diào)查了 SS0在小鼠模型系統(tǒng)中的全身 活性。在除腦、胃和真皮外的所有被研究的組織中觀(guān)察到了顯著活性(SaZani，P.，et al., 2002, Nature Biotechnology 20,1228)。通常，在傳統(tǒng)反義治療中有用的任何施藥方法都可以用來(lái)施用本發(fā)明的SS0。為了 在培養(yǎng)細(xì)胞中測(cè)試SS0，可以使用已經(jīng)開(kāi)發(fā)的測(cè)試AS0N或SS0的任何技術(shù)。
本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學(xué)上可接受的載體，例如水性載體中的SSOs。因 此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合于腸胃外給藥的劑型，包括腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié) 內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合于局部給藥、眼用、經(jīng)陰 道，口服、經(jīng)直腸或肺(包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過(guò)噴霧器、氣管內(nèi)和鼻內(nèi) 遞送)施用的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的 任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當(dāng)?shù)慕o藥途徑取決于受試者待治療的狀態(tài)的性 質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學(xué)上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產(chǎn)生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實(shí)例有(a) 用陽(yáng)離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無(wú)機(jī)酸，例 如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽(acid addition salts) ； (c)用有機(jī) 酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、安 息香酸、丹寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳 糖醛酸等等形成的鹽。本發(fā)明提供了利用具有上述特征的SSOs制備用于在受炎性紊亂折磨的病人體內(nèi) 增加缺乏外顯子7的哺乳動(dòng)物TNFR2蛋白質(zhì)/它對(duì)應(yīng)的膜結(jié)合形式的比率的藥物的用途， 其中炎性紊亂涉及上文討論的TNF-alpha。在制造依照本發(fā)明的藥物時(shí)，SSOs典型地與可 接受的載體混合。當(dāng)然，載體必須是可接受的，也就是與劑型中的任何其他成分相容，而且 必須對(duì)病人沒(méi)有害處。載體可以是固體或液體。SSOs被摻入到通過(guò)任何基本上由混合組分 組成的公知制藥技術(shù)制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一種或多種附加的 治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無(wú)菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預(yù)期的接受者的血液等滲，而且基本上無(wú)熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預(yù)期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)。水性和非水性的無(wú)菌的懸浮液可以包 括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安 瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加無(wú)菌液體載體，例如鹽水或注射 用水的凍干條件下。在該制劑中，SSOs可以包含在粒子或囊，例如適合于腸胃外給藥的脂質(zhì)體或微晶 內(nèi)。粒子可以是任何適當(dāng)結(jié)構(gòu)，例如單層或多層的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。這 種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的脂質(zhì)，例如N-[l-(2，3-di0le0yl0Xy)丙基]_N，N，N_三甲 基-ammoniummethylsulfate或〃 D0TAP"。這種脂質(zhì)粒子的制備是公知的(參見(jiàn)參考文獻(xiàn) 美國(guó)專(zhuān)利No. 5，976，879的第6欄)。SS0可以靶向調(diào)節(jié)剪接的任何元件或元件組合，包括3’剪接位點(diǎn)，5’剪接位點(diǎn)，分 支點(diǎn)，多聚嘧啶區(qū)域，外顯子剪接增強(qiáng)子，外顯子剪接沉默子，內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子，內(nèi)含子剪 接沉默子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以理解，可以利用具有與包含外顯子7和它的鄰近內(nèi)含子 的TNFR1或TNFR2基因部分的至少8個(gè)核苷酸，至少9個(gè)，至少10個(gè)，至少11個(gè)，至少12 個(gè)，至少13個(gè)，至少14個(gè)，至少15個(gè)，優(yōu)選10-16個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列的SS0實(shí)施靶向人 TNF TNFR2的本發(fā)明。
SEQ ID NO 3包含TNFR2的外顯子7的序列和側(cè)接內(nèi)含子的50個(gè)相鄰核苷酸。例 如，靶向人TNFR2的SS0可以具有選自表4列出的序列的核堿基序列。當(dāng)使用增強(qiáng)親合力 的修飾，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到SS0的長(zhǎng)度 可以相應(yīng)地降低。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也承認(rèn)SS0序列的選擇必須要考慮避免自身互補(bǔ)的SS0，其 中自身互補(bǔ)可能導(dǎo)致部分"發(fā)夾"雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。另外，應(yīng)避免高GC含量以將非特異性 堿基配對(duì)的可能性降到最低程度。此外，也應(yīng)該避免使用通過(guò)BLAST顯示的與off-target 基因配對(duì)的SSOs。在一些情況下，選擇靶向人和至少一個(gè)其他物種的SS0序列是優(yōu)選的。開(kāi)始在人 類(lèi)中使用之前，可在所述的其他物種中用這些SSOs測(cè)試和優(yōu)化本發(fā)明，因此有助于調(diào)整 報(bào)批和藥物開(kāi)發(fā)目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos 14，30，46，70和71也與對(duì)應(yīng)的 Mullata獼猴序列100%互補(bǔ)。因此，在用于人類(lèi)以前，可以先在猴子體內(nèi)用這些序列進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)治療。下文討論的本發(fā)明的以下方面可應(yīng)用到上述的實(shí)施方案中。SS0的長(zhǎng)度與反義寡核苷酸(AS0N)相似，典型地在大約10_24個(gè)核苷酸之間?？?以利用SSOs具有的與RNA雜交，但不象常規(guī)的反義2匸脫氧寡核苷酸那樣活化RNAse H引 起的RNA破壞作用的幾種化學(xué)性質(zhì)來(lái)實(shí)施本發(fā)明。可以利用2’ 0修飾的核酸寡聚物，例如 2’氧-甲基或2’氧-甲氧乙基硫代磷酸酯實(shí)施本發(fā)明。核堿基不必連接到糖上；可以使 用被稱(chēng)為肽核酸寡聚物或基于嗎啉的寡聚物。在Sazani，p. et al.，2001，nucleic acids res. 29 3695中發(fā)現(xiàn)了對(duì)這些不同的化學(xué)連接過(guò)程的比較。術(shù)語(yǔ)剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸預(yù)計(jì)包 括上述形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解反義寡核苷酸gapmers和SSOs之間的關(guān)系。Gapmers 是包含RNAse H活化區(qū)域(典型地為2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯)的AS0N，其中活化區(qū) 域與不活化的核酸酶抵抗寡聚物側(cè)接。通常，在SS0中可以使用適合于gapmerASON中的側(cè) 接序列的任何化學(xué)過(guò)程。通過(guò)公知的固相合成技術(shù)可以制備本發(fā)明的SSOs?？梢粤硗馐褂没蛱鎿Q使用其他 的任何適合這種合成的工具。已經(jīng)公知可利用類(lèi)似的方法制備寡核苷酸，例如硫代磷酸酯 和烷基衍生物。鎖定的核酸(LNA)提供了特別優(yōu)選的化學(xué)過(guò)程(Koshkin, A. A.，et al.，1998， Tetrahedron 54 3607 ；Obika, S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett. 39 5401)。LNA 是常 規(guī)的磷酸二酯連接的核糖核苷酸，除了呋核亞硝脲部分是2’ 0和4’ C之間的橋接形成二環(huán) 外。這種橋接強(qiáng)制呋核亞硝脲環(huán)構(gòu)象變成寡核苷酸與互補(bǔ)RNA雜交時(shí)所采用的V-橋(endo) 構(gòu)象。W003/095467種描述了合成LNA的最新進(jìn)展。大多數(shù)典型的橋是亞甲基或乙烯基。 Morita, et al.，2003，Bioorg. and Med. Chem. 11 -.2211 中描述了 2，0，4，C_ 乙烯-橋接核 酸(ENA)和其他LNA的合成。然而，可以使用可替換的化學(xué)過(guò)程，用2’ N取代2’ 0。LNA和 常規(guī)的核苷酸可以混合形成嵌合的SS0。例如，可以使用交替的LNA和2’脫氧核苷酸或交 替的LNA和2’0-Me或2’0_M0E形成的嵌合的SS0。這些化學(xué)過(guò)程的任何替換方式，不僅僅 是2’ -脫氧核苷酸，都可以是替換磷酸二酯的phosphorothioatediester連接。在體內(nèi)使 用時(shí)，優(yōu)選硫代磷酸酯連接。當(dāng)在SS0中使用LNA核苷酸時(shí)，也存在非LNA核苷酸的情形是優(yōu)選的。LNA核苷酸在有非常明顯的非特異性結(jié)合的雜交中具有如此高的親合力，以至于可以降低游離SS0 的有效濃度。當(dāng)使用LNA核苷酸時(shí)，也可以用2'脫氧核苷酸方便地替換它們?？梢允褂?交替的核苷酸，交替的二核苷酸或混合型，例如LDLDLD或或LDDLDD。當(dāng)2’-脫氧核苷酸或 2’-脫氧核苷硫代磷酸酯與LNA核苷酸混合時(shí)，避免RNase H活化很重要。預(yù)計(jì)SS0的LNA 核苷酸在大約三分之一和三分之二之間比較合適。例如，如果SS0是12聚體，那么將存在 至少四個(gè)LNA核苷酸和四個(gè)常規(guī)核苷酸。SS0的堿基可以是傳統(tǒng)的胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。 或者，也可以使用修飾的堿基。特別有價(jià)值的是結(jié)合親合力增加的修飾堿基。優(yōu)選的修飾 堿基的一個(gè)非限制性例子是被稱(chēng)為G-clamp或9-(氨基乙氧基)吩惡嗪的核苷酸、與鳥(niǎo)嘌 呤核苷形成4個(gè)氫鍵的胞嘧啶類(lèi)似物(Flanagan, ff. M.，et al.，1999，Proc. Natl. Acad. Sci. 96 3513 ；Holmes, S.C，2003，Nucleic Acids Res. 31 2759)?？梢岳貌换罨疪Nase H的多種可選擇的化學(xué)過(guò)程。例如適當(dāng)?shù)腟SOs可能 是其中至少一個(gè)或全部核苷酸間橋接磷酸鹽殘基是經(jīng)過(guò)修飾的磷酸鹽，例如膦酸甲酯、 甲基硫代月粦酸酉旨、phosphoromorpholidates、phosphoropiperazidates禾口氛基憐酸酉旨 (phosphoroamidates)的寡核苷酸。例如依照所描述的內(nèi)容可以每隔一個(gè)地修飾核苷酸 間橋接的磷酸鹽殘基。在另一個(gè)非限制性例子中，這種SS0是其中至少一個(gè)或全部核苷酸 包含2’位置的低級(jí)烷基部分(例如，C1-C4，線(xiàn)性的或分支的，飽和或不飽合的低級(jí)烷基，例 如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基核異丙基)的寡核苷酸。例如，依照所描 述的內(nèi)容可以每隔一個(gè)地修飾核苷酸。[參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，976，879的第4欄]。SS0的長(zhǎng)度(即寡聚物中單體的數(shù)目)為大約10-大約30個(gè)堿基。在一個(gè)實(shí)施 方案中，20個(gè)堿基的2’0-Me-核糖核苷硫代磷酸酯是有效的。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解 當(dāng)使用增加親合力的化學(xué)修飾時(shí)，SS0可以短些，但仍然保持特異性。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員 應(yīng)該能更進(jìn)一步地理解SS0長(zhǎng)度的上限是通過(guò)保持特異性識(shí)別靶序列，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)形成 SS0的自身雜交，以及獲取進(jìn)入細(xì)胞的限制來(lái)限定的。這些限制意味著長(zhǎng)度增加(超過(guò)依賴(lài) 于SS0親合力的一定長(zhǎng)度)的SS0經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)是特異性較低、沒(méi)有活性或活性很差的SS0。本發(fā)明的SSOs包括，但不局限于涉及通過(guò)化學(xué)連接將增強(qiáng)SS0活性、細(xì)胞分布或 細(xì)胞吸收的一個(gè)或多個(gè)部分或偶聯(lián)物連接到SS0上的SS0修飾。這種部分包括，但不局限 于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫 膽固醇、脂肪鏈，例如、十二烷基或十一烷基殘基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙 銨-1，2- 二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-氫-磷酸鹽化合物、多胺或聚乙二醇鏈、金剛 烷乙酸、棕櫚基部分、十八胺或己氨_羰基-羥膽固醇部分。不必均勻地改變給定SS0中的所有位置，實(shí)際上可以在單個(gè)化合物，乃至SSOs內(nèi) 部的單個(gè)核苷中引入一種以上的上述修飾。SSOs可以與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混 合物混合、包封、偶聯(lián)在一起，或者與它們有關(guān)聯(lián)，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收 的脂質(zhì)體、受體靶向的分子，口服劑型、直腸給藥劑型、局部給藥劑型或其他劑型。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解細(xì)胞分化包括，但不局限于剪接體的分化。因此，本發(fā) 明的任何特殊SS0的活性取決于將其引入其中的細(xì)胞類(lèi)型。例如，在一種細(xì)胞類(lèi)型中有效 的SSOs在另一種細(xì)胞類(lèi)型中可能是無(wú)效的。本發(fā)明的方法、寡核苷酸和劑型也是有用的調(diào)查人或動(dòng)物基因剪接的體外或體內(nèi)工具。通過(guò)此處描述的步驟或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的所述步驟的修飾可以實(shí)施這種方法。本發(fā)明可用于治療執(zhí)業(yè)醫(yī)生打算限制TNF超家族配體作用或這種配體活化的信 號(hào)路徑的任何狀態(tài)。特別是，本發(fā)明可用于治療炎性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述狀態(tài)是 炎性系統(tǒng)性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是 炎性肝病。炎性肝病的實(shí)例包括，但不局限于與甲型、乙型或丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎，酒 精性肝病和非酒精性脂肪變性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，炎性疾病是皮膚疾病，例如牛皮癬。本發(fā)明的用途包括，但不局限于治療已知的TNF拮抗劑已經(jīng)顯示有用的疾 病。三個(gè)具體的TNF拮抗劑目前已被FDA批準(zhǔn)。這些藥物是etanerc印t(Enbrel )、 infliximab ( P\emicade )和 adalimumab ( Humira )。這些藥物中的一個(gè)或多個(gè)已被批 準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱 炎和炎性腸病(Crohn氏病或潰瘍性結(jié)腸炎)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受體是TNFR1或TNFR2受體。在其他的實(shí)施方案中，受體 是與TNFR1和TNFR2充分同源的TNFR超家族的成員，例如TNFRSF3、TNFRSF5或TNFRSFI IA，這樣與外顯子7和8同源的兩個(gè)外顯子中的一個(gè)或兩個(gè)缺失都會(huì)產(chǎn)生分泌形式的受體。 本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的可操作性不取決于這種分泌形式是否是有生理活性 的，只要這種剪接變體的產(chǎn)物是分泌的、穩(wěn)定的，且能結(jié)合配體就可以。利用開(kāi)發(fā)的適合AS0N的步驟可以完成給受試者施用SS0的過(guò)程。通過(guò)靜脈內(nèi)施 用已經(jīng)成功地將鹽水中的AS0N以高達(dá)6mg/kg的劑量施用給了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和受試驗(yàn)的人，每 周施用三次(Yacysyhn，B. R.，et al, 2002, Gut 51 :30(治療 Crohn 氏病的抗 ICAM-1AS0N)； Stevenson, J.，et al.，1999，J. ClinicalOncology 17 :2227 (靴向 PBMC 的抗RAF-1AS0N))。 已經(jīng)報(bào)告靶向于TNF- a的2'o-MOE硫代磷酸酯AS0N的藥物動(dòng)力學(xué)(Geary, R. S.，et al.， 2003，DrugMetabolism and Disposition 31 :1419)。也已經(jīng)報(bào)告了混合的 LNA/DNA 分子的 系統(tǒng)有效性(Fluiter, K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res. 31 953)。利用2’ 0-M0E硫代磷酸酯和PNA化學(xué)作用調(diào)查了 SS0在小鼠模型系統(tǒng)中的全身 活性。在除腦、胃和真皮外的所有被研究的組織中觀(guān)察到了顯著活性(SaZani，P.，et al., 2002, Nature Biotechnology 20,1228)。通常，在傳統(tǒng)反義治療中有用的任何施藥方法都可以用來(lái)施用本發(fā)明的SS0。為了 在培養(yǎng)細(xì)胞中測(cè)試SS0，可以使用已經(jīng)開(kāi)發(fā)的測(cè)試AS0N或SS0的任何技術(shù)。本發(fā)明的劑型包含在生理上或藥學(xué)上可接受的載體，例如水性載體中的SSOs。因 此本發(fā)明使用的劑型包括，但不局限于那些適合腸胃外給藥的劑型，包括腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、 動(dòng)脈內(nèi)、皮下，肌肉注射或輸注的劑型，以及那些適合局部給藥(包括眼用的和用于黏膜 的，包括陰道遞送)，口服、經(jīng)直腸或肺(包包括粉末或氣霧劑的吸入或吹入，包括通過(guò)噴霧 器、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)遞送)給藥的劑型。所述制劑可以方便地以單位制劑形式存在，也可以通 過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法制備。在任何給定的情況下，最適當(dāng)?shù)慕o藥途徑取決于受試者待 治療的狀態(tài)的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及使用的特殊活性化合物。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不局限于其生理上和藥學(xué)上可接受的鹽，即保持母 體化合物想要的生物活性，此外還不產(chǎn)生不希望有的毒性作用的鹽。這種鹽的實(shí)例有(a) 用陽(yáng)離子，例如鈉、鉀、銨、鎂、鈣、多胺，例如精胺和亞精胺等等形成的鹽；(b)用無(wú)機(jī)酸，例 如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成鹽；(c)用有機(jī)酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來(lái)酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、安息香酸、丹寧酸、棕櫚 酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、P"甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的 鹽；以及(d)由基本陰離子，例如氯、溴和碘形成的鹽。本發(fā)明提供了利用具有上述特征的SSOs制備用于在受炎性紊亂折磨的病人體內(nèi) 增加TNFR超家族成員的可溶形式/它對(duì)應(yīng)的膜結(jié)合形式的比率的藥物的用途，其中炎性紊 亂涉及細(xì)胞因子，例如，上文討論的TNF-alpha的活性過(guò)強(qiáng)。在制造依照本發(fā)明的藥物時(shí)， SSOs典型地與可接受的載體混合。當(dāng)然，載體必須是可接受的，也就是與劑型中的任何其他 成分相容，而且必須對(duì)病人沒(méi)有害處。載體可以是固體或液體。SSOs被摻入到通過(guò)任何基 本上由混合組分組成的公知制藥技術(shù)制備的本發(fā)明的制劑中，其中所述制劑任意地包括一 種或多種附加的治療成分。本發(fā)明的制劑包括活性化合物的無(wú)菌的水性和非水性注射溶液，這種制劑優(yōu)選與 預(yù)期的接受者的血液等滲，而且基本上無(wú)熱原。這些制劑可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌 劑，以及使制劑與預(yù)期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)(solutes)。水性和非水性的無(wú)菌的懸浮 液可以包括，但不局限于懸浮劑和增稠劑。制劑可以存在于單劑量或多劑量容器，例如密封 的安瓿和管形瓶中，可以保存在凍干(凍干)狀態(tài)，在使用之前，只需要立刻添加無(wú)菌液體 載體，例如鹽水或注射用水就可以。在該制劑中，SSOs可以包含在脂質(zhì)粒子或囊，例如適合于腸胃外給藥的脂質(zhì)體或 微晶內(nèi)。粒子可以是任何適當(dāng)結(jié)構(gòu)，例如單層或多層的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。 這種粒子和囊特別優(yōu)選帶正電荷的脂質(zhì)，例如N-[l-(2，3-di0le0yl0Xi)丙基]-N，N, N-三 甲基-ammoniummethylsulfate或〃 D0TAP"。這種脂質(zhì)粒子的制備是公知的。[參見(jiàn)參考 文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，976，879的第6欄]SS0可以靶向調(diào)節(jié)剪接的任何元件或元件組合，包括3’剪接位點(diǎn)，5’剪接位點(diǎn)， 分支點(diǎn)，多聚嘧啶區(qū)域，外顯子剪接增強(qiáng)子，外顯子剪接沉默子，內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子，內(nèi)含子 剪接沉默子。在顯示SSOs活性的下列表格的引導(dǎo)下可以確定SS0的序列，其中SSOs的序 列和位置被發(fā)現(xiàn)描述在圖20中。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將注意到1)與外顯子互補(bǔ)的 SSOs不必與剪接受體位置或剪接供體位置互補(bǔ)，注意表1的SSOs A7-10、B7-7和B7-9 ；2) 與內(nèi)含子序列互補(bǔ)的SSOs和少至外顯子一個(gè)核苷酸的SSOs是可操作性的，注意的A8-5和 B7-6(表 1)；3)與緊鄰?fù)怙@子的內(nèi)含子互補(bǔ)的SSOs也是有效的，注意表2的3312 ；和4)單獨(dú) 的寡核苷酸的效力通?？梢灶A(yù)示與其他SSOs組合的SS0的效力。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以理解，可以利用具有與包含外顯子7或8和它們的鄰近 內(nèi)含子的TNFR1或TNFR2基因部分的至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選15-20個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列的 SS0實(shí)施靶向人TNF-a受體的本發(fā)明。更優(yōu)選外顯子本身的至少一個(gè)核苷酸被包含在互 補(bǔ)序列內(nèi)部。SEQ ID Nos :1-4 包含 TNFR1(SEQ ID Nos :1 和 2)和 TNFR2 (SEQ ID Nos :3 禾口 4)的外顯子7和8，以及側(cè)接的內(nèi)含子的50個(gè)相鄰核苷酸的序列。當(dāng)使用增強(qiáng)親合力的修 飾，包括，但不限于LNA或G-clamp核苷酸時(shí)，熟練技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到SS0的長(zhǎng)度可以相應(yīng) 地降低。當(dāng)使用交替的常規(guī)核苷酸和LNA核苷酸時(shí)，16個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度是有效的。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也承認(rèn)SS0序列的選擇必須要考慮避免自身互補(bǔ)的SS0，其 中自身互補(bǔ)可能導(dǎo)致部分"發(fā)夾"雙鏈結(jié)構(gòu)的形成。另外，應(yīng)避免高GC含量以將非特異性堿基配對(duì)的可能性降到最低程度。此外，也應(yīng)該避免使用通過(guò)BLAST顯示的與off-target 基因配對(duì)的SSOs。在一些情況下，選擇靶向人和至少一個(gè)其他物種的SS0序列是優(yōu)選的。使用在人 類(lèi)中開(kāi)始之前，可在所述的其他物種中用這些SSOs測(cè)試和優(yōu)化本發(fā)明，因此有助于調(diào)整報(bào) 批和藥物開(kāi)發(fā)目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos 74，75，77，78，80和89也與對(duì)應(yīng)的 Macaca Mullata獼猴序列100%互補(bǔ)。因此，在用于人類(lèi)以前，可以先在猴子體內(nèi)用這些序 列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解對(duì)如上所述的本發(fā)明所進(jìn)行的多種省略、添加和修飾 沒(méi)有偏離本發(fā)明的范圍，所有這種修飾和變化都在附加的權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的范 圍內(nèi)。所有引用的參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)或其他文件在此處都合并作為參考。在下文的序列表中，W02007/058894中公開(kāi)了 SEQ ID NOs 1-116。SEQIDs NOs 117-242 為 PCT/US2007/10557 中公開(kāi)的 SEQ ID NOs 1-126。SEQ IDsNOs 243-246 是本申 請(qǐng)中的新序列，而且是本發(fā)明的優(yōu)選寡聚物。表4 靶向人TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換寡聚物大寫(xiě)字母=LNA,小寫(xiě)字母=DNA)-注意 SEQ ID No 243 靶向小鼠 TNFR2。3378 3379 3384 在治療炎性疾病或狀態(tài)的一個(gè)具體實(shí)施方法中，施用了兩種或多種SSOs。在一個(gè)實(shí)施方案中受體是TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5 或 TNFRSFI1A， 所述的改變所述前信使RNA的剪接包括切除來(lái)自所述前信使RNA的外顯子7或外顯子8，或 者兩者都切除。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的改變所述前信使RNA的剪接包括切除外顯子7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B，所述的SSO包括與來(lái) 自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互補(bǔ)的至少10到至少20個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :74，75，77，78，80，82， 84和86-89組成的組的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSOs包含獨(dú)立地選自由如下選擇組成的組的一個(gè)或多 個(gè)核苷酸或核苷2’ -脫氧核糖核苷酸，2’ O-Me核糖核苷酸，2’ O-MOE核糖核苷酸，己糖醇 (HNA)核苷酸或核苷，2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何 硫代磷酸酯類(lèi)似物，上述的任何肽核酸(PNA)類(lèi)似物；上述的任何methylphosponate類(lèi)似 物，上述的任何肽核酸類(lèi)似物；上述的任何N3’ 一 P5’(N3’ fwdarw P5’ )氨基磷酸酯類(lèi)似 物，上述的任何phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類(lèi)似物，以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSOs包含獨(dú)立地選自由2’ O-Me核糖核苷酸和 2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷組成的組的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或核 苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述給藥是腸胃外、局部、口服、經(jīng)直腸或肺給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加細(xì)胞中來(lái)自TNFR超家族的穩(wěn)定分泌的配 體結(jié)合形式的受體生產(chǎn)的方法，包括給所述細(xì)胞施用一種或多種剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)， 其中所述的一種或多種SSOs能夠改變編碼所述受體的前信使RNA的剪接，因此能夠增加穩(wěn) 定分泌的配體結(jié)合形式的所述受體的生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是在體內(nèi)實(shí)施的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是選自由TNFRSF1A，TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8和TNFRSF1A組成的組的哺乳動(dòng)物受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是人TNFRSF1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的SSO包含與來(lái)自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互 補(bǔ)的至少10到至少20個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了至少10到至少20個(gè)核苷酸的SS0，所述SSOs能 夠改變編碼來(lái)自TNFR超家族的受體的前信使RNA的剪接，因此能夠增加穩(wěn)定分泌的配體結(jié) 合形式的所述受體的生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是選自由TNFRSF1A，TNFRSF1B, TNFRSF3, TNFRSF5, TNFRSF8和TNFRSFIIA組成的組的哺乳動(dòng)物受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是人TNFSF1A或人TNFRSF1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述受體是人TNFRSF1B。在一個(gè)實(shí)施方案中，SSO包含與來(lái)自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互補(bǔ)的至 少10到至少20個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，SSOs包含獨(dú)立地選自由如下選擇組成的組的在一個(gè)或多個(gè)核苷酸或核苷2’ -脫氧核糖核苷酸，2’ O-Me核糖核苷酸，2’ O-MOE核糖核苷酸，己糖醇 (HNA)核苷酸或核苷，2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何 硫代磷酸酯類(lèi)似物，上述的任何肽核酸(PNA)類(lèi)似物；上述的任何methylphosponate類(lèi) 似物，上述的任何肽核酸類(lèi)似物；上述的任何N3’ 一 P5’氨基磷酸酯類(lèi)似物，上述的任何 phosphorodiamidate嗎啉代核苷酸類(lèi)似物，以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷 分別是2’ 0-4’ C-(亞甲基)-呋核亞硝脲核苷酸或核苷，或者是2’ 0-4’ C-(乙烯)呋核亞 硝脲核苷酸或核苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSOs包含獨(dú)立地選自由2’ O-Me核糖核苷酸 和2’ 0-4’ C-連接的二環(huán)呋核亞硝脲(LNA)核苷酸或核苷組成的組的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或 核苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :8，9，14，17-21，24-29， 32，33，38-42，44-46，50-52，55-57，60，68-71，74，75，77，78，80，82，84 和 86-89 組成的組的 序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含SSO和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的SSO包含與來(lái)自SEQ ID Nos :1，2，3或4的毗連序列互 補(bǔ)的至少10到至少20個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的分離蛋白質(zhì)， 所述蛋白質(zhì)具有包含來(lái)源于哺乳動(dòng)物腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因的cDNA編碼的氨基酸 的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號(hào)序列的切割位點(diǎn)后的編 碼第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)(through)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和 所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開(kāi)放閱讀框的第一個(gè)氨基酸的密碼子，其 穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述TNF是TNF-alpha。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含至少至少一種化學(xué)加工或翻譯后修飾，其中 所述修飾選自由乙?；?、?；?、酰胺化，ADP-核糖基化、糖基化、甲基化、聚乙二醇化、異戊烯 化、磷酸化或膽固醇結(jié)合組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體是TNFRl，例如人TNFRl，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受 體是TNFR2，例如人TNFR2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含選自由SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 6 的氨基酸 30-417、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 8 的氨基酸 30-416、SEQ ID NO :10、 SEQ ID NO 10 的氨基酸 23-435、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 12 的氨基酸 23-448 所組成 的組的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的本發(fā)明的蛋 白質(zhì)的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施 用本發(fā)明的藥物組合物一段時(shí)間，其用量能有效降低TNF的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病或狀態(tài)選自由類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、 與甲型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與缺血/再灌注有關(guān)的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明提供了來(lái)源于哺乳動(dòng)物腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因并編碼能夠結(jié)合腫 瘤壞死因子(TNF)的蛋白質(zhì)的分離核酸，其中所述蛋白質(zhì)的cDNA包含從5’到3’的毗連排 列的在所述基因的信號(hào)序列的切割位點(diǎn)后的編碼第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因 的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開(kāi)放閱 讀框的第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基 因的外顯子10。在該實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)的序列包含選自由SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 6 的氨基酸 30-417、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 8 的氨基酸 30-416、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 10的氨基酸23-435、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 12的氨基酸23-448所組成的組的序 列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸序列包含選自由SEQ ID NO :5的核苷酸1-1251，SEQ ID NO 5 的核苷酸 88-1251，SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-1248，SEQ ID NO 7 的核苷酸 88-1248， SEQ ID NO 9 的核苷酸 1-1305，SEQ ID NO 9 的核苷酸 67-1305，SEQ ID NO 11 的核苷酸 1-1344，SEQ ID NO :11的核苷酸67-1344組成的組的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提 供了包含與調(diào)節(jié)序列操作性地連接的本發(fā)明的核酸的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)哺乳動(dòng)物體內(nèi)TNF拮抗劑水平的方法，包 括用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述哺乳動(dòng)物的細(xì)胞使其表達(dá)所述TNF拮抗劑，其中所述載體 驅(qū)動(dòng)所述TNFR表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人，例如所述人是患有炎性疾病或狀 態(tài)的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體是質(zhì)?；虿《?。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在體外被轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含組織特異性啟動(dòng)子，所述組織特異性啟動(dòng) 子例如，可以源自肝細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞選自由肝細(xì)胞、造血細(xì)胞、脾細(xì)胞和肌細(xì)胞組成的組。本發(fā)明提供了用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或 微生物細(xì)胞。本發(fā)明提供了產(chǎn)生能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質(zhì)的方法，包括在適合于表 達(dá)所述蛋白質(zhì)的情況下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞，并收獲所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的本發(fā)明的核酸或載體的藥物組 合物。本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施用本發(fā)明的表達(dá)載體一 段時(shí)間，其用量足以降低TNF的活性，例如TNF-alpha的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病或狀態(tài)選自由類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、與甲 型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與缺血 /再灌注有關(guān)的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給受試者施 用本發(fā)明的一種或多種剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs) —段時(shí)間，其用量能有效降低TNF的活性， 其中，所述的一種或多種SSOs能夠改變編碼哺乳動(dòng)物腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)(或 TNFR1)的前信使RNA的剪接，因此能夠增加能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，所 述蛋白質(zhì)具有包含來(lái)源于所述受體基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號(hào)序列的切割位點(diǎn)后的編碼第一個(gè)氨基酸的密碼子，其 穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述 基因的開(kāi)放閱讀框的第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯 子8和所述基因的外顯子10。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病或狀態(tài)選自由類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、炎性腸病(包括Crohn氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)、 與甲型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與丙型肝炎病毒有關(guān)的肝炎、與 缺血/再灌注有關(guān)的肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪變性組成的組。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述給藥是腸胃外、局部、口服、經(jīng)直腸或肺給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少8個(gè)核苷酸的剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSO)， 其中，所述SSOs能夠改變編碼哺乳動(dòng)物腫瘤壞死因子受體2 (TNFR2)(或TNFR1)的前信使 RNA的剪接，以增加能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，所述蛋白質(zhì)具有包含來(lái)源 于所述受體基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在 所述基因的信號(hào)序列的切割位點(diǎn)后的編碼第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯 子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或者包含編碼所述基因的開(kāi)放閱讀框的 第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外 顯子10。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含與來(lái)自SEQ ID NO :13的毗連序列互補(bǔ)的至 少8個(gè)核苷酸的SSO。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSO序列包括選自由SEQ ID Nos :14，30，46，70，71，72和 73,以及它們的至少8個(gè)核苷酸的子序列組成的組的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SSO序列包含選自由SEQ ID Nos :14_61組成的組的序 列。本發(fā)明提供了增加細(xì)胞中能結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的方法，包括 給所述細(xì)胞施用一種或多種剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)，其中，所述蛋白質(zhì)具有包含來(lái)源于哺 乳動(dòng)物腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)(或TNFR1)基因的cDNA編碼的氨基酸的序列，其中 cDNA包含從5’到3’的毗連排列的在所述基因的信號(hào)序列的切割位點(diǎn)后的編碼第一個(gè)氨基 酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯子6，所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10 ；或 者包含編碼所述基因的開(kāi)放閱讀框的第一個(gè)氨基酸的密碼子，其穿過(guò)所述基因的外顯子6， 所述基因的外顯子8和所述基因的外顯子10，其中，所述一種或多種SSOs能夠改變編碼所 述受體的前信使RNA的剪接，使所述蛋白質(zhì)的生產(chǎn)增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是在體 內(nèi)實(shí)施的。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的SSO和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。 實(shí)施例下列實(shí)施例與PCT/US2007/10557中描述的那些實(shí)施例等同。實(shí)施例1寡核苷酸。表6列出了具有交替的2’脫氧-和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖 核苷硫代磷酸酯和具有如上所述的序列的嵌合的鎖定核酸(LNA) SSOs。這些序列是由丹麥的Santaris Pharma合成的。對(duì)于每個(gè)SS0，5’ -末端的核苷是2’氧-4’ -亞甲基-核糖 核苷，3’ -末端核苷是2’脫氧核糖核苷。表7顯示了具有交替的2’ -氧-甲基-核糖核 苷-硫代磷酸酯(2’ -OMe)和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯的嵌合的 LNA SSOs的序列。這些序列是由丹麥的Santaris Pharma合成的。LNA用大寫(xiě)字母顯示， 2’ -OME用小寫(xiě)字母顯示。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。L929細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清和抗生素的最低必需培 養(yǎng)基中(37°C，5%C02)。為了轉(zhuǎn)染，將L929細(xì)胞接種到24孔板中，每孔IO5個(gè)細(xì)胞，24小時(shí) 以后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照廠(chǎng)家說(shuō)明，讓所標(biāo)示濃度的寡核苷酸與2μ1的Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑(Irwitrogen)形成復(fù)合物。然后將核苷酸/脂質(zhì)復(fù)合物施加給細(xì)胞并溫育24小 時(shí)。吸出培養(yǎng)基，并用TRI-試劑 (MRC，Cincinnati，0H)收獲細(xì)胞。RT-PCR。用TRI試劑(MRC，Cincinnati，0H)分離總RNA，并按照供應(yīng)商的說(shuō)明，利 用 rTth 聚合酶(Applied Biosystems)通過(guò)GeneAmp RT-PCR 擴(kuò)增 TNFRl 或 TNFR2 的 mRNA。每個(gè)反應(yīng)使用大約200ng RNA。此處描述的實(shí)施例中使用的引物包括在表2中。進(jìn) 行PCR循環(huán)95°C，60秒；56°C，30秒；72°C，60秒，總共進(jìn)行22-30個(gè)循環(huán)。在有些情況下，Cy5標(biāo)記的dCTP(GE Healthcare)被包含在PCR步驟中用于顯 象(每50 μ 1 PCR反應(yīng)0.1 μ 1)。在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離PCR產(chǎn)物， 用 Typhoon 9400 掃描器(GE Healthcare)顯現(xiàn) Cy5 標(biāo)記的條帶。用 ImageQuant (GE Healthcare)軟件對(duì)掃描進(jìn)行量化?；蛘?，不包含Cy5標(biāo)記的dCTP時(shí)，在包含用于顯象的痕 量溴化乙錠的1. 5%的瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。PCR依照廠(chǎng)家的說(shuō)明用Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)實(shí)施PCR。50 μ 1反 應(yīng)，使用大約30pmol的正反向引物。被用于此處描述的實(shí)施例中的引物包括在表5中。除 非另作說(shuō)明，否則按照如下條件進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)94°C，3分鐘；然后94°C，30秒，55°C，30 秒，以及72°C，105秒，共30-40個(gè)循環(huán)；接下來(lái)72°C，3分鐘。在1. 5%的瓊脂糖凝膠上分 析產(chǎn)物，用溴化乙錠顯象。表5 RT-PCR 和 PCR 弓 | 物 人肝細(xì)胞的培養(yǎng)。從ADMET技術(shù)或者UNC-Chapel Hill的UNC細(xì)胞代謝和運(yùn)輸中 心(UNC Cellular Metabolism and Transport Core)獲取懸浮液中的人肝細(xì)胞。在補(bǔ)充 有10% FBS, lmg/mL人胰島素和13nM DexamethASONe的RPMI 1640中洗滌并懸浮細(xì)胞。肝 細(xì)胞平鋪在6孔板中，每板3ml培養(yǎng)基，IO5個(gè)細(xì)胞。1-1. 5小時(shí)后，去除非粘附細(xì)胞，將培 養(yǎng)基替換為沒(méi)有FBS的補(bǔ)充有l(wèi)mg/mL人胰島素和130nM DexamethASONe的RPMI 1640。為了將SSOs遞送到6孔板的肝細(xì)胞中，IOml的5mM的SSO原液被稀釋成IOOml 0PTI-MEM ,4ml Lipofectamine 2000 被稀釋成 100ml0PTI-MEM 。然后將 200ml 復(fù)合物溶 液施加給包含2800ml培養(yǎng)基的6孔板中的細(xì)胞，液體總共為3000ml。最后的SSO濃度是 17nM。24小時(shí)后，在TRI-Reagent 中收獲細(xì)胞。按照廠(chǎng)家的說(shuō)明分離總RNA。大約200ng 的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)。ELISA。為了確定細(xì)胞培養(yǎng)基或血清中的可溶性TNFR2的水平，利用從R&D系 統(tǒng)(Minneapolis, MN)獲得的Quantikine 小鼠 sTNF RII ELISA 試劑盒或從 R&D 系統(tǒng) (Minneapolis, MN)獲得的Quantikine 人STNF RIIELISA試劑盒。檢測(cè)使用的抗體也可 以檢測(cè)蛋白酶切割形式的受體。利用設(shè)定在450nm的全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀對(duì)ELISA孔板 進(jìn)行讀數(shù)，波長(zhǎng)校正設(shè)定在570nm。為了進(jìn)行小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，將來(lái)自動(dòng)物的血在37 °C下凝結(jié)1小時(shí)，并在4 °C以 14，OOOrpm的轉(zhuǎn)數(shù)(Jouan BRA4i離心機(jī))離心10分鐘。收集血清，依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用 1 10稀釋的50ml小鼠血清進(jìn)行測(cè)試。L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)。在存在10%來(lái)自小鼠血清的情況下，用0. Ing/mLTNF- α和 lmg/mL放線(xiàn)菌素D處理平鋪在96孔板上，每孔IO4個(gè)細(xì)胞的L929細(xì)胞，讓細(xì)胞在37°C生 長(zhǎng) 24小時(shí)，其中所述小鼠用總數(shù)為IOOmL的完全MEM培養(yǎng)基(包含10%合格的FBS)中 的標(biāo)示寡核苷酸處理過(guò)。對(duì)照組平鋪在來(lái)自未處理小鼠的10%的血清中。24小時(shí)后，通過(guò) 添加 20mL Cel ITiter 96 AQue。us0ne Solution Reagent (Promega)和用全自動(dòng)定量繪圖酶 標(biāo)儀測(cè)量490nm的吸光度來(lái)測(cè)量細(xì)胞的生存能力。參照未處理細(xì)胞，將細(xì)胞生存能力標(biāo)準(zhǔn) 化。蛋白質(zhì)斑跡法(Western blots)。將二十毫升培養(yǎng)基或20mg裂解物上樣到4-12% 的NuPAGE 聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)的每個(gè)孔中。在200V的條件下運(yùn)行凝膠40 分鐘。30V轉(zhuǎn)移1小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Invitrolon PVDF膜(Invitrogen)上，然后用 StartingBlock 封閉緩沖液(Blocking Buffer) (Pierce)封閉膜1小時(shí)。室溫下，用識(shí) 別人和小鼠TNFR2的C-末端的兔多克隆抗體(Abeam)溫育膜3小時(shí)，在用PBS-T緩沖液 (lxPBS,0. 1% Tween-20)沖洗三次后，用二抗羊抗兔抗體(Abeam)在室溫下溫育膜1小時(shí)， 然后又用PBS-T緩沖液沖洗三次。最后依照廠(chǎng)家的介紹用ECL Plus (GEHealthcare)檢測(cè) 蛋白質(zhì)并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行拍照。實(shí)施例2-SS0對(duì)TNFR mRNA的剪接轉(zhuǎn)換活性表6顯示了具有如美國(guó)申請(qǐng)No. 11/595,485中描述的序列且靶向小鼠和人TNFRs 的SSOs的剪接轉(zhuǎn)換活性。靶向小鼠TNFR2外顯子7的SSOs中，至少有8個(gè)產(chǎn)生了一些 muTNFR2 Δ 7mRNA。特別是，SSO 3312和3305誘導(dǎo)了至少50%的外顯子7缺失；SSO 3305 處理導(dǎo)致幾乎完全的缺失。轉(zhuǎn)染到原代人肝細(xì)胞中，而且靶向人TNFR2外顯子7的SSOs中的至少 7 個(gè) SSOs 產(chǎn)生了一些 huTNFR2A7mRNA。特別是，SSOs 3378、3379、3384 和洶59 誘 導(dǎo)了至少75%的外顯子7缺失(圖2B)，huTNFR2A7被顯著誘導(dǎo)到了細(xì)胞外培養(yǎng)基中(圖 2A)。 表6 :SS0的剪接轉(zhuǎn)換活性 表7包含具有交替的2’ -氧-甲基-核糖核苷-硫代磷酸酯(2’ -OMe)和2’ 氧-4，-(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯的10個(gè)核苷酸嵌合的SSOs的序列。這些 SSOs靶向小鼠TNFR2的外顯子7。表7 :LNA/2' -OMe-核糖核苷-硫代磷酸酯嵌合的靶向小鼠的SSO *大寫(xiě)字母是2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷；小寫(xiě)字母是2’ -OMe為了分析表7中列出的SSOs的體外剪接轉(zhuǎn)換活性，可以按照實(shí)施例1的描述培 養(yǎng)并接種L929細(xì)胞。為了將表7中的每一個(gè)SSOs遞送給L929細(xì)胞，將SSOs稀釋到50ml OPT I-MEM 中，然后添加 50ml Lipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25份0ΡΤΙ-ΜΕΜ )并溫育20分鐘。接下來(lái)，將400ml無(wú)血清培養(yǎng)基添加到SSOs中，并將其 施用給24孔板中的細(xì)胞。SSO的終濃度是50或ΙΟΟηΜ。24小時(shí)后，將細(xì)胞收獲到800ml TRI-Reagent 中。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明分離總RNA，并利用正向引物TR045 (SEQ ID NO 228)和 反向引物TR046 (SEQ ID NO 229)通過(guò)RT-PCR進(jìn)行分析(圖3)。為了分析表7中列出的SSOs在體內(nèi)的剪接轉(zhuǎn)換活性，以25mg/kg/天的劑量給小 鼠腹腔內(nèi)注射表4中列出的SSOs，共注射5天。在注射之前對(duì)小鼠進(jìn)行放血處理，在最后一 次注射后的1、5、10天又再次放血。通過(guò)ELISA測(cè)量第一次注射前和最后一次注射后10天 的血清中的可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖4Β)。在第10天處死小鼠，利用正向引物TR045 (SEQ ID NO 228)和反向引物TR046(SEQ ID NO 229)通過(guò)RT-PCR分析從5_10mg肝臟中獲取的 總 RNA。所有體外測(cè)試的SSO 3274的10核苷酸的SSOs子序列都產(chǎn)生了至少一些 muTNFR2 Δ 7mRNA(圖3)。特別是，SSO 3839,3840和3841顯示出比衍生它們的更長(zhǎng)的16核 苷酸的SSO 3274更大的剪接轉(zhuǎn)換活性。體外顯示出最大活性的三個(gè)10核苷酸SSOs 3839、 3840,3841也能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的muTNFR2 Δ 7mRNA(圖4A)和可溶性muTNFR2 Δ 7蛋白 質(zhì)(圖4Β)。為了評(píng)價(jià)SSO長(zhǎng)度對(duì)人TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換活性的影響，用不同長(zhǎng)度的SSOs處理細(xì) 胞。用選自表4的標(biāo)示的SSOs轉(zhuǎn)染原發(fā)的人肝細(xì)胞。通過(guò)丹麥的Santaris Pharma，用交替 的2’脫氧和2’ 0-4’ _(亞甲基)_ 二環(huán)-核糖核苷硫代磷酸酯合成這些SSOs。每一個(gè)SSO 的5’ -末端核苷是2’ 0-4’ -亞甲基-核糖核苷，3’ -末端核苷是2’脫氧核糖核苷。這些SSOs長(zhǎng)度為10-、12-、14-或16-個(gè)核苷酸。通過(guò)ELISA測(cè)定可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖 5，上部的網(wǎng)格)。通過(guò)RT-PCR分析總RNA的剪接轉(zhuǎn)換活性(圖5，底部的網(wǎng)格)。實(shí)施例3-分析SSO誘導(dǎo)的TNFR2剪接變體的剪接接合為了在小鼠和人細(xì)胞中證實(shí)SSO的剪接轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了預(yù)期的TNFR2A7mRNA，通過(guò) RT-PCR分析SSO誘導(dǎo)的TNFR2 Δ 7mRNA并進(jìn)行測(cè)序。小鼠。以25mg/kg/天的劑量給小鼠腹腔內(nèi)注射SSO 3274，共注射10天。然后處 死小鼠，并利用正向引物TR045(SEQ ID NO 228)和反向引物TR046 (SEQ ID NO 229)通過(guò) RT-PCR分析來(lái)自肝臟的總RNA。在1. 5%瓊脂糖凝膠上分析產(chǎn)物，并利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技 術(shù)分離編碼TNFR2 Δ 7的產(chǎn)物。利用相同的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增分離的TNFR2 Δ 7產(chǎn)物并進(jìn)行 測(cè)序(圖 6Β)。序列資料包含序列 CTCTCTTCCAATTGAGAAGCCCTCCTGC(SEQ ID NO 127 的核 苷酸777-804)，這也證實(shí)SSO誘導(dǎo)的TNFR2 Δ 7mRNA缺乏外顯子7，外顯子6直接連接到外 顯子8上。人肝細(xì)胞。按照實(shí)施例1的描述用SSO 3379轉(zhuǎn)染原代人肝細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小 時(shí)分離總RNA。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用隨機(jī)的六聚體引物，用Superscript 〗〗逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen)將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。利用正向引物TR049 (SEQ ID NO 202)和反向引物 TR050 (SEQ ID NO 203)對(duì)cDNA進(jìn)行PCR。在1. 5%的瓊脂糖凝膠上分析產(chǎn)物(圖7A)。利 用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離相當(dāng)于TNFR2 Δ 7的條帶并進(jìn)行測(cè)序(圖7Β)。序列資料包含序 列 CGCTCTTCCAGTTGAGAAGCCCTTGTGC(SEQ ID NO 125 的核苷酸 774-801)，這也證實(shí) SSO 誘 導(dǎo)的TNFR2 Δ 7mRNA缺乏外顯子7，外顯子6直接連接到外顯子8上。實(shí)施例4-SS0誘導(dǎo)在原代人肝細(xì)胞中生產(chǎn)TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)的劑量依賴(lài)性在原代人肝細(xì)胞中測(cè)試了 SSOs的剪接轉(zhuǎn)換活性的劑量反應(yīng)。獲取來(lái)自ADMET技 術(shù)的處于懸浮液中的人肝細(xì)胞。將細(xì)胞洗滌三次并懸浮在接種培養(yǎng)基中(補(bǔ)充有L-谷氨 酸，10% FBS，青霉素，鏈霉素和UnMDexamethASONe)。評(píng)估肝細(xì)胞的生存能力，并將肝細(xì)胞 平鋪在涂有膠原的24孔板上，每孔l.OxlO5個(gè)細(xì)胞。典型的細(xì)胞生存能力是85-93%。大 約24小時(shí)后，將培養(yǎng)基替換為維持培養(yǎng)基(沒(méi)有ras的接種培養(yǎng)基)。為了將每一個(gè)SSOs遞送給肝細(xì)胞，將SSOs稀釋到50ml 0ΡΤΙ-ΜΕΜ 中，然后添加 50ml Lipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25 份 OPT I-MEM )并溫 育20分鐘。然后將SSOs施用給24孔板中的細(xì)胞。最后的SSO濃度是1-150ηΜ。48小時(shí) 后，將細(xì)胞收獲到800ml TRI-Reagent 中。利用正向引物TR047(SEQ ID NO :200)和反向引物 TR048 (SEQ ID NO :201)通過(guò) RT-PCR分析來(lái)自細(xì)胞的總RNA(圖8A)。通過(guò)ELISA測(cè)定血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度 (圖8Β)。huTNFR2 Δ 7mRNA(圖8A)和分泌的huTNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)(圖8Β)都顯示出劑量依 賴(lài)性的升高。實(shí)施例5-來(lái)自鼠科動(dòng)物細(xì)胞的TNFR2剪接變體的分泌測(cè)試SSOs誘導(dǎo)可溶性TNFR2蛋白質(zhì)生產(chǎn)并分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基的能力。按照實(shí) 施例1的描述用SSOs處理L929細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞外培養(yǎng)基樣品。通過(guò)ELISA 測(cè)量樣品中可溶性TNFR2的濃度(圖9)。誘導(dǎo)RNA剪接轉(zhuǎn)移最好的SSOs也能將最多的蛋 白質(zhì)分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。特別是，SSOs 3305，3312和3274可以相對(duì)于背景增加可溶 性TNFR2至少3. 5倍。因此，剪接變體mRNA的誘導(dǎo)與可溶性TNFR2的生產(chǎn)和分泌有相互關(guān)系。實(shí)施例6-體內(nèi)注射SSOs在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生muTNFR2 Δ 7mRNA將鹽水中的SSO 3305通過(guò)腹膜內(nèi)注射(i. p.)到小鼠體內(nèi)，注射劑量為3mg/ kg-25mg/kg,每天注射，持續(xù)4天。在第5天處死小鼠，通過(guò)RT-PCR分析來(lái)自肝臟的總RNA。 數(shù)據(jù)顯示與細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的剪接轉(zhuǎn)換效力相似的剪接轉(zhuǎn)換效力。劑量為25mg/kg的最 大劑量時(shí)，SSO 3305處理幾乎誘導(dǎo)完全轉(zhuǎn)變成A7mRNA(圖10，底部網(wǎng)格)。對(duì)SSO 3274進(jìn)行的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)大約20%轉(zhuǎn)換成Δ 7mRNA。為了優(yōu)化SSO 3274 誘導(dǎo)Δ 7mRNA的過(guò)程，改變了給藥方法和從最后一次注射到處死動(dòng)物的時(shí)間。每天將SSO 3274注射(i.p)到小鼠體內(nèi)，持續(xù)4天。SSO處理在第15天分析的小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)大約30% 轉(zhuǎn)換成A7mRNA，而在第5天分析的小鼠體內(nèi)觀(guān)察到20%的轉(zhuǎn)變(圖10，上部網(wǎng)格)。此外， 注射Δ710天，在第11天處死的小鼠顯示出誘導(dǎo)50%的mRNA(圖10，上部)。這些體內(nèi)數(shù) 據(jù)表明TNFR2SS0s可以在給藥后至少10天產(chǎn)生muTNFR2 Δ 7mRNA。實(shí)施例7-循環(huán)的TNFR2 Δ 7以25mg/kg/天的劑量給小鼠腹腔內(nèi)注射(i. p) SSO 3274,3305或?qū)φ?083，共注 射10天。在注射之前對(duì)小鼠進(jìn)行放血處理，在最后一次注射后的1、5、10天又再次放血。測(cè) 定血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度。SSO處理可以誘導(dǎo)可溶性TNFR2 Δ 7蛋白水平超過(guò)背景 至少10天(圖11)。為了測(cè)試更長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)的效果，可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)，除了直到最后一次注射后的第27天 收集血清樣品外。結(jié)果顯示可溶性TNFR2 Δ 7的水平在最后一次注射后的第27天只有輕微 下降(圖12)。實(shí)施例8-小鼠血清中的抗TNF-alpha活性在L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)中測(cè)試來(lái)自SSO 3274處理小鼠的血清的抗TNF-α活性。在 該試驗(yàn)中，按照實(shí)施例1的描述測(cè)定血清保護(hù)培養(yǎng)的L929細(xì)胞不受固定濃度的TNF-α的 細(xì)胞毒性影響的能力。來(lái)自SSO 3274，而不是對(duì)照SSOs (3083或3272)處理小鼠的血清增 強(qiáng)了暴露于0. Ing/mL TNF-α的L929細(xì)胞的生存能力。因此，SSO 3274血清包含足以結(jié) 合并活化TNF-α的TNF-α拮抗劑，因此可以保護(hù)細(xì)胞不受TNF-α的細(xì)胞毒性影響。這種 抗TNF- α活性存在于最后一次注射SSO 3274后5天和27天的動(dòng)物血清中。實(shí)施例9-SS0產(chǎn)生的TNFR2 Δ 7與其他抗TNF- α拮抗劑的比較依照如上所述的方法接種L929細(xì)胞。制備包含90 μ 1無(wú)血清的ΜΕΜ，0. lng/ml TNF-α和lug/ml的放線(xiàn)菌素D，以及(i)來(lái)自Sigma 的具有小鼠TNFR2的236個(gè)氨基酸 殘基的細(xì)胞外域的重組的可溶性蛋白質(zhì)(0.01-3mg/mL)，(ii)來(lái)自SSO 3274或SSO 3305 處理小鼠的血清(1.25-10%，稀釋在未處理小鼠的血清中；通過(guò)ELISA確定TNFR2A7的 濃度)或者(iii) Enbrel (0. 45-150pg/ml)，至最終體積為100 μ 1，最終小鼠血清濃度 為10%。在室溫下溫育樣品30分鐘。隨后，將樣品施用給平鋪的細(xì)胞，37°C，在包含5% C02的濕潤(rùn)空氣中溫育24小時(shí)。通過(guò)添加20μ1 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (Promega)并用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)量490nm的吸收度來(lái)測(cè)量細(xì)胞生存能力。 參照未處理細(xì)胞將細(xì)胞生存能力標(biāo)準(zhǔn)化，并以TNF拮抗劑濃度為函數(shù)繪圖(圖14)。實(shí)施例10-TNFR2 Δ 7mRNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以25mg/kg/天的劑量，每天給小鼠腹腔注射SSO 3274或3272 (對(duì)照)(η = 5)，共注射5天。在注射開(kāi)始前和最后一次注射后5、15、22、27和35天對(duì)小鼠進(jìn)行放血處理。 測(cè)量血清中可溶性TNFR2 Δ 7的濃度(圖15Α)。在處死小鼠時(shí)，也通過(guò)對(duì)來(lái)自肝臟的總RNA 進(jìn)行RT-PCR確定了肝臟中TNFR2的剪接轉(zhuǎn)換。結(jié)合實(shí)施例7的數(shù)據(jù)就會(huì)發(fā)現(xiàn)，SSO處理 后TNFR2mRNA水平的時(shí)程與血清中TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)的時(shí)程一起被構(gòu)建，而且兩者是被比 較(圖16)。數(shù)據(jù)顯示體內(nèi)TNFR2 Δ 7mRNA衰退的速率比血清中TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)大約快4 倍。在第35天，只能檢測(cè)到痕量TNFR2 Δ 7mRNA,但TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)卻只從最高濃度下降了 20%。實(shí)施例11-產(chǎn)生人TNFR2 Δ 7通過(guò)購(gòu)買(mǎi)從OriGene (產(chǎn)品目錄No :TC119459，ΝΜ_001066. 2)獲取包含全長(zhǎng)人 TNFR2cDNA的cDNA質(zhì)粒。通過(guò)利用反向引物TR001(SEQ ID NO 116)和正向引物TR002 (SEQ ID NO 117)在質(zhì)粒上實(shí)施PCR來(lái)獲取cDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化PCR產(chǎn) 物，所述PCR產(chǎn)物包含沒(méi)有終止密碼子的1383bp的TNFR2開(kāi)放閱讀框?；蛘撸ㄟ^(guò)利用 TR001反向引物和TR002正向引物對(duì)來(lái)自人單核細(xì)胞的總RNA實(shí)施RT-PCR，來(lái)獲取全長(zhǎng)人 TNFR2cDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化PCR產(chǎn)物。為了產(chǎn)生人TNFR2A7cDNA，在全長(zhǎng)人TNFR2cDNA上進(jìn)行兩個(gè)分離的PCR反應(yīng)，以產(chǎn) 生TNFR2A7cDNA的重疊片段。在一個(gè)反應(yīng)中，利用正向引物TR003 (SEQ ID NO 190)和反 向引物TR004(SEQ ID NO 191)對(duì)全長(zhǎng)TNFR2cDNA進(jìn)行PCR。在一個(gè)反應(yīng)中，利用反向引物 TR005 (SEQ IDNO 192)和正向引物TR002對(duì)全長(zhǎng)TNFR2cDNA進(jìn)行PCR。最后，合并2個(gè)重疊 片段，并利用正向引物TR002和反向引物TR004進(jìn)行PCR。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和 純化PCR產(chǎn)物，所述PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)包含具有終止密碼子的1308bp的TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框 (SEQ ID NO 125)。類(lèi)似地，在這些PCR反應(yīng)中，利用反向引物TROO1代替反向引物TR004產(chǎn)生具有終 止密碼子的1305bp的人TNFR2 Δ 7的開(kāi)放閱讀框。當(dāng)最終的PCR產(chǎn)物被插入適當(dāng)?shù)妮d體中 時(shí)，這也允許添加框內(nèi)的C末端親合力純化標(biāo)記，例如His標(biāo)記。實(shí)施例12-產(chǎn)生人TNFRl Δ 7通過(guò)購(gòu)買(mǎi)從OriGene (產(chǎn)品目錄No :TC127913，ΝΜ_001065. 2)獲取包含全長(zhǎng)人 TNFR2cDNA的cDNA質(zhì)粒。通過(guò)利用反向引物TR006 (SEQ IDNO 204)和正向引物TR007 (SEQ ID NO 205)在質(zhì)粒上實(shí)施PCR來(lái)獲取cDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)人 TNFRlcDNA 的 PCR 產(chǎn)物?；蛘撸ㄟ^(guò)利用反向引物TR006和正向引物TR007對(duì)來(lái)自人單核細(xì)胞的總RNA 實(shí)施RT-PCR，來(lái)獲取全長(zhǎng)人TNFRlcDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)人 TNFRlcDNA 的 PCR 產(chǎn)物。為了產(chǎn)生人TNFRl Δ 7cDNA,在全長(zhǎng)人TNFRlcDNA上進(jìn)行兩個(gè)分離的PCR反應(yīng)，以 產(chǎn)生TNFRlA7cDNA的重疊片段。在一個(gè)反應(yīng)中，利用正向引物TR008 (SEQ ID NO 206)和 反向引物TR006對(duì)全長(zhǎng)TNFRlcDNA進(jìn)行PCR。在一個(gè)反應(yīng)中，利用反向引物TR009 (SEQ ID NO 207)和正向引物TR010(SEQ ID NO 208)對(duì)全長(zhǎng)TNFRlcDNA進(jìn)行PCR。最后，合并2個(gè) 重疊片段，并利用正向引物TR010和反向引物TR006進(jìn)行PCR。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分 離和純化PCR產(chǎn)物，所述PCR產(chǎn)物包含具有終止密碼子的1254bp的人TNFRl Δ 7開(kāi)放閱讀 框(SEQ ID NO 121)。
或者，在這些PCR反應(yīng)中，可以利用反向引物TRO11代替反向引物TR006產(chǎn)生沒(méi)有 終止密碼子的1251bp的人TNFRl Δ 7的開(kāi)放閱讀框。當(dāng)最終的PCR產(chǎn)物被插入適當(dāng)?shù)妮d體 中時(shí)，這也允許添加框內(nèi)的C末端親合力純化標(biāo)記，例如His標(biāo)記。實(shí)施例13-產(chǎn)生鼠科動(dòng)物TNFR2 Δ 7cDNA為了產(chǎn)生全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物TNFR2cDNA，利用反向引物TR012(SEQ IDNO 214)和正 向引物TR013(SEQ ID NO 215)對(duì)商業(yè)上獲得的FirstChoice 的為PCR準(zhǔn)備的小鼠肝 cDNA (PCR-Ready Mouse Liver cDNA) (Ambion，產(chǎn)品目錄No :AM3300)進(jìn)行 PCR。利用標(biāo)準(zhǔn)分 子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物TNFR2cDNA的PCR產(chǎn)物。然后，通過(guò)利用TRO14正 向引物(SEQ IDNO 216)和反向引物TR012對(duì)所產(chǎn)生的產(chǎn)物進(jìn)行PCR，將合適的Kozak序列 引入其中。或者，通過(guò)利用反向引物TR015(SEQ ID NO :217)和正向引物TR016 (SEQ ID NO: 218)對(duì)來(lái)自人單核細(xì)胞或小鼠肝細(xì)胞的總RNA實(shí)施RT-PCR，來(lái)獲取全長(zhǎng)的鼠TNFR2cDNA。 利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物TNFR2cDNA的PCR產(chǎn)物。為了產(chǎn)生鼠的TNFR2 Δ 7cDNA,在全長(zhǎng)鼠的TNFR2cDNA上進(jìn)行兩個(gè)分離的PCR反應(yīng)， 以產(chǎn)生TNFR2A7cDNA的重疊片段。在一個(gè)反應(yīng)中，利用正向引物TR017 (SEQ ID NO 219) 和反向引物TRO15對(duì)全長(zhǎng)TNFR2cDNA進(jìn)行PCR。在一個(gè)反應(yīng)中，利用反向引物TRO18 (SEQ ID NO 220)和正向引物TR016對(duì)全長(zhǎng)TNFR2cDNA進(jìn)行PCR。最后，合并2個(gè)重疊片段，并利用 正向引物TR016和反向引物TR015進(jìn)行PCR。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化PCR產(chǎn) 物，所述PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)包含具有終止密碼子的1348bp的鼠TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO 127)?；蛘撸谶@些PCR反應(yīng)中，可以利用反向引物TR019(SEQ ID NO :221)代替反向引 物TR015產(chǎn)生沒(méi)有終止密碼子的1345bp的鼠TNFR2 Δ 7的開(kāi)放閱讀框。當(dāng)最終的PCR產(chǎn)物 被插入適當(dāng)?shù)妮d體中時(shí)，這也允許添加框內(nèi)的C末端親合力純化標(biāo)記，例如His標(biāo)記。實(shí)施例14-產(chǎn)生鼠科動(dòng)物TNFRl Δ 7cDNA為了產(chǎn)生全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物TNFRlcDNA，利用反向引物TR020(SEQ IDNO 230)和正 向引物TR021(SEQ ID NO 231)對(duì)商業(yè)上獲得的FirstChoice 的為PCR準(zhǔn)備的小鼠肝 cDNA (PCR-Ready Mouse Liver cDNA) (Ambion，產(chǎn)品目錄 No :AM3300)進(jìn)行 PCR。利用標(biāo)準(zhǔn) 分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)鼠科動(dòng)物TNFRlcDNA的PCR產(chǎn)物?；蛘撸ㄟ^(guò)利用反向引物TR020和正向引物TR021對(duì)來(lái)自小鼠單核細(xì)胞的總RNA 實(shí)施RT-PCR，來(lái)獲取全長(zhǎng)鼠TNFRlcDNA。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化全長(zhǎng)鼠科 動(dòng)物TNFRlcDNA的PCR產(chǎn)物。為了產(chǎn)生鼠的TNFRl Δ 7cDNA,在全長(zhǎng)人TNFRlcDNA上進(jìn)行 兩個(gè)分離的PCR反應(yīng)，以產(chǎn)生TNFRlA7cDNA的重疊片段。在一個(gè)反應(yīng)中，利用正向引物 TR022 (SEQID NO 232)和反向引物TR020對(duì)全長(zhǎng)TNFRlcDNA進(jìn)行PCR。在另一個(gè)反應(yīng)中，利 用反向引物 TR023(SEQ ID NO 233)和正向引物 TR024(SEQ IDNO 234)對(duì)全長(zhǎng) TNFRlcDNA 進(jìn)行PCR。最后，合并2個(gè)重疊片段，并利用正向引物TR024和反向引物TR020進(jìn)行PCR。利 用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離和純化1259bp的PCR產(chǎn)物，所述PCR產(chǎn)物包含具有終止密碼子 的 125 Ibp 的鼠 TNFRl Δ 7 開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO :123)。或者，在這些PCR反應(yīng)中，可以利用反向引物TR025(SEQ ID NO :235)代替反向引 物TR020產(chǎn)生沒(méi)有終止密碼子的1248bp的鼠TNFRl Δ 7的開(kāi)放閱讀框。當(dāng)最終的PCR產(chǎn)物被插入適當(dāng)?shù)妮d體中時(shí)，這也允許添加框內(nèi)的C未端親合力純化標(biāo)記，例如His標(biāo)記。實(shí)施例15-構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人TNFR2 Δ 7的載體為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例12的人 TNFR2A7cDNA PCR產(chǎn)物整合到適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，將來(lái) 自實(shí)施例12的具有和不具有終止密碼子的TNFR2 Δ 7cDNA PCR產(chǎn)物與pcDNA 3. ID V5-HisTOP〇 表達(dá)載體(Invitrogen)進(jìn)行平末端連接和分離。依照供應(yīng)商的說(shuō)明，用包 含編碼人TNFR2 Δ 7的插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化()neShot ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。將 五十毫升轉(zhuǎn)化混合物平鋪在具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過(guò)夜。將 單個(gè)集落接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過(guò)夜。然后將培養(yǎng)物 接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的200mL LB培養(yǎng)基上，37°C生長(zhǎng)過(guò)夜。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明， 利用 GenElute 質(zhì)粒 Maxipr印試劑盒(Plasmid Maxiprep kit) (Sigma)分離質(zhì)粒。純化 效率為每次制備0. 5-1. 5mg質(zhì)粒。產(chǎn)生三個(gè)人TNFR2 Δ 7克隆(1319-1，1138-5與1230-1)，并對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序?？?隆1319-1包含后面直接連接有來(lái)自質(zhì)粒的框內(nèi)His標(biāo)記的沒(méi)有終止密碼子的人TNFR2A7 開(kāi)放閱讀框；而克隆1138-5和1230-1包含后面立刻連接有終止密碼子的TNFR2 Δ 7開(kāi)放 閱讀框。SEQ ID NO 242中給出了來(lái)自質(zhì)粒的His標(biāo)記的序列?？寺?230-1和1319-1的 TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框的序列分別與具有和沒(méi)有終止密碼子的SEQ ID Ν0:125相同。然而， 相對(duì)于SEQ IDNO :125，克隆1138-5的TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框的序列(SEQ ID NO 231)在外 顯子10的位置1055處有一個(gè)核苷酸不同，前者是Α，而后者是G。該單核苷酸變化導(dǎo)致氨 基酸352由谷氨酰胺變成精氨酸。實(shí)施例16-在大腸桿菌中表達(dá)人TNFR2 Δ 7為了在細(xì)菌中表達(dá)人TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA整合 到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，例如pETDirectionalTOPO 表達(dá)載體(Invitrogen)中。利用正向引 物(TR002) (SEQ ID NO 191)和反向引物(TR026) SEQ ID NO 195 對(duì)來(lái)自實(shí)施例 12 的 PCR 片段進(jìn)行PCR，以引入適合載體的同源重組位點(diǎn)。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體(Invitrogen)溫育產(chǎn)生的PCR片段以產(chǎn)生人TNFR2 Δ 7細(xì)菌表達(dá)載體。產(chǎn)生的載體被 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠(chǎng)家的說(shuō)明從細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)人TNFR2 Δ 7。實(shí)施例17-在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人TNFR2 Δ 7為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA 整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR027) (SEQ IDNO :196和反向引物(TR028) (SEQ ID NO 197)對(duì)來(lái)自實(shí)施例12的人TNFR2 Δ 7cDNA進(jìn)行PCR。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Xhol消 化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。將消化的PCR產(chǎn)物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)， 例如 pENTR (TM) 1A, pENTR (TM) 2B, pENTR (TM) 3C, pENTR (TM) 4 或 pENTR (TM) 11 載體中的任何 一個(gè)連接以產(chǎn)生輸入載體。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，禾Ij用LRClonase (Invitrogen)，通過(guò)輸入載體與 BaculoDirect 線(xiàn)性DNA(Invitrogen)的同源重組產(chǎn)生包含人TNFR2 Δ 7cDNA的桿狀病毒 載體。然后用反應(yīng)混合物感染Sf9細(xì)胞以產(chǎn)生重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后， 證實(shí)人TNFR2A7被表達(dá)。重組桿狀病毒的擴(kuò)增產(chǎn)生了高滴度的病毒庫(kù)存。用高滴度的病 毒庫(kù)存感染Sf9細(xì)胞，從而表達(dá)人TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)。
實(shí)施例18-表達(dá)人TNFR2 Δ 7的腺相關(guān)病毒載體的產(chǎn)生為了在體外或體內(nèi)將人TNFR2 Δ 7基因遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在所述哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中進(jìn)行表達(dá)，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1 1412 的描述利用三 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生重組的腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR029)(SEQ ID NO 198)和反向引物(TR030) (SEQ IDNO 199)對(duì)實(shí)施例12的純化的人TNFR2D7PCR產(chǎn)物進(jìn) 行PCR，以引入側(cè)接的唯一的NotI限制性位點(diǎn)。用Notl限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn) 物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)(UNC)的載體中心實(shí)驗(yàn)室)上，以產(chǎn)生包含人TNFR2D7開(kāi) 放閱讀框的質(zhì)粒，所述開(kāi)放閱讀框與CMVie啟動(dòng)子操作性連接，還側(cè)接了末端反向重復(fù)。然 后，按照Grieger，J.等的描述，用質(zhì)粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗(yàn)室)將產(chǎn)生的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中，以產(chǎn)生包含人TNFR2 Δ 7基因的rAAV粒子，其中人TNFR2 Δ 7 基因的表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照Grieger，J.等的描述收獲并純化病 毒粒子以提供適合轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rAAV原料。實(shí)施例19-在大腸桿菌中表達(dá)人TNFRl Δ 7為了在細(xì)菌中表達(dá)人TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)，將cDNA整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，例如 pETDirectional TOPO 表達(dá)載體(Invitrogen)中。利用正向引物(TROlO) (SEQ ID NO: 208和反向引物(TR006) (SEQ ID NO 204)對(duì)cDNA進(jìn)行PCR，以引入適合載體的同源重組位 點(diǎn)。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體(Invitrogen)溫育產(chǎn)生的PCR片段以產(chǎn) 生人TNFRl Δ 7細(xì)菌表達(dá)載體。產(chǎn)生的載體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依 照廠(chǎng)家的說(shuō)明從細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)人TNFRl Δ 7。實(shí)施例20-在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人TNFRl Δ 7為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)，將人TNFRl Δ 7cDNAPCR產(chǎn)物 整合到適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中，依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，將人TNFRl Δ 7cDNA PCR產(chǎn)物與 pcDNA 3. ID V5-HisTOPO 表達(dá)載體(Invitrogen)進(jìn)行平末端連接。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)分 子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物以產(chǎn)生哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。然后，載體被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中，其中人TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)的表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。實(shí)施例21-在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人TNFRl Δ 7為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)人TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例12的cDNA整合到桿 狀病毒載體中。利用正向引物(TR031) (SEQ ID NO 210)和反向引物(TR032) (SEQ ID NO 211)對(duì)來(lái)自實(shí)施例12的cDNA進(jìn)行PCR。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Xhol消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn) 物。將消化的PCR產(chǎn)物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如pENTR lA， pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4或pENTR l 1載體中的任何一個(gè)的連接以產(chǎn)生輸入載體。然 后，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用LR Clonase (Invitrogen)，通過(guò)輸入載體與 BaculoDirect 線(xiàn)性DNA(Invitrogen)的同源重組產(chǎn)生包含人TNFRl Δ 7cDNA的桿狀病毒 載體。然后用反應(yīng)混合物感染Sf9細(xì)胞以產(chǎn)生重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后， 證實(shí)人TNFRl Δ 7被表達(dá)。重組桿狀病毒的擴(kuò)增產(chǎn)生了高滴度的病毒庫(kù)存。用高滴度的病 毒庫(kù)存感染Sf9細(xì)胞，從而表達(dá)人TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)。實(shí)施例22-表達(dá)人TNFRl Δ 7的腺相關(guān)病毒載體的產(chǎn)生
為了在體外或體內(nèi)將人TNFRl Δ 7基因遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在所述哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中進(jìn)行表達(dá)，按照Grieger，J.，et al. ,2006,Nature Protocols 1 1412的描述利用三質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生重組的腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR033) (SEQ ID NO 212)和反向引物(TR034) (SEQ ID NO 213)對(duì)純化的人TNFR1D7PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR，以引入 側(cè)接的Notl限制性位點(diǎn)。用Notl限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生 物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的pTR-UF2(美國(guó)北卡羅來(lái) 納州大學(xué)(UNC)的載體中心實(shí)驗(yàn)室)上，以產(chǎn)生包含人TNFR1D7開(kāi)放閱讀框的質(zhì)粒，所述開(kāi) 放閱讀框與CMVie啟動(dòng)子操作性連接，還側(cè)接了末端反向重復(fù)。然后，按照Grieger，J.等 的描述，用質(zhì)粒PXX680和pHelper (UNC載體中心試驗(yàn)室)將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì) 胞中，以產(chǎn)生包含人TNFRl Δ 7基因的rAAV粒子，其中人TNFRl Δ 7基因的表達(dá)由較強(qiáng)的組 成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照Grieger，J.等的描述收獲并純化病毒粒子以提供適合轉(zhuǎn)導(dǎo) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rAAV原料。實(shí)施例23-構(gòu)建在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小鼠TNFR2 Δ 7的載體為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)鼠的TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例14的鼠的 TNFR2A7cDNA PCR產(chǎn)物整合到適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，將來(lái)自實(shí)施 例14的具有和不具有終止密碼子的TNFR2 Δ 7cDNAPCR產(chǎn)物與pcDNA 3. ID V5_HisTOPO 表達(dá)載體(Irwitrogen)進(jìn)行平末端連接和分離。依照供應(yīng)商的說(shuō)明，用包含編碼鼠的 A7TNFR2的插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化〇neShot ToplO感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。將五十毫升 轉(zhuǎn)化混合物平鋪在具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過(guò)夜。將單個(gè)集落 接種到具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C溫育過(guò)夜。然后將培養(yǎng)物接種到 具有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的200mL LB培養(yǎng)基上，37°C生長(zhǎng)過(guò)夜。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用 GenElute 質(zhì)粒Maxipr印試劑盒(Plasmid Maxiprepkit) (Sigma)分離質(zhì)粒。純化效率為 每次制備0. 5-1. 5mg質(zhì)粒。產(chǎn)生兩個(gè)鼠TNFR2 Δ 7克隆(1144-4和1145-3)，并對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序?？寺?144-4 包含后面直接連接有來(lái)自質(zhì)粒的框內(nèi)His標(biāo)記的沒(méi)有終止密碼子的鼠的TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱 讀框；而克隆1145-3包含后面立刻連接有終止密碼子的TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框。SEQ ID NO :242中給出了來(lái)自質(zhì)粒的His標(biāo)記的序列。相對(duì)于SEQ ID NO 127，兩個(gè)克隆1144-4和 1145-3的TNFR2 Δ 7開(kāi)放閱讀框的序列在位置11處有一個(gè)核苷酸不同。這些單個(gè)核苷酸的 變化導(dǎo)致相對(duì)于SEQ ID NO 128出現(xiàn)了四個(gè)氨基酸不同。實(shí)施例24-在大腸桿菌中表達(dá)鼠TNFR2 Δ 7為了在細(xì)菌中表達(dá)小鼠TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例14的小鼠TNFR2 Δ 7cDNA 整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，例如pET Directional TOPO 表達(dá)載體(Invitrogen)中。利 用正向引物(TR035) (SEQ ID NO 222)和反向引物(TR036) (SEQ ID NO 223)對(duì)來(lái)自實(shí)施 例14的PCR片段進(jìn)行PCR，以引入適合載體的同源重組位點(diǎn)。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，用pETlOl/ D- TOPO 載體(Invitrogen)溫育產(chǎn)生的PCR片段以產(chǎn)生鼠的TNFR2 Δ 7細(xì)菌表達(dá)載體。 產(chǎn)生的載體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠(chǎng)家的說(shuō)明從細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)鼠 的 TNFR2A7。實(shí)施例25-在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)小鼠TNFR2 Δ 7為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)鼠的TNFR2 Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例14的cDNA整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR037) (SEQ ID NO :224)和反向引物(TR038) (SEQ ID NO 225)對(duì)來(lái)自實(shí)施例14的cDNA進(jìn)行PCR。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Xhol消化產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物。將消化的PCR產(chǎn)物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如 pENTR lA, pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4或pENTR ll載體中的任何一個(gè)的連接以產(chǎn)生輸 入載體。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用LR Clonase (Invitrogen)，通過(guò)輸入載體與 BaculoDirect 線(xiàn)性 DNA (Invitrogen)的同源重 組產(chǎn)生包含鼠的TNFR2A7cDNA的桿狀病毒載體。然后用反應(yīng)混合物感染Sf9細(xì)胞以產(chǎn)生 重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后，證實(shí)鼠的TNFR2 Δ 7被表達(dá)。重組桿狀病毒的擴(kuò) 增產(chǎn)生了高滴度的病毒庫(kù)存。用高滴度的病毒庫(kù)存感染Sf9細(xì)胞，從而表達(dá)鼠的TNFR2A7 蛋白質(zhì)。實(shí)施例26-表達(dá)鼠的TNFR2 Δ 7的腺相關(guān)病毒載體的產(chǎn)生為了在體外或體內(nèi)將鼠的TNFR2 Δ 7基因遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在所述哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1 1412 的描述利用 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生重組的腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR039) (SEQ ID NO 226)和反向引物(TR040) (SEQ IDNO 227)對(duì)實(shí)施例14的純化的鼠TNFR2D7PCR產(chǎn)物進(jìn) 行PCR，以引入側(cè)接的唯一的Notl限制性位點(diǎn)。用Notl限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn) 物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)(UNC)的載體中心實(shí)驗(yàn)室)上，以產(chǎn)生包含鼠的TNFR2D7 開(kāi)放閱讀框的質(zhì)粒，所述開(kāi)放閱讀框與CMVie啟動(dòng)子操作性連接，還側(cè)接了末端反向重復(fù)。 然后，按照Grieger，J.等的描述，用質(zhì)粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗(yàn)室)將產(chǎn) 生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中，以產(chǎn)生包含鼠的TNFR2A7基因的rAAV粒子，其中鼠的 TNFR2 Δ 7基因的表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照GriegerJ.等的描述收獲 并純化病毒粒子以提供適合轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rAAV原料。實(shí)施例27-在大腸桿菌中表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7為了在細(xì)菌中表達(dá)小鼠TNFR1A7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例15的cDNA整合到適當(dāng) 的表達(dá)載體，例如PET Directional TOPO 表達(dá)載體(Invitrogen)中。利用正向引物 (TR024) (SEQ ID NO 234)和反向引物(TR020) (SEQ IDNO 235)對(duì)來(lái)自實(shí)施例 15 的互補(bǔ)DNA 進(jìn)行PCR，以引入適合載體的同源重組位點(diǎn)。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，用ρΕΤΙΟΙ/D-TOPO 載體 (Invitrogen)溫育產(chǎn)生的PCR片段以產(chǎn)生鼠的TNFRl Δ 7細(xì)菌表達(dá)載體。產(chǎn)生的載體被轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。然后依照廠(chǎng)家的說(shuō)明從細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7。實(shí)施例28-在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小鼠TNFRl Δ 7為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例15的鼠 的TNFRlA7cDNA PCR產(chǎn)物整合到適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體中。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，將來(lái) 自實(shí)施例15的鼠的TNFRl Δ 7cDNA PCR產(chǎn)物與pcDNA 3. 1DV5-His TOPO 表達(dá)載體 (Invitrogen)進(jìn)行平末端連接。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物以產(chǎn) 生哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。然后，載體被轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，其中鼠的TNFRlA 7蛋白質(zhì)的 表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。實(shí)施例29-在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)小鼠TNFRl Δ 7為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7蛋白質(zhì)，將來(lái)自實(shí)施例15的cDNA整合到桿狀病毒載體中。利用正向引物(TR041) (SEQ ID NO :236)和反向引物(TR042) (SEQ ID NO 237)對(duì)來(lái)自實(shí)施例15的cDNA進(jìn)行PCR。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Xhol消化產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物。將消化的PCR產(chǎn)物與EcoRI和Xhol消化的pENTR 載體(Invitrogen)，例如 pENTR lA, pENTR 2B, pENTR 3C, pENTR 4 或 pENTR ll 載體中的任何一個(gè)的連接以產(chǎn)生 輸入載體。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離，擴(kuò)增和純化產(chǎn)物。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，利用 LRClonase (Invitrogen)，通過(guò)輸入載體與 BaculoDirect 線(xiàn)性 DNA(Invitrogen)的同源 重組產(chǎn)生包含鼠的TNFRl Δ 7cDNA的桿狀病毒載體。然后用反應(yīng)混合物感染Sf9細(xì)胞以產(chǎn)生 重組的桿狀病毒。收獲重組桿狀病毒以后，證實(shí)鼠的TNFRl Δ 7被表達(dá)。重組桿狀病毒的擴(kuò) 增產(chǎn)生了高滴度的病毒庫(kù)存。用高滴度的病毒庫(kù)存感染Sf9細(xì)胞，從而表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7 蛋白質(zhì)。實(shí)施例30-表達(dá)鼠的TNFRl Δ 7的腺相關(guān)病毒載體的產(chǎn)生為了在體外或體內(nèi)將鼠的TNFRl Δ 7基因遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在所述哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，按照 Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocolsl 1412 的描述利用 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)產(chǎn)生重組的腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)載體。利用正向引物(TR043) (SEQ ID NO 238)和反向引物(TR044) (SEQIDN0 239)對(duì)實(shí)施例14的純化的鼠TNFR1D7PCR產(chǎn)物進(jìn) 行PCR，以引入側(cè)接的唯一的Notl限制性位點(diǎn)。用Notl限制性?xún)?nèi)切酶消化產(chǎn)生的PCR產(chǎn) 物，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。然后，將Notl消化的片段連接到Notl消化的 pTR-UF2(美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)(UNC)的載體中心實(shí)驗(yàn)室)上，以產(chǎn)生包含鼠的TNFR1D7 開(kāi)放閱讀框的質(zhì)粒，所述開(kāi)放閱讀框與CMVie啟動(dòng)子操作性連接，還側(cè)接了末端反向重復(fù)。 然后，按照Grieger，J.等的描述，用質(zhì)粒pXX680和pHelper (UNC載體中心試驗(yàn)室)將產(chǎn) 生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中，以產(chǎn)生包含鼠的TNFR2 Δ 7基因的rAAV粒子，其中鼠的 TNFRl Δ 7基因的表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照GriegerJ.等的描述收獲 并純化病毒粒子以提供適合轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rAAV原料。實(shí)施例31-表達(dá)TNFR Δ 7的慢病毒載體的產(chǎn)生為了在體外或體內(nèi)將TNFR Δ 7基因遞送給哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中進(jìn)行表達(dá)，要產(chǎn)生不能復(fù)制的慢病毒載體。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明，將來(lái)自實(shí)施例27、30、35和 38的PCR產(chǎn)物與pLenti6/V5-D-TOPO 載體(Invitrogen)進(jìn)行平末端連接。利用標(biāo)準(zhǔn) 分子生物學(xué)技術(shù)將所產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增和純化。依照廠(chǎng)家的 說(shuō)明將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞(Invitrogen)中以產(chǎn)生包含TNFRA 7基因的慢病毒粒子， 其中TNFRA 7基因的表達(dá)由較強(qiáng)的組成型CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。按照Tiscornia，G. , et al.， 2006,Nature Protocols 1 :241的描述收獲并純化病毒粒子以提供適合轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的慢病毒原料。實(shí)施例32-在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)TNFR2 Δ 7用實(shí)施例26和34產(chǎn)生的質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物HeLa細(xì)胞中表達(dá)活性蛋白質(zhì)，并測(cè)試 所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的抗TNF-alpha活性。HeLa細(xì)胞接種在裝有包含L-谷氨酰胺、慶大霉素、 卡那霉素、5% FBS和5% HS的SMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔1. OxlO5個(gè)細(xì)胞。37°C在包 含5% C02的濕潤(rùn)空氣中讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)夜。將大約250ng質(zhì)粒DNA添加到50ml OPT I-MEM 中，然后添加 50mlLipofectamine 2000 混合物(1 份 Lipofectamine 2000 與 25 份 0PTI-MEM )并溫育20分鐘。接下來(lái)，添加400ml無(wú)血清培養(yǎng)基，并將其施用給24孔板中的細(xì)胞。37°C在包含5% C02的濕潤(rùn)空氣中溫育48小時(shí)后，收集培養(yǎng)基并將細(xì)胞收獲在SOOmL TRI-Reagent 中。依照廠(chǎng)家的說(shuō)明從細(xì)胞分離總RNA，并利用適合于人TNFR2 Δ 7的正向引 物 TR047(SEQ ID NO 200)和反向引物 TR048 (SEQ ID NO 201)或適合于小鼠 TNFR2 Δ 7 的 正向引物 TR045(SEQ ID NO 228)和反向引物 TR046 (SEQ ID NO 229)進(jìn)行 RT-PCR 分析。 通過(guò)ELISA測(cè)定培養(yǎng)基中可溶性TNFR2的濃度。在L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)中測(cè)試上述培養(yǎng)基的抗TNF-alpha活性。L929細(xì)胞接種在 裝有包含10%常規(guī)FBS、青霉素和鏈霉素的MEM培養(yǎng)基的96孔板中，每孔2xl04個(gè)細(xì)胞， 37°C在包含5% C02的濕潤(rùn)空氣中讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)夜。用來(lái)自未轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的培養(yǎng)基將培 養(yǎng)基樣品稀釋1、2、4、8和16倍。將這些樣品中的每種樣品取90 μ 1添加到10 μ 1的包含 1. Ong/ml TNF-alpha和lug/ml的放線(xiàn)菌素D的無(wú)血清培養(yǎng)基中。去除細(xì)胞的培養(yǎng)基并用 所述的100 μ 1的樣品替換培養(yǎng)基。然后，37°C在包含5% C02的濕潤(rùn)空氣中讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò) 夜。然后將 20mLCelITiter 96 AQue。usOne Solution Reagent (Promega)添加到每個(gè)孔中。 4小時(shí)以后，通過(guò)用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)量490nm的吸光度來(lái)測(cè)量細(xì)胞的生存能力。參 照未處理細(xì)胞，將細(xì)胞生存能力標(biāo)準(zhǔn)化，并以TNF拮抗劑的濃度為函數(shù)繪圖(圖17)。利用GraphPad Prism 軟件分析來(lái)自該實(shí)施例和實(shí)施例9的數(shù)據(jù)以確定3拮抗劑 的EC5tl值。對(duì) 于這些實(shí)施例的每一種拮抗劑，通過(guò)用分別被固定在100%和0%的最大和 最小反應(yīng)進(jìn)行非線(xiàn)性回歸擬合S形劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。表8顯示的EC5tl值相當(dāng)于95%的置信 水平，每個(gè)曲線(xiàn)具有從0. 7到0. 9的r2值。表8 TNF-alpha拮抗劑的活性 實(shí)施例33-哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TNFR2 Δ 7的表達(dá)和純化
實(shí)施例15和實(shí)施例中產(chǎn)生的質(zhì)粒用來(lái)從哺乳動(dòng)物HeLa細(xì)胞中表達(dá)和純化 TNFR2 Δ 7。HeLa細(xì)胞接種在6孔板中，每孔5x10s個(gè)細(xì)胞，37°C在包含5% C02的濕潤(rùn)空氣中 讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)夜。然后，利用1144-4 (具有His標(biāo)記的小鼠TNFR2 Δ 7)，1145-1 (沒(méi)有His標(biāo) 記的小鼠TNFR2 Δ 7)，1230-1 (沒(méi)有His標(biāo)記的人TNFR2 Δ 7)或1319-1 (具有His標(biāo)記的人 TNFR2 Δ 7)質(zhì)粒，用1. 5mg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染每個(gè)孔。轉(zhuǎn)染后 48小時(shí)收集培養(yǎng)基并利用Amicon MWCO 30，000過(guò)濾器濃縮大約40倍。讓細(xì)胞溶解在具有蛋白酶抑制劑(Sigma-aldrich)的 120mL RIPA溶解緩沖液(Invitrogen)，在冰上保持5分鐘。通過(guò)Bradford試驗(yàn)確定蛋白 質(zhì)濃度。從部分細(xì)胞裂解物分離蛋白質(zhì)，并通過(guò)實(shí)施例1描述的適合于TNFR2的蛋白質(zhì)印 跡分析細(xì)胞外培養(yǎng)基(圖18)。通過(guò)親和層析法從上述培養(yǎng)基純化具有His標(biāo)記的人和小鼠TNFR2D7(分別為克 隆1319-1和1144-4)。HisPur 鈷離心柱(Pierce)被用來(lái)從上述培養(yǎng)基中純化包含His 標(biāo)記的小鼠和人TNFR2A7。廠(chǎng)家推薦用50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉、IOmM咪唑緩沖液(pH 7. 4)平衡的Iml HisPur 柱可以純化大約32ml培養(yǎng)基。然后，用兩倍柱體積的相同緩沖液 沖洗柱子，用Iml 50mM的磷酸鈉、300mM氯化鈉、150mM咪唑緩沖液(pH 7.4)洗脫蛋白質(zhì)。 通過(guò)如上所述的蛋白質(zhì)印跡分析每種洗脫液5ml。TNFR2 Δ 7出現(xiàn)在洗脫液中，多個(gè)條帶代 表TNFR2D7可變的糖基化形式。經(jīng)過(guò)上述純化步驟的由不包含His標(biāo)記的質(zhì)粒1230-1或 1145-1表達(dá)的TNFR2D7蛋白質(zhì)作為陰性對(duì)照。這些蛋白質(zhì)不結(jié)合親和層析柱且不出現(xiàn)在洗 脫液中(圖19)。
權(quán)利要求
長(zhǎng)度在8和16個(gè)核堿基之間的寡聚物，包含由長(zhǎng)度為8-16個(gè)核堿基組成的毗連核堿基序列，其中所述的毗連核堿基序列與SEQ ID NO 1，SEQID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中存在的毗連核苷酸的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)，而且所述的毗連核堿基序列不包含5個(gè)或5個(gè)以上毗連的DNA(2’-脫氧核糖核苷)單體單位，其中所述毗連核堿基序列包含選自由beta-D-氧LNA、硫代-LNA、氨基-LNA和ena-LNA組成的組的至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寡聚物，其中所述寡聚物在具有互補(bǔ)mRNA分子的復(fù)合物的雙鏈體 中形成時(shí)，基本上不能補(bǔ)充RNAseH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的寡聚物，其中毗連核堿基序列由與SEQID NOl或SEQ ID NO 3的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)的核堿基序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述寡聚物由毗連核堿基序列組成，并且 其中所述毗連核堿基序列長(zhǎng)度為8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)核堿基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列的核堿基之間的連接基團(tuán) 選自由磷酸二酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯(boranophosphate)組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含或由至少一個(gè) 另外的的核苷酸類(lèi)似物(X)組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的寡聚物，其中核苷酸類(lèi)似物(X)獨(dú)立地選自由2’-0-烷基-RNA 單位、2 ‘ -OMe-RNA 單位、2 ‘ -MOE RNA 單位、2，-氨基-DNA 單位、2 ‘-氟-DNA 單位，LNA 單位、PNA單位、HNA單位和INA單位組成的組。
8 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含2’0Me核糖核苷酸 類(lèi)似物或2’ -MOE核糖核苷酸類(lèi)似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含核苷酸類(lèi)似物⑴和 核苷酸(χ)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含含有至少一個(gè)核苷 酸和至少一個(gè)核苷酸類(lèi)似物的子序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚物，其中子序列選自由Xx，XX，Xxx,xXx, xxX, XXx, XxX, χΧΧ, XXXx，XXxX，XxXX，χΧΧΧ, χχχΧ, χχΧχ, χΧχχ, Xxxx，XXXXx，XXXxX，XXxXX，XxXXX，χΧΧΧΧ, χχχχΧ, χχχΧχ, χχΧχχ, χΧχχχ, Χχχχχ組成的組，其中所述的交替序列可任意重復(fù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的寡聚物，其中重復(fù)序列在毗連核堿基序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)重復(fù)， 其中任選地5’和或3’端的重復(fù)可以截短。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列包含所述的至少一個(gè) LNA類(lèi)似物單位和至少一個(gè)另外的不同于LNA的核苷酸類(lèi)似物單位。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的寡聚物，其中毗連核堿基由至少一個(gè)X1X2X1或X2X1X2序列組成， 其中X1是LNA，X2是不同于LNA的核苷酸類(lèi)似物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的寡聚物，其中毗連核堿基由交替的X1和X2單位組成。
16.根據(jù)權(quán)利要求7-15任一項(xiàng)的寡聚物，其中另外的核苷酸類(lèi)似物單位獨(dú)立地選自由 2’ -OMe RNA單位、2’ -氟-DNA單位、2’ -MOE RNA單位和LNA單位組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求7-16任一項(xiàng)的寡聚物，其中核苷酸類(lèi)似物單位(X)是LNA單位。
18.根據(jù)權(quán)利要求7-17任一項(xiàng)的寡聚物，其中LNA單位選自由alpha-L-氧、 beta-D-氧-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA和ena-LNA組成的組。
19.根據(jù)權(quán)利要求7-18任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含由5個(gè)或5個(gè)以 上獨(dú)立地選自DNA和alpha-L LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求7-18任一項(xiàng)的寡聚物，其中毗連核堿基序列不包含由5個(gè)或5個(gè)以 上獨(dú)立地選自DNA和alpha-L-氧LNA單位的毗連核堿基組成的毗連子序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求7-20任一項(xiàng)的寡聚物，其中所有的LNA單位都是beta_D構(gòu)型。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 1 的 51-164、SEQ ID NO 2 的 51-79、SEQ ID NO 3 的 51-127 和 SEQ ID NO 4 的 51-85 ； 或者SEQ ID NO 247-SEQ ID NO 250的等價(jià)位置所組成的組之序列中存在的毗連核苷酸的 對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 1 的 1-50、SEQ ID NO 1 的 165-215、SEQ ID NO 2 的 1-50、SEQ ID NO 2 的 80-130、SEQ ID NO 3 的 1-50、SEQ ID NO 3 的 128_178、SEQ ID NO 4 的 1-50 和 SEQ ID NO 4 的 86-136; 或者SEQ ID NO 247-SEQ IDNO 250中的等價(jià)位置所組成的組之序列中存在的毗連核苷酸 的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含與5’外顯 子/內(nèi)含子3，或3，內(nèi)含子/外顯子5，邊界；或者SEQ ID N0247-SEQ ID NO 250中的等 價(jià)位置互補(bǔ)的核堿基序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的寡聚物，其中所述的5’外顯子/內(nèi)含子3’或3’內(nèi)含子/外 顯子 5，邊界選自由 SEQ ID NO 1 的核堿基 50-51、SEQ ID NO 1 的 164-165、SEQ ID NO 2 的 50-51、SEQ ID NO 2 的 79-80、SEQ ID NO 3 的 51-52、SEQ ID NO 3 的 129-139、SEQ ID NO 4 的 50-51、SEQ ID No 4 的 81-82 ；或者 SEQ ID NO 247-SEQ ID NO 250 中的等價(jià)位置 所組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 74到SEQ ID NO 105組成的組的序列中存在的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 74、 SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ IDNO 80、SEQ ID NO 82 和SEQ ID NO 84 組成的組的核堿基序列相同，或者存在于該序列中。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 85、 SEQ ID NO 86,SEQ ID NO 87,SEQ ID NO 88和SEQ IDNO 89組成的組的核堿基序列相同， 或者存在于該序列中。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列包含與選自SEQ ID No 3的核苷酸區(qū)域47-49、54-56和122-124互補(bǔ)的核堿基序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQID NO 131-SEQ ID No 145、SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161 和 SEQ ID NO 163-177 組成的組 的核堿基序列或核堿基基序相同，或者存在于該序列中。
31.根據(jù)權(quán)利要求32的寡聚物，其中所述寡聚物選自由SEQID N0245-SEQ ID NO 246,SEQ ID NO 251-263、SEQ ID NO 264-SEQ ID NO 279、SEQ ID NO 280-SEQ ID NO 295 組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的寡聚物，其中所述的毗連核堿基序列與選自由SEQIDNO 130,SEQ ID NO 146和SEQ ID NO 162組成的組的核堿基序列或核堿基基序相同，或者 存在于該序列或基序中。
33.根據(jù)權(quán)利要求1的寡聚物，其中寡聚物選自由SEQID NO 244、SEQ ID NO 264或 SEQ ID NO 280組成的組。
34.包含根據(jù)權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的寡聚物和共價(jià)附著于所述寡聚物上的至少一個(gè) 非核苷酸部分的偶聯(lián)物。
35.包含權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的寡聚物，或權(quán)利要求34的偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載 體的藥物組合物。
36.改變TNFalpha受體前-mRNA mRNA剪接的方法，其中前-mRNAmRNA選自表達(dá) TNFRSFIATNF alpha受體或TNFRSF1B TNF alpha受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的TNFRSF1A或 TNFRSFIA(B)，所述方法包括給細(xì)胞施用權(quán)利要求1_33任一項(xiàng)的寡聚物、權(quán)利要求34的偶 聯(lián)物或權(quán)利要求35的藥物組合物。
37.在表達(dá)TNFRSF1ATNF alpha受體或TNFRSF1B TNF alpha受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 制備可溶形式的所述TNF alpha受體的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用權(quán)利要求1_33 任一項(xiàng)的寡聚物、權(quán)利要求34的偶聯(lián)物或權(quán)利要求35的藥物組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，更進(jìn)一步地包括從所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離或純化可溶形 式的 TNF alpha 受體 TNFRSF1A 或 TNFRSF1B 的步驟。
39.增加表達(dá)TNFRSFIA TNF alpha受體或TNFRSF IB TNF alpha受體的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中可溶形式的所述TNF alpha受體的表達(dá)的方法，所述方法包括給所述細(xì)胞施用權(quán)利要 求1-33任一項(xiàng)的寡聚物、權(quán)利要求34的偶聯(lián)物或權(quán)利要求35的藥物組合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求36-39任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在體外或體內(nèi)實(shí)施。
41.權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的寡聚物或權(quán)利要求34的偶聯(lián)物，在制備用于治療炎性疾病 或狀態(tài)的藥物中的用途。
42.權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的寡聚物或權(quán)利要求34的偶聯(lián)物，用于治療炎性疾病或狀態(tài)。
43.治療或預(yù)防炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給患有或很可能患有所述炎性疾病的病 人施用權(quán)利要求35的藥物組合物的步驟。
44.根據(jù)權(quán)利要求44-49任一項(xiàng)的分離或純化的可溶形式的TNFalpha受體，或根據(jù)權(quán) 利要求57制備的TNF alpha受體，用于治療炎性疾病或狀態(tài)。
45.治療或預(yù)防炎性疾病或狀態(tài)的方法，包括給患有或很可能患有所述炎性疾病的病 人施用權(quán)利要求56的藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸或剪接轉(zhuǎn)換寡聚物(SSOs)。依照本發(fā)明的優(yōu)選的SSOs靶向TNFR1(TNFRSFlA)或TNFR2(TNFRSFlA)前信使RNA的外顯子7，典型地會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生分別包含部分或全部外顯子7缺失的TNFR變體。發(fā)現(xiàn)靶向外顯子7的SSOs會(huì)產(chǎn)生治療炎性疾病的具有治療用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它們基本上不能或不能補(bǔ)充RNaseH。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101889086SQ200780053595
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月1日
發(fā)明者亨里克·奧魯姆, 彼得·L·薩扎尼 申請(qǐng)人:桑塔用斯制藥公司;厄克爾生物技術(shù)股份有限公司