專利名稱：用于預(yù)防和治療肝病的包含組合草藥提取物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于肝病預(yù)防和治療需要的組合物，其包含云芝(Coriolus versicolor)、黃疾(Astragalus membranaceus Bunge)、 五味子(Schisandra chinensis) 和茵陳蒿(Artemisia capillaris)的草藥提取物，還涉及使用以上粗制藥物組合物的 方法，以及作為肝臟保護性試劑的藥物組合物。
背景技術(shù)：
在如今暴露于各種不利環(huán)境(例如污染物質(zhì)、毒性物質(zhì)如過量飲酒、吸煙等， 以及心理壓力，心理壓力可通過休息而康復(fù)，但是它可嚴重化而引起其他疾病例
如免疫系統(tǒng)失調(diào)的產(chǎn)生)的人類中肝病是最常發(fā)生的疾病之一。已有報道由于 細胞膜的損傷，毒性物質(zhì)例如四氯化碳、D-氨基半乳糖等引起肝臟和腎臟中的毒
性(Brucker， J. V" Fund. Appl. Toxicology, 6, ppl6-34， 1986)。
直至現(xiàn)在，已經(jīng)報道了幾個來自天然產(chǎn)物來源的藥物，其通過抑制自由基團 再生而發(fā)揮作用，例如，分離自乳薊(Silybum marianum)[水飛莉(Carduus marianus)] 果實的水飛薊素(silymarin， SLM)，其屬于菊科(Compositae); BDD (聯(lián)苯二甲 酸二甲酯)為分離自五味子的五味子醇甲(schizandrin)的合成類似物，等等(Camgy A. B.， Food Technology, 46， pp65-68， 1992; Liang jun, Y., et al.， Biochem. And Biophy. Res. Comm., 212 , pp360-366， 1995)。
但是，現(xiàn)在仍然有需求來發(fā)展一種用于治療和預(yù)防肝病或者改善肝臟功能的 有效且安全的藥物。
已經(jīng)報道云芝(一種蘑菇，屬于多孔菌目(Aphyllophorales)，分布于世界各 地)包含麥角固醇、(3-谷甾醇、柯里聚糖(coriolan)、云芝胞內(nèi)多糖-D-葡聚糖和 塞夫酸(thelphoric acid)且表現(xiàn)出抗細菌活性、抗炎活性、免疫增強活性、降低 膽固醇的活性等(Park Wan-Hee and Lee Ho-Deuk， Illustrated Book of Korean Medicinal Mushrooms, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd, p472, 1st Ed. 1999)。
已經(jīng)報道黃芪(其屬于豆科(Leguminosae))包含剌芒柄花素(formononetin)、 異甘草素(isoliquiritigenin)、葡萄糖醛酸、膽堿、甜菜堿、葉酸、2，,4，-二羥基-5,6-二甲氧基-異黃酮、熊竹素(Kumatakenin)等，并表現(xiàn)出強心劑作用、降血壓活性、 利尿劑活性、激素樣活性等(Chung, B. S.， et al., Illustrated Crude Drug Encyclopedia, Youngrim Publishing Co. Ltd., 2nd Ed., p662-664, 1998; http:〃www.tradimed.com)。
已經(jīng)報道五味子(其屬于木蘭科(Magnoliaceae))包含五味子醇甲、戈米辛 (gomisin) A-Q、檸檬醛、a-依蘭稀(ylangene)、檸檬酸、蘋果酸、p-花柏烯(chamigrene)、脂肪油、脫氧五味子醇甲等，并表現(xiàn)出血管舒張活性、降血壓活 性、化痰活性等(Chung, B. S.， et al., Illustrated Crude Drug Encyclopedia, Youngrim Publishing Co. Ltd., 2nd Ed" p471-473， 1998; http:〃www.tradimed.com)。
已經(jīng)報道茵陳蒿(其屬于菊科)包含濱蒿內(nèi)酯(sc叩arone)、綠原酸、咖啡酸、 蒎烯(pinene )、茵陳二炔酮(capillin)、茵陳烯塊(capillene)、茵陳炔內(nèi)脂(capillarin)、 硬脂酸、棕櫚酸等，并表現(xiàn)出降血壓活性、利尿劑活性、利膽劑活性等(Chung, B. S., et al., Illustrated Crude Drug Encyclopedia, Youngrim Publishing Co. Ltd., 2nd Ed., pl016-1018, 1998; http:〃www.tradimed.com)。
但是，在以上所列的所有文獻(此處引入作為參考)中，尚未有報道或公開 以上所述的草藥組合提取物在肝病中的治療性效應(yīng)。
因此，本發(fā)明人旨在發(fā)現(xiàn)增強肝臟保護性功效的有效的草藥制劑，并研究以 上所述的草藥組合提取物的藥理學(xué)效應(yīng)，最后本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以上所述的組合的粗 制藥物作為肝臟保護性試劑在預(yù)防和治療肝病中是有效的。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療肝病的藥物組合物，其包含 云芝、黃芪、五味子和茵陳蒿的組合草藥的提取物。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含可有效預(yù)防和治療肝病劑量的作為活 性成分的以上所述提取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供一種治療哺乳動物中肝病的方法，所述方法通過向所述哺乳動 物施用有效量的上述提取物及其藥學(xué)上可接受的載體而保護肝細胞從而治療肝 病。
本發(fā)明還提供上述提取物制備用于治療或預(yù)防人類或哺乳動物中肝病的藥物 的用途。
本發(fā)明還提供一種健康功能食品，其包含可有效預(yù)防和改善肝病劑量的作為 活性成分的上述提取物，所述提取物通過保護肝細胞而預(yù)防和改善肝病。 技術(shù)方案
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防和治療肝病的藥物組合物，其包含 可有效預(yù)防和治療肝病劑量的組合草藥作為活性成分，所述組合草藥由云芝和黃 芪組成，以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防和治療肝病的包含組合草藥的藥物組合物，其除 了包含上述的草藥外，還包含至少一種選自五味子或茵陳蒿的草藥。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述草藥提取物制備用于治療或預(yù)防人類或哺乳 動物中肝病的藥物的用途。
本發(fā)明另一個目的是提供一種治療哺乳動物中肝病的方法，所述方法通過向所述哺乳動物施用有效量的上述提取物及其藥學(xué)上可接受的載體而保護肝臟細 胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
中，此處所披露的提取物包含組合草藥的提取 物，即云芝和黃芪，其以基于每種草藥干重的比率(W/W%)混合，優(yōu)選比率介于 0.1-10:1，更優(yōu)選為0.5-5:1，再更優(yōu)選為1-2:1，在本發(fā)明中預(yù)防或治療肝病。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實施方式
中，此處所披露的提取物包含組合草藥 的提取物，即云芝、黃芪和五味子，其以基于每種草藥干重的比率(w/w%)混合， 優(yōu)選比率介于0.1-10:0.1-10:1，更優(yōu)選為0.5-5:0.5-5:1，再更優(yōu)選為1-2:1-2:1，在本 發(fā)明中以預(yù)防或治療肝病。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選具體實施方式
中，此處所披露的提取物包含組合草藥 的提取物，即云芝、黃芪、五味子和茵陳蒿，其以基于每種草藥干重的比率(W/W0/0) 混合，優(yōu)選比率介于0.1-10:0.1-10: 0.1-10:1，更優(yōu)選為0.5-5:0.5-5: 0.5-5:1 ，再更優(yōu) 選為1-2:1-2: 1-2:1，在本發(fā)明中以預(yù)防或治療肝病。
與本發(fā)明的一個方面相適應(yīng)，提供了一種健康功能食品，其包含可有效預(yù)防 和改善肝病劑量的上述提取物作為活性成分，通過保護肝臟細胞而預(yù)防和改善肝 病。
這里的"肝病"包含脂肪肝、急性或慢性肝炎、肝腫大、肝膿腫、肝硬化和 肝癌，優(yōu)選為脂肪肝、肝硬化和肝炎，更優(yōu)選為酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、 糖尿病性脂肪肝和肝炎。
可用于本發(fā)明的草藥包括對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說明顯是同屬的植物，且其已 經(jīng)用于相同或相似目的，并可被替換以預(yù)防和治療肝病。
本發(fā)明所述組合物以其研磨成粉的形式、提取形式或干燥提取物形式使用。
以上粗制藥物組合物的提取形式可使用蒸餾水、低碳醇(如甲醇、乙醇等) 或其混合物，優(yōu)選為水通過提取來獲得。
這里的術(shù)語"提取物"包括粗提取物、低碳醇不可溶性成分提取物和非極性 溶劑可溶性提取物。
這里的術(shù)語"粗提物"包括在蒸餾水、Cl-C4低碳醇(如甲醇、乙醇等)或其 混合物，優(yōu)選為乙醇和水的混合溶液，更優(yōu)選為50-90%乙醇的水溶液中可溶的提 取物。
這里的術(shù)語"低碳醇不可溶性成分提取物"包括通過以下步驟制備的提取物 以低碳醇溶液例如乙醇和水的混合溶液，優(yōu)選為50-90%乙醇的水溶液提取粗提物 以分離低碳醇可溶性成分和低碳醇不可溶性成分；并收集本發(fā)明所述低碳醇不可 溶性成分提取物。
這里的術(shù)語"非極性溶劑可溶性提取物"包括通過以下歩驟制備的提取物 以非極性溶劑例如己烷、氯仿、二氯甲垸或乙酸乙酯，優(yōu)選為己烷來提取粗提物-， 并收集本發(fā)明所述非極性溶劑可溶性提取物。在本發(fā)明最優(yōu)選的具體實施方式
中，在本發(fā)明的組合物中，組合草藥的"提 取物"由下列組成云芝的粗提物、黃芪和茵陳蒿的低碳醇不可溶性成分和五味 子的非極性溶劑可溶性提取物；但不是為了限制本發(fā)明。
用于治療肝病的藥物組合物可含有基于組合物總重量的大約0.01至95 w/w%， 優(yōu)選為0.5至80 w/w。/。的上述的本發(fā)明所述草藥組合物。
可通過以下優(yōu)選的具體實施方式
來制備本發(fā)明草藥組合物。
對于本發(fā)明，上述粗制藥物組合物可通過以下程序來制備將草藥，即云芝、 黃芪、五味子和茵陳蒿洗滌、破碎、干燥并以合適的比率(w/w)混合。將上述
混合物研磨成粉以獲得粗制藥物組合物的研磨成粉的形式。
將上述研磨成粉的粗制藥物組合物與5-20倍，優(yōu)選為10-15倍體積的蒸餾水、 醇(例如甲醇、乙醇等)或其混合物混合，優(yōu)選為與蒸餾水或者是乙醇和水的混 合物混合；然后，在0至室溫，優(yōu)選為4-6。C的溫度范圍內(nèi)冷吸(enfleurage)，持 續(xù)12至48小時，優(yōu)選為20-24小時，或者，在80至12(TC，優(yōu)選為IO(TC以上的 溫度范圍內(nèi)回流提取加熱，持續(xù)l-24小時，優(yōu)選為2-5小時，進行2-5次；或者， 通過超聲、回流或常規(guī)提取以獲得水性提取物形式的粗制藥物組合物。
另外，過濾并在80-9(TC減壓下將草藥提取物濃縮。提取物以10-60倍體積的 水通過共沸蒸餾1-5次，然后通過凍干或真空干燥進行干燥以獲得粗制藥物組合物 的干燥粗提物。
各個草藥的"低碳醇不可溶性成分提取物"可通過以下步驟制備將上述步 驟制備的粗提物通過低碳醇溶液(例如乙醇和水的混合物溶液，更優(yōu)選為50-卯％ 的乙醇的水溶液)提取，其用量為基于粗提物重量的l-8倍；單獨置于室溫下持續(xù) 12-48小時，優(yōu)選為18-24小時，以分離低碳醇可溶性成分和低碳醇不可溶性成分； 并收集本發(fā)明所述低碳醇不可溶性成分提取物。
各個草藥的"非極性溶劑可溶性提取物"可通過以下步驟制備將上述歩驟
制備的粗提物通過非極性溶劑分離，用量為基于粗提物體積的l-8倍，優(yōu)選為2-5 倍；并收集本發(fā)明所述非極性溶劑可溶性提取物。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備上述本發(fā)明所述提取物的方法以制備用于預(yù) 防或治療肝病的有效的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預(yù)防和治療肝病的藥物組合物，其包含 通過上述方法獲得的研磨成粉形式的、提取形式的或干燥提取物形式的上述粗制 藥物提取物作為活性成分。
通過上述方法制備的本發(fā)明所述組合物在大鼠實驗?zāi)Ｐ椭酗@著性抑制肝臟組 織中的GOT、 GPT、 LDL-膽固醇、HMG-CoA還原酶基因的表達水平及肝纖維化， 以及增加血液中HDL-膽固醇的水平。當(dāng)測定提取物的口服急性毒性時，沒有發(fā)現(xiàn) 其對于死亡率、臨床表征、體重變化、和尸檢中總的發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)。
用于治療肝病的藥物組合物可含有基于組合物總重量的大約0.01至95w/wn/。，優(yōu)選為0.5至80 w/w。/。的上述的本發(fā)明的粗制藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種肝臟保護性試劑，其包含可有效預(yù)防和治療 肝病劑量的上述提取物作為活性成分。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療哺乳動物中肝病的方法，所述方法為所 述哺乳動物施用有效量的上述提取物及其藥學(xué)上可接受的載體。
與使用方法相一致，本發(fā)明的組合物還可包含常規(guī)載體、佐劑或稀釋劑。優(yōu) 選地，根據(jù)用量和使用方法，所述載體用作合適的物質(zhì)，但不是限制性的。合適 的稀釋齊U歹!J在Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing co, Eastern PA) 中的記載內(nèi)容中。
以下，下面的制劑方法和賦形劑只是示例性的而絕不是限制本發(fā)明。 本發(fā)明所述粗制藥物組合物可作為藥物組合物來提供，所述藥物組合物包含 藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如，乳糖、葡糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠、澡酸鹽、白明膠、磷酸 鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥苯甲酯、羥苯丙酯、 云母、硬脂酸鎂和礦物油。制劑可另外包含填充劑、抗凝集劑、潤滑劑、加濕劑、 香味劑、乳化劑、防腐劑等。通過使用本領(lǐng)域熟知的任何程序，本發(fā)明所述組合 物可制成制劑以在向病人使用以后提供活性成分的速釋、緩釋或延釋。
例如，本發(fā)明所述組合物可溶于油、丙二醇或其他溶劑中，這些溶劑通常被
用于生產(chǎn)注射液。合適的載體的例子包括生理鹽水、聚乙二醇、乙醇、植物油、 豆蔻酸異丙酯等，但不限于這些。對于局部使用，本發(fā)明所述化合物可制成藥膏 或乳劑。
含有粗制藥物組合物的藥物制劑可以任何形式制備，例如口服劑形式(粉末、
藥片、膠囊、軟膠囊、水性藥品、糖漿、西也劑、藥丸、粉末、香袋(sachet)、 顆粒)或局部制備物(乳劑、藥膏、洗液、凝膠、香膏(balm)、貼布(patch)、 軟膏(paste)、噴霧溶液、氣霧劑等)、栓劑或無菌注射制劑(溶液、懸浮液、乳 狀液)。
本發(fā)明所述粗制藥物組合物的藥物劑型可以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式來提 供，可單獨使用或以合適的聯(lián)合使用，以及與其他藥學(xué)活性化合物組合使用。本 發(fā)明組合物的所需劑量是可變的，取決于個體的狀況和體重、嚴重性、藥物形式、 施藥途徑和時間，且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來選擇。但是，為了獲得所需的效應(yīng)， 通常推薦以每日0.01-10g/kg重量，優(yōu)選為l-5g/kg重量的劑量來施用本發(fā)明所述 組合物。劑量可以每日單劑或多劑來使用。至于組合物，粗制藥物組合物應(yīng)以基 于組合物總重量的0.01-80%重量，優(yōu)選0.5-50%重量來呈現(xiàn)。
本發(fā)明所述藥物組合物可通過各種途徑向動物個體使用，例如哺乳動物(大 鼠、小鼠、家養(yǎng)動物或人類)?？紤]了所用的施用模式，例如，口服、直腸或靜脈 內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、輸卵管內(nèi)、硬腦膜或側(cè)腦室注射。與本發(fā)明的一個方面相一致，提供了一種健康功能食品，其包含可有效預(yù)防 和改善肝病劑量的上述提取物作為活性成分，通過保護肝臟細胞而預(yù)防和改善肝 病。
本發(fā)明的健康功能食品的粗制藥物組合物以其研磨成粉的形式、提取形式或 干燥提取物形式使用。
用于預(yù)防和改善肝病的本發(fā)明的健康功能食品可含有基于組合物總重量的大 約0.01-95w/w%，優(yōu)選0.5-80w/w。/。的上述本發(fā)明的粗制藥物組合物。
上述粗制藥物組合物可添加于食物、添加劑或飲料以預(yù)防和改善肝病。其中， 為了預(yù)防和改善肝病的目的，食物或飲料中的上述粗制藥物組合物的劑量為用于 健康食物組合物的食物總重量的大約0.1-15 w/w%，優(yōu)選為l-10w/w%， 100 ml健 康飲料組合物中為1-30 g，優(yōu)選為3-10 g。
鑒于本發(fā)明的健康飲料組合物含有表示比率的上述粗制藥物組合物作為主要
成分，所以對其他液體成分沒有特別限制，其中其他成分可以是各種除臭的或天 然的碳水化合物等例如常規(guī)飲料。上述天然碳水化合物的例子為單糖例如葡萄糖、
果糖等；二糖例如麥芽糖、蔗糖等；常規(guī)糖如糊精、環(huán)狀糊精；和糖醇例如木糖 醇和赤藻糖醇等。作為除了上述的以外的除臭劑，可有益地使用天然除臭劑例如
陶馬汀(taumatin)、甜菊提取物例如萊沃迪賽A (levaudiosideA)、甘草甜素等， 以及合成的除臭劑例如糖精、天門冬氨酰苯丙氨酸甲酯等。上述天然碳水化合物 的劑量通常為100 ml本飲料組合物中為約1-20 g，優(yōu)選為5-12 g。
出了上述組合物以外的其他成分為各種營養(yǎng)物、維生素、礦物或電解液、合 成的香味劑、著色劑和精煉劑(如果是奶酪巧克力等)、果膠酸及其鹽、褐藻算及 其鹽、有機酸、保護性膠質(zhì)吸附劑、pH控制劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇、碳 酸飲料等中所用的碳化劑。除了上述以外的成分可以是用于制備天然果汁的果汁、 果汁飲料和蔬菜飲料，其中成分可單獨使用或組合使用。成分的比率不是那么重 要，但通常為大約0-20w/wy。每100 w/wy。的本組合物。
可添加的含有上述粗制藥物組合物的食物的例子為各種食物、飲料、口香糖、 維生素復(fù)合物、健康改善食品等。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可對本發(fā)明的組合物、用途和制備物作出各種修飾 和改變而不脫離本發(fā)明的實質(zhì)。
有益效果
本發(fā)明所述組合草藥組合物對于升高的GOT、 GPT、膽固醇、甘油三酯、LDL-膽固醇水平顯示出有力的抑制效應(yīng)，以及對降低的HDL-膽固醇水平顯示出增加的 效應(yīng)，以及預(yù)防和治療肝硬化和脂肪肝。
本發(fā)明所述組合物在預(yù)防和治療肝病中是有用的，可用作安全且有效的肝臟 保護性試劑。


通過以下具體描述以及附圖將更清楚的理解本發(fā)明的以上和其他目的、特點 和其他優(yōu)點，其中
圖l顯示了CCL4誘導(dǎo)小鼠中比較實施例l中制備的各種提取物處理組的GOT 水平的變化。
圖2顯示了 CCL4誘導(dǎo)小鼠中比較實施例1中制備的各個提取物處理組的GPT 水平的變化。
圖3顯示了 CCL4誘導(dǎo)的肝臟損傷預(yù)防模型中實施例1中制備的組合提取物 處理組的GOT水平的變化效應(yīng)。
圖4顯示了 CCL4誘導(dǎo)的肝臟損傷預(yù)防模型中實施例1中制備的組合提取物 處理組的GPT水平的變化效應(yīng)。
圖5顯示了 CCL4誘導(dǎo)的肝臟損傷治療模型中實施例1中制備的組合提取物 處理組的GOT水平的變化效應(yīng)。
圖6顯示了 CCL4誘導(dǎo)的肝臟損傷治療模型中實施例1中制備的組合提取物 處理組的GPT水平的變化效應(yīng)。
圖7顯示了 DMN誘導(dǎo)的肝硬化模型中GOT和GPT的水平的變化。
圖8顯示了對DMN誘導(dǎo)的肝硬化模型中膠原分布的效應(yīng)。
圖9顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的各個 提取物處理組的GOT和GPT水平的變化。
圖10顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中以比較實施例2和實施例2所制備的各 個提取物處理組的血液膽固醇水平的變化。
圖11顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的提取 物對于血液甘油三酯的變化的效應(yīng)。
圖12顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的提取 物對于血液HDL-膽固醇變化的效應(yīng)。
圖13顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的提取 物對于血液LDL-膽固醇變化的效應(yīng)。
圖14顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的提取 物對于肝膽固醇水平變化的效應(yīng)。
圖15顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中比較實施例2和實施例2所制備的提取 物對于肝甘油三酯水平變化的效應(yīng)。
圖16顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中實施例2所制備的提取物對于肝組織形 態(tài)學(xué)變化的效應(yīng)。
圖17顯示了酒精誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝中實施例2所制備的提取物對于 HMG-CoA還原酶基因表達變化的效應(yīng)。
具體實施例方式
最佳實施方式
以下實施例和實驗例是為了進一步說明本發(fā)明而不是限制其范圍。 發(fā)明模式
比較實施例l各個草藥提取物(1)的制備 1-1.云芝粗提物1 (CV30E)的制備
將購買自首爾Kyung-dong market的500 g云芝洗滌，加入10 L蒸餾水。在第 一歩中，將溶液在10(TC以蒸餾水回流提取兩次。將第一步獲得的提取物過濾并在 105。C濃縮以制備800 ml濃縮物。將濃縮物在60。C干燥以獲得62.0 g的云芝干燥 粗提物(產(chǎn)率12.4%)。
1-2.黃芪粗提物(AM80M)
將購買自首爾Kyung-dong market的800 g黃芪洗滌，加入10 L 70%的乙醇溶 液。在第一步中，將溶液在10(TC以蒸餾水回流提取兩次。將第一步獲得的提取物 過濾并在105'C濃縮以制備750 ml濃縮物。將濃縮物在6(TC干燥以獲得153.6 g的 黃芪干燥粗提物(產(chǎn)率19.2%)。
1-3.五味子粗提物(SC80M)
將購買自首爾Kyung-dong market的500 g五味子洗滌，加入10 L 70%的乙醇 溶液。在第一歩中，將溶液在10(TC以蒸餾水回流提取兩次。將第一歩獲得的提取 物過濾并在105。C濃縮以制備卯0ml濃縮物。將濃縮物在60。C干燥以獲得183.0 g 的五味子干燥粗提物(產(chǎn)率36.6%)。
1- 4.茵陳蒿粗提物(ACDW)
將購買自首爾Kyung-dong market的500 g茵陳蒿洗滌，加入10 L蒸餾水。在 第一歩中，將溶液在10(TC以蒸餾水回流提取兩次。將第一步獲得的提取物過濾并 在105。C濃縮以制備650ml濃縮物。將濃縮物在6CTC干燥以獲得91.5 g的茵陳蒿 干燥粗提物(產(chǎn)率18.3%)。
比較實施例2.各個草藥提取物的制備(2)
2- 1.云芝低碳醇不可溶提取物(CO)
將購買自首爾Kyung-dong market的1000 g云芝洗滌，加入10 L蒸餾水。在 第一步中，將溶液在10(TC以蒸餾水回流提取兩次，持續(xù)2個小時。將第一步獲得 的提取物過濾并在105'C濃縮以制備1000ml濃縮物。通過向濃縮物中加入95%的 乙醇而制成70%的乙醇溶液，將此70%的乙醇溶液單獨置于室溫下12小時以分離 上清層和沉淀層，將沉淀在60。C干燥以獲得31.5 g的云芝的干燥的低碳醇不可溶 提取物(產(chǎn)率3.15%，以下稱為CO)。
2-2.黃芪粗提物(AS)
將購買自首爾Kyung-dong market的1000 g黃芪洗滌，加入10 L 95%的乙醇 溶液。在第一步中，將溶液在95'C以蒸餾水回流提取兩次，持續(xù)2小時。將第一步獲得的提取物過濾并在105。C濃縮3小時以制備1000 ml濃縮物。將濃縮物在60 'C干燥以獲得80.3g的黃芪干燥粗提物(產(chǎn)率8.03%，以下稱為AS)。 2-3.五味子非極性溶劑可溶性提取物(AR)
將購買自首爾Kyung-dong market的1000 g五味子洗滌，加入10 L 95%的乙 醇溶液。在第一步中，將溶液在95"C以蒸餾水回流提取兩次，持續(xù)2個小時。將 第一歩獲得的提取物過濾并在105t:濃縮以制備1000ml濃縮物。加入等量的己垸 以分離水層和己垸可溶性層，收集己烷可溶性層以獲得五味子的己烷可溶性提取 物(產(chǎn)率1.21%，以下稱為AR)。 —
2-4.茵陳蒿低碳醇不可溶提取物(SC)
將購買自首爾Kyung-dong market的1000 g茵陳蒿洗滌，加入10 L蒸餾水。 在第一歩中，將溶液在IO(TC以蒸餾水回流提取兩次，持續(xù)2個小時。將第一歩獲 得的提取物過濾并在105'C濃縮以制備1000ml濃縮物。通過向濃縮物中加入95% 的乙醇而制成70%的乙醇溶液，將此70%的乙醇溶液單獨置于室溫下12小時以分 離上清層和沉淀層，將沉淀在6(TC干燥以獲得119.7 g的茵陳蒿的干燥的低碳醇不 可溶提取物(產(chǎn)率11.97%，以下稱為SC)。
實施例l.發(fā)明性組合制劑(1)的制備
l-l.發(fā)明性Hl的制備
將比較實施例1中所制備的每個云芝和黃芪的提取物以1:1的重量比率混合以 制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為H1)。 1-2.發(fā)明性H2的制備
將比較實施例1中所制備的每個云芝、黃芪和五味子的提取物以1:1:1的重量 比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為H2)。 1-3.發(fā)明性H3的制備
將比較實施例1中所制備的每個云芝、黃萬和茵陳蒿的提取物以1:1:1的重量 比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為H3)。
1- 4.發(fā)明性H4的制備
將比較實施例1中所制備的每個云芝、黃芪、五味子和茵陳蒿的提取物以 1:1:1:1的重量比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為H4)。 實施例2.發(fā)明性組合制劑(2)的制備
2- l.發(fā)明性HFl的制備
將比較實施例2中所制備的每個云芝和黃芪的提取物以1:1的重量比率混合以 制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為HF-1)。 2-2.發(fā)明性HF2的制備
將比較實施例2中所制備的每個云芝、黃芪和五味子的提取物以1:1:1的重量 比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為HF2)。 2-3.發(fā)明性HF3的制備將比較實施例2中所制備的每個云芝、黃芪和茵陳蒿的提取物以1:1:1的重量 比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為HF3)。 2-4.發(fā)明性HF4的制備
將比較實施例2中所制備的每個云芝、黃芪、五味子和茵陳蒿的提取物以 1:1:1:1的重量比率混合以制備發(fā)明性組合制劑(以下稱為HF4)。
實驗例l.對大鼠模型中CC14誘導(dǎo)的慢性肝損傷的效應(yīng)
為了研究實施例1中獲得的發(fā)明性組合提取物(與比較實施例1中的相比) 對于肝損傷的抑制效應(yīng)，進行了下列實驗。 '
l-l.試劑和實驗動物
CC14 (Sigma Co.)、橄欖油(Sigma Co.)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT、 GPT， StanbioCo.)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST、 GOT， ， StanbioCo.)購買自商業(yè)公 司，以用于實驗。
實驗中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(體重大約200g) (Daehan Biolink Co. Ltd., Korea),將其置于可自由獲取飼料(Harlan， teklan， USA)和飲水。所有的 動物保持在受控環(huán)境中，溫度為21。C-24。C，濕度為60%-80%， 12小時光照-12小 時黑暗循環(huán)，在使用前至少持續(xù)1個星期。每組的平均重量根據(jù)每組進行優(yōu)化， 每組有10只。
1-2.各個草藥對CC14誘導(dǎo)的慢性肝損傷的效應(yīng)
為了評估對于肝損傷的效應(yīng)，正常組只以鹽水處理。將橄欖油和CC14的混合 物溶液(1:3)通過腹膜內(nèi)注射入每只實驗大鼠，劑量為1.0ml/kg，持續(xù)3天，以 此來誘導(dǎo)急性肝中毒以用作對照組。誘導(dǎo)后1個小時，將各種濃度的比較實施例1 中的提取物補充鹽水后通過口服向大鼠使用，劑量為1.0 ml/kg，持續(xù)三天，這是 測試組；對于陰性對照組，只以等量的鹽水處理。誘導(dǎo)后18小時，從眼眶下靜脈 收集血液樣品，3000rpm下離心20分鐘。使用BT2000+裝置(SEACCo.)測定每 個樣品的每個GOT和GPT水平。
如圖1和2所示，只以鹽水溶液處理的正常組顯示出大約200U/I的GOT水平 和74U/I的GPT水平，而以橄欖油和CC14混合溶液(1:1)處理的對照組顯示出 大約461 U/I的GOT水平和168 U/I的GPT水平。但是，以每個草藥提取物處理 的測試組顯示出肝臟保護性活性，其順序為云芝，五味子，黃芪和茵陳蒿(見圖1 和2)。
因此確認本發(fā)明的發(fā)明性提取物對于緩和肝臟功能是有效的。
l-3.組合制劑對于CC14誘導(dǎo)的慢性肝損傷的效應(yīng)
為了評估對于肝損傷的效應(yīng)，正常組只以鹽水處理。將橄欖油和CC14的混合 物溶液(1:1)通過腹膜內(nèi)注射入每只實驗大鼠，劑量為1.0ml/kg，持續(xù)3天，以 此來誘導(dǎo)急性肝中毒以用作對照組。誘導(dǎo)后1個小時，將各種濃度的實施例1中 的發(fā)明性組合提取物，即H1、 H2、 H3和H4補充鹽水后通過口服向大鼠使用，劑量為lg/60kg，持續(xù)三天，這是測試組；對于陰性對照組，只以等量的鹽水處理。
誘導(dǎo)后18小時，從眼眶下靜脈收集血液樣品，3000 rpm下離心20分鐘。使用 BT2000+裝置(SEAC Co.)測定每個樣品的每個GOT和GPT水平。
如圖3和4所示，以橄欖油和CC14混合溶液(1:1)處理的對照組顯示出大約 462 U/I的GOT水平和186 U/I的GPT水平。但是，以HI處理的測試組顯示出大 約355U/I的GOT水平和142.1U/I的GPT水平。H2處理組中GOT和GPT的水平 與H3處理組中相似，相對于H1處理組顯示出更強的肝臟保護性活性。但是，H4 處理組在他們中顯示出最強的肝臟保護性活性(見圖3和4)。
因此確認本發(fā)明的發(fā)明性組合提取物對于治療和預(yù)防肝病是有效的。
1- 4.組合制劑對于CC14誘導(dǎo)的慢性肝損傷的效應(yīng)
為了評估對于肝損傷的效應(yīng)，正常組只以鹽水處理4天。將橄欖油和CC14的 混合物溶液(1:1)通過腹膜內(nèi)注射入每只實驗大鼠，劑量為1.0ml/kg，持續(xù)3天， 以此來誘導(dǎo)急性肝中毒以用作對照組。誘導(dǎo)后1個小時，將各種濃度的實施例1 中的發(fā)明性組合提取物，即H1、 H2、 H3和H4補充鹽水后通過口服向大鼠使用， 劑量為1 g/60kg，持續(xù)四天，這是測試組；對于陰性對照組，只以等量的鹽水處理。 在測試的最后一天，從麻醉的實驗動物中收集1.5 ml血液，并通過重灌注固定， 3000 rpm下離心20分鐘。使用CH100+裝置(SEAC Co.)測定每個樣品的每個 GOT禾卩GPT7jC平。
如圖5和6所示，以橄欖油和CC14混合溶液(1:1)處理的對照組顯示出大約 488 U/I的GOT水平和201.4 U/I的GPT水平。但是，以H1、 H2和H3處理的測 試組分別顯示出大約347.6、 304.1、 107.9 U/I的GOT水平禾口 136.4、 99.2、 97.3 U/I 的GPT水平。H4處理組中GOT和GPT的水平與H2和H3處理組中相似，比H2 和H3處理組顯示出相當(dāng)強的處理活性(見圖5和6)。
實驗例2.對大鼠模型中膠原分布和GOT和GPT水平的抑制的效應(yīng) 為了研究實施例1中獲得的發(fā)明性組合提取物的改善性效應(yīng)，進行了下列實驗。
2- l.試劑和實驗動物
DMN (二甲基亞硝胺，SigmaCo.)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT、 GPT， Stanbio Co.)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST、 GOT, Stanbio Co.)購買自商業(yè)公司，以 用于實驗。
實驗中使用Wister大鼠(體重大約270g)，將其置于可自由獲取飼料(Harlan， teklan， USA)和飲水。所有的動物保持在受控環(huán)境中，溫度為2rC-24。C，濕度 為60%-80%， 12小時光照-12小時黑暗循環(huán)，在使用前至少持續(xù)1個星期。
2-2.對膠原分布和GOT和GPT水平的抑制的效應(yīng)
為了評估對于肝硬化的效應(yīng)，將1%的DMN (二甲基亞硝胺)通過腹膜內(nèi)注 射入每只實驗大鼠，劑量為40 mg/kg/天，持續(xù)3天，以此來誘導(dǎo)肝硬化。將實施例1中制備的發(fā)明性組合提取物懸浮于鹽水溶液，通過口服向大鼠使用，劑量為 lg/60kg，持續(xù)兩周，這是測試組；對于陰性對照組，只以等量的鹽水處理。在測
試的最后一天，從麻醉的實驗動物中收集1.5ml血液，并通過重灌注固定，3000rpm 下離心20分鐘。使用CH100+裝置(SEAC Co.)測定每個樣品的每個GOT和GPT 水平。
為了測定肝組織中膠原的分布，使用Masson三色染色方法，其只染膠原部分； 將分離的肝組織嵌入自動組織分析儀(Citadel 2000, ShandonCo.)，使用組織切片 機(LEICARM2145)切成4微米寬度的片。每個組織選取5個損傷，通過成像分 析系統(tǒng)確定該損傷的纖維化比率。計算平均的比率值并轉(zhuǎn)化為膠原量。
如圖7所示，以實施例1中獲得的發(fā)明性提取物處理的組顯著性抑制肝損傷 大鼠模型中GOT和GPT水平。H2和H3處理組比Hl處理組顯示出更強的抑制活 性，H4處理組在測試組中顯示出最強的活性(顯著性pO.OOOl，見圖7)。
而且，以實施例1中獲得的發(fā)明性提取物H1、 H2、 H3和H4處理的組中的膠 原量分別為1.83、 1.5、 1.33禾n 1.66，而對照組和正常組分別為2.44和1.33 (見圖 8)。
因此確認本發(fā)明的發(fā)明性組合提取物對于肝纖維化進程是顯著有效的。 實驗例3.對于大鼠模型中酒精誘導(dǎo)的脂肪肝的效應(yīng)
為了研究實施例2中獲得的發(fā)明性組合提取物對于脂肪肝的抑制效應(yīng)(與比 較實施例2中相比)，進行了下列實驗。 3-l.實驗動物和預(yù)處理
實驗中使用雄性Sprague-Dawley大鼠(體重大約200g) (Samtaco Co. Ltd., Korea),將其置于可自由獲取飼料和飲水。所有的動物保持在受控環(huán)境中，溫度 為22士2。C，濕度為60±5%， 12小時光照-12小時黑暗循環(huán)，在使用前至少持續(xù)l 個星期。每組的平均重量根據(jù)每組進行優(yōu)化，每組有10只。
3-2.預(yù)處理
為了誘導(dǎo)脂肪肝，將動物飼料(AIN76，含有1%的膽固醇，F(xiàn)eedlabCo.Ltd.) 通過口服向?qū)嶒灤笫笫┯?1天。另外，從詞養(yǎng)第8天開始，通過口服向?qū)嶒灤笫?施用35%酒精，以用作對照組；從詞養(yǎng)第10天開始，將比較實施例2和實施例2 中所制備的提取物通過口服向?qū)嶒灤笫笫┯?，劑量?0mg/kg。 口服施用21天后， 用乙醚麻醉實驗動物以用于以下實驗。
3-3.對脂肪肝中GOT和GPT的效應(yīng)
為了測定實施例2中所制備的發(fā)明性組合提取物對于脂肪肝中血液GOT和 GPT濃度變化的效應(yīng)，按照文獻(Bergmeyer HU， Scheibe P， Wahlefeld AW : optimization of methods for asparate aminotransferase and alanine aminotransferase. Clin Chem 24:58,1978)中的程序進行了以下測試。
在進行了 3-2中類似的步驟以后，收集麻醉的實驗動物的血液。4550xg下離心20分鐘。使用BT2000+裝置(SEAC Co.)測定血清中的每個GOT和GPT水平。 如圖9所示，以比較實施例2中制備的各個草藥處理的測試組不能顯著降低 1%膽固醇和35%酒精誘導(dǎo)的升高的GOT和GPT水平；然而，以實施例2中制備 的組合草藥處理的測試組顯著降低了 GOT和GPT的水平，其中，在酒精誘導(dǎo)的 脂肪肝模型中，HF4處理組顯示出對于升高的GOT和GPT水平最強的降低效應(yīng) (GOT: 131.2mg/dl， GPT: 89.6mg/dl)(見圖9)。 3-4.對脂肪肝中血脂濃度的效應(yīng)
為了測定對于脂肪肝中血脂濃度變化的效應(yīng)，按照文獻(Trinder, P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. Ann Clin Bio Chem. 6; 24-27, 1969)中的程序進行了以下測試。
在進行了 3-2中類似的歩驟以后，收集麻醉的實驗動物的血液。4550 xg下離 心20分鐘。使用BT2000+裝置(SEAC Co.)測定血清中的每個膽固醇、甘油三酯、 HDL禾卩LDL的tK平。
膽固醇水平的結(jié)果
如圖10所示，與未處理的正常組(65.6mg/dl)相比，以1%膽固醇和35%酒 精處理的對照組的血液膽固醇水平增加至2倍(158.1 mg/dl);然而，以比較實施 例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于升高的膽固醇水平顯示出顯著降低 效應(yīng)，其中，在酒精誘導(dǎo)的脂肪肝模型中，HF3處理組(91.5 mg/dl)和HF4處理 組(88.2mg/dl)顯示出對于升高的血液膽固醇水平最強的降低效應(yīng)(見圖IO)。
甘油三酯水平的結(jié)果
如圖11所示，與未處理的正常組(63.6 mg/dl)相比，以1%膽固醇和35%酒 精處理的對照組的血液甘油三酯水平增加至3倍(173.2 mg/dl);然而，以比較實 施例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于升高的甘油三酯水平顯示出顯著 降低效應(yīng)，其中，在酒精誘導(dǎo)的脂肪肝模型中，HFl處理組(120.2 mg/dl)顯示出 對于升高的血液甘油三酯水平最強的降低效應(yīng)(見圖11)。
HDL-膽固醇和LDL-膽固醇水平的結(jié)果
如圖12所示，與未處理的正常組(53.8 mg/dl)相比，以1%膽固醇和35%酒 精處理的對照組顯示出降低的血液HDL-膽固醇水平(55.4 mg/dl);然而，以比較 實施例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于降低的HDL水平顯示出顯著升 高效應(yīng)(見圖12)。
如圖13所示，與未處理的正常組(53.2 mg/dl)相比，以1%膽固醇和35%酒 精處理的對照組的血液LDL-膽固醇水平增加至3倍(168.7mg/dl);然而，以比較 實施例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于升高的LDL水平顯示出顯著降 低效應(yīng)，與圖10中的結(jié)果相似；其中，在酒精誘導(dǎo)的脂肪肝模型中，HF4處理組 (114.8 mg/dl)顯示出對于升高的血液LDL水平最強的降低效應(yīng)(見圖13)。
從以上描述的結(jié)果確定比較實施例2和實施例2中制備的提取物對于升高的膽固醇、甘油三酯、LDL-膽固醇顯示出有力的降低效應(yīng)；對降低的HDL-膽固醇 顯示出升高效應(yīng)，結(jié)果為抑制血清中脂肪的堆積。 實驗例4.肝臟中脂肪含量變化的確定
為了研究實施例2中獲得的發(fā)明性組合提取物對于脂肪肝中脂肪含量的抑制 效應(yīng)(與比較實施例2中相比)，按照文獻(Zlatkis， A and Zak, B. Study of a new cholesterol reagent. Anal, biochem, 29, 143-148, 1969)中的程序進行了以下測試。
在進行了3-2中類似的步驟以后，從實驗大鼠傳送肝臟，將2ml的鹽水溶液 加入1 g的肝切片。將組織以勻漿器研磨，加入3 ml的CM混合物(氯仿:甲醇=2:1 )。 重復(fù)上述步驟3次，在3000rpm的速度下離心懸浮液10分鐘。除去氯仿層，以氮 氣除去溶劑。加入含有氯仿的Triton X-100以防止液體惡臭，以氮氣除掉剩余的氯 仿。使用BT2000+裝置(SEACCo.)測定血清中的總膽固醇和甘油三酯。
總膽固醇水平的結(jié)果
如圖14所示，與未處理的正常組(139.75 mg/dl)相比，以1%膽固醇和35% 酒精處理的對照組的血液總膽固醇水平增加至2倍(308.43 mg/dl);然而，以比較 實施例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于升高的總膽固醇水平顯示出顯 著降低效應(yīng)，其中，HF2、 HF3和HF4處理組(HF2: 189.87 mg/dl; HF3: 185.54 mg/dl; HF4: 169.85 mg/dl)顯示出對于升高的總膽固醇水平有力的降低效應(yīng)(見 圖14)。
總甘油三酯水平的結(jié)果
如圖15所示，與未處理的正常組(63.6mg/dl)相比，以1%膽固醇和35%酒 精處理的對照組的血液總甘油三酯水平增加2倍以上(173.2mg/dl);然而，以比 較實施例2和實施例2中制備的提取物處理的組對于升高的總甘油三酯水平顯示 出顯著降低效應(yīng)，與圖14中的結(jié)果相似；其中，HF2、 HF3和HF4處理組(HF2: 165.5 mg/dl; HF3: 158.1 mg/dl; HF4: 143.0 mg/dl)顯示出對于升高的血液甘油 三酯水平有力的降低效應(yīng)(見圖15)。
因此確定比較實施例2和實施例2中制備的提取物對于升高的血液膽固醇 和甘油三酯顯示出有力的降低效應(yīng)。
實驗例5.肝臟組織變化的確定
為了研究實施例2中獲得的發(fā)明性組合提取物(HF2、 HF3和HF4)對于肝臟 組織形態(tài)學(xué)變化的效應(yīng)(與比較實施例2中相比)，按照文獻(Hematoxylin and Eosin (H&E) staining, http:〃www.protocol-online.org)中的程序進行了以下實驗。
在進行了 3-2中類似的歩驟以后，從實驗大鼠傳送肝臟，將肝臟組織以10% 福爾馬林固定，通過H&E方法染色(Hematoxylin and Eosin staining, http:〃www.protocol陽online.org)。
肝臟形態(tài)學(xué)變化的結(jié)果
如圖16所示，與未處理的正常組相比，以1%膽固醇和35%酒精處理的對照組顯示出數(shù)目增多的脂肪滴(臨近血管)以及干細胞形狀的不正常的形態(tài)學(xué)；然 而就脂肪滴數(shù)目和肝臟組織的大致排列來說，HF4處理組與正常組類似(見圖16)。
因此確定以HF2、 HF3和HF4特別是HF4處理的組對于酒精性脂肪肝引起 的肝臟組織形態(tài)學(xué)變化顯示出有力的抑制效應(yīng)。
實驗例6.HMG-HMG-CoA基因表達的變化
有報道指出HMG-CoA (3-羥基-甲基戊二酰-輔酶A)還原酶在調(diào)節(jié)膽固醇的 合成和解離途徑中具有重要作用；酶的數(shù)目由于攝入酒精而升高，導(dǎo)致升高的膽 固醇合成。因此，為了研究實施例2中獲得的發(fā)明性組合提取物(HF2、 HF3和 HF4)對于HMG-CoA-還原酶基因表達的改變的效應(yīng)，按照文獻(Gene C. N, Reed C. H. Selective compensatory induction of hepatic HMG-CoA reductase in response to inhibition of cholesterol absorption. Exp. Biol. Mes. 231:559-569, 2006)中的程序進《亍 了以下實驗。
在進行了 3-2中類似的步驟以后，從實驗大鼠傳送肝臟，使用Trizole試劑 (Gibco, BRL, USA)分離肝臟組織中的RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco, BRL, USA)將提取的RNA合成cDNA，使用針對HMG-CoA-還原酶基因的引物 (SeqJl(F): TGA GGG AAC CCT GAC ACT TA， Seq.#2(R): CTT CAA ATT TTG GGCACTCA)進行RT-PCR。 HMG-CoA基因表達的結(jié)果
如圖17所示，與未處理的正常組(0.805)相比，以1%膽固醇和35%酒精處 理的對照組顯示出升高的HMG-CoA基因表達(1.852);然而與對照組相比，以 HF2、 HF3和HF4處理的組顯示出降低大約L5倍的基因表達水平(HF2: 1.633; HF3: 1.290; HF4: 1.224)。
因此確定以HF2、 HF3和HF4特別是HF4處理的組對于酒精性脂肪肝引起 的膽固醇生產(chǎn)降低顯示出有力的抑制效應(yīng)(見圖17)。
實驗例7.急性毒性的評估
為了測定發(fā)明性提取物的毒性，在大鼠上進行了急性毒性測試。將15只雄性 和雌性SD大鼠分成3組，向每5只大鼠施用3種劑量的發(fā)明性提取物，即1 g/kg、 2g/kg和5g/kg，持續(xù)14天，以水處理對照組。觀測4周毒性的癥狀，例如體重 改變、血清學(xué)分析和組織學(xué)測試。
作為實驗的結(jié)果，施以發(fā)明性提取物的大鼠沒有死亡的例子；沒有顯著性非 正常體重增加和組織學(xué)測試等。與這些結(jié)果相一致，確定發(fā)明性提取物是安全的。
以下將描述配制方法和各種賦形劑，但是本發(fā)明不限于這些。以下描述代表 性的制劑的例子。
注射液的制備
HF4 100 mg焦亞硫酸鈉 3.0 mg
尼泊金甲酯 0.8 mg
尼泊金丙酯 0.1 mg
蒸餾水 最佳注射劑量
將活性成分溶解來制備注射液，控制pH至大約7.5，然后將所有的成分注入 2ml試劑瓶(ample)中，通過常規(guī)注射液制備方法進行消毒。 粉末的制備
HF3 ' 500 mg
玉米淀粉 100 mg
乳糖 100 mg
云母 10 mg
通過將以上成分混合并注入密封的包裝來制備粉末。 藥片的制備
HF2 200 mg
玉米淀粉 100 mg
乳糖 100 mg
硬脂酸鎂 最佳劑量 通過將以上成分混合并壓成片來制備藥片 膠囊的制備
HF1 100 mg
乳糖 50 mg
玉米淀粉 50 mg
云母 2 mg
硬脂酸鎂 最佳劑量
將以上成分混合并通過常規(guī)的白明膠制備方法填充白明膠膠囊。 液體的制備
HF2 1000 mg
糖 20g .
多糖 20 g
檸檬香料 20 g
將活性成分溶解，然后將所有的成分注入1000 ml試劑瓶(ample),通過常規(guī) 液體制備方法進行消毒。 健康食品的制備
HF3 1000 mg
維生素混合物 最佳劑量 維生素A醋酸酯 70 mg
維生素E 1.0 mg維生素Bl
維生素B2
維生素B6
維生素B12
維生素C
生物素
煙酰胺
葉酸
泛酸鈣
礦物混合物
硫酸亞鐵
氧化鋅
碳酸鎂
磷酸二氫鉀
檸檬酸鉀
碳酸鈣
氯化鎂
0.13 mg 0.15 mg 0.5 mg 0.2 mg 10 mg 10 mg 1/7 mg 50 mg 0.5 mg 最佳劑量 1.75 mg 0.82 mg. 25.3 mg 15 mg 55 mg 90 mg 100 mg 24.8 mg
上述維生素和礦物混合物可以多種方式變化。不應(yīng)該認為這樣的變化偏離了 本發(fā)明的主旨和范圍。 健康飲料的制備
HF4 1000 mg
1000 mg 訓(xùn)g
杏濃縮物 2 g
?；撬?lg 蒸餾水 900 ml
將活性成分溶解，混合，在85'C攪拌1個小時，過濾，然后將所有的成分注 入1000ml試劑瓶(ample)，通過常規(guī)健康飲料制備方法進行消毒。
因此本發(fā)明被描述，顯而易見的是本發(fā)明可以很多方式改變。不應(yīng)該認為 這樣的變化偏離了本發(fā)明的主旨和范圍，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的所有 的這樣的改變都被認為包括在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
工業(yè)實用性
本發(fā)明所述組合草藥組合物對于升高的GOT、 GPT、膽固醇、甘油三酯、LDL-膽固醇顯示出有力的抑制效應(yīng)，以及對于降低的HDL-膽固醇顯示出有力的升高效 應(yīng)，以及預(yù)防和治療肝硬化和脂肪肝。本發(fā)明所述發(fā)明性組合物在預(yù)防和治療肝病中是有用的，可用作安全且有效 的肝臟保護性試劑。 序列表文字
SEQ ID NO. 1: TGA GGG AAC CCT GAC ACT TA SEQ ID N0.2: CTT CAA ATT TTG GGC ACT CA
權(quán)利要求
1、一種藥物組合物，其包含可有效預(yù)防和治療肝病劑量的作為活性成分的組合草藥的提取物，所述的組合草藥由云芝Coriolus versicolor和黃芪Astragalusmembranaceus Bunge組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含云芝和黃芪 以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中除了如權(quán)利要求l所述的組合草 藥外，所述草藥還包含至少一種草藥，選自五味子Schisandra chinensis或茵陳蒿 Artemisia capillaris，以用于預(yù)防和治療肝病。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含云芝、黃芪 和五味子以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10:1。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含云芝、黃芪 和茵陳蒿以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10:1。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含云芝、黃芪、 五味子和茵陳蒿以基于每種草藥干重(w/w。/。)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10: 0.1-10:1。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的藥物組合物，其中所述提取物選自粗提物、低 碳醇不可溶性成分提取物或非極性溶劑可溶性提取物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述粗提物在蒸餾水，Cl-C4低 碳醇例如甲醇、乙醇等，或其混合物中可溶。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中所述低碳醇不可溶性成分提取物 包含通過以下步驟制備的提取物以低碳醇溶液例如乙醇和水的混合溶液提取粗 提物以分離低碳醇可溶性成分和低碳醇不可溶性成分；并收集低碳醇不可溶性成 分提取物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中此處公開的非極性溶劑可溶性 提取物包含通過以下歩驟制備的提取物以非極性溶劑例如己垸、氯仿、二氯甲 垸或乙酸乙酯來分離粗提物；并收集非極性溶劑可溶性提取物。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的藥物組合物，其中所述肝病選自脂肪肝、急 性或慢性肝炎、肝腫大、肝膿腫、肝硬化或肝癌。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述肝病選自脂肪肝、肝硬化 或肝炎。
13、 一種制備如權(quán)利要求1或3所述藥物組合物的方法，包括以下步驟將 草藥洗滌、干燥并以合適的比率(W/W)混合，或者，在此階段將另外的草藥共混 合以制備粗制藥物組合物；將草藥研磨成粉；將研磨成粉的組合物與5-20倍體積 的蒸餾水，醇例如甲醇、乙醇等，或其混合物混合；然后，在0至室溫的溫度范 圍內(nèi)冷吸，持續(xù)12至48小時，或者，在80至12(TC的溫度范圍內(nèi)加熱，持續(xù)1-24 小時，進行2-5次；過濾并在80-12(TC減壓下將提取物濃縮；提取物以10-60倍體 積的水通過共沸蒸餾進行濃縮1-5次，然后通過凍干或真空干燥進行干燥以獲得干 燥粗提物形式的粗制藥物組合物。
14、 一種健康功能食品，其包含可有效預(yù)防和改善肝病劑量的作為活性成分 的組合草藥的提取物，所述的組合草藥由云芝和黃芪組成，通過保護肝細胞而預(yù) 防和改善肝病。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的健康功能食品，其中所述食品包含云芝和黃芪， 以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:1。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的健康功能食品，其中除了如權(quán)利要求l所述的組 合草藥外，所述食品還包含至少一種草藥，選自五味子或茵陳蒿，以用于預(yù)防和 治療肝病。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的健康功能食品，其中所述食品包含云芝、黃芪和 五味子，以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10:1。
18、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的健康功能食品，其中所述食品包含云芝、黃芪和 茵陳蒿，以基于每種草藥干重(w/w%)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10:1。
19、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的健康功能食品，其中所述食品包含云芝、黃芪、 五味子和茵陳蒿，以基于每種草藥干重(w/wQ/。)的比率混合，比率介于0.1-10:0.1-10: 0.1-10:1。
20、 根據(jù)權(quán)利要求14或16所述的健康功能食品，其中所述提取物選自粗提 物、低碳醇不可溶性成分提取物或非極性溶劑可溶性提取物。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其中所述粗提物在蒸餾水，Cl-C4 低碳醇例如甲醇、乙醇等，或其混合物中可溶。
22、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的健康功能食品，其中所述低碳醇不可溶性成分提 取物包含通過以下步驟制備的提取物以低碳醇溶液例如乙醇和水的混合溶液提 取粗提物以分離低碳醇可溶性成分和低碳醇不可溶性成分；并收集低碳醇不可溶 性成分提取物。
23、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的健康功能食品，其中此處公開的非極性溶劑可溶 性提取物包含通過以下步驟制備的提取物以非極性溶劑例如己烷、氯仿、二氯 甲烷或乙酸乙酯來分離粗提物；并收集非極性溶劑可溶性提取物。
24、 根據(jù)權(quán)利要求14或16所述的健康功能食品，其中所述肝病選自脂肪肝、 急性或慢性肝炎、肝腫大、肝膿腫、肝硬化或肝癌。
25、 根據(jù)權(quán)利要求24所述的健康功能食品，其中所述肝病選自脂肪肝、肝硬 化或肝炎。
26、 如權(quán)利要求1或3所述的提取物在制備用于預(yù)防或治療肝病的藥物例如 肝臟保護性試劑中的用途。
27、 一種治療哺乳動物中肝病的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用 有效量的如權(quán)利要求1或3所述的提取物及其藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于肝病預(yù)防和治療需要的組合草藥組合物，其包含云芝(Coriolus versicolor)、黃芪(Astragalus membranaceus Bunge)，還包含至少一種草藥，選自五味子(Schisandra chinensis)或茵陳蒿(Artemisia capillaris)，還涉及使用以上粗制藥物組合物的方法，以及作為肝臟保護性試劑的藥物組合物。
文檔編號A23L1/29GK101563092SQ200780046695
公開日2009年10月21日 申請日期2007年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者李正植 申請人:李正植