專利名稱：臍帶血干細(xì)胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激的制作方法
臍帶血干細(xì)胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激 相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2006年11月1日提交的美國臨時申請No.60/856，071的優(yōu)先權(quán)，
其公開對于所有目的通過引用完整地整合在本申請中。
背景技術(shù)：
對于人干細(xì)胞的鑒定、分離和產(chǎn)生存在著相當(dāng)大的興趣。人干細(xì)胞通常是 能夠自我更新并產(chǎn)生各種成熟的人的細(xì)胞系的全能或多能的前體細(xì)胞。這一能 力是組織和器官發(fā)育所必需的細(xì)胞分化和特化的基礎(chǔ)。最近在干細(xì)胞移植方面 的成功已經(jīng)為由于疾病、接觸有毒化學(xué)品和/或輻射所引起的骨髓肅清 (myeloablation)后的骨髓重建和/或補(bǔ)充提供了新的臨床工具。進(jìn)一步的證據(jù) 證明，干細(xì)胞可以用于重塑許多(如果不是所有)組織并恢復(fù)生理和解剖學(xué)功 能性。
已經(jīng)對許多不同種類的哺乳動物干細(xì)胞進(jìn)行了表征。例如，胚胎干細(xì)胞、 胚胎生殖細(xì)胞、成人干細(xì)胞以及其他承認(rèn)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞是已知的。事實(shí)上， 對某些干細(xì)胞不但進(jìn)行了分離和表征，而且在允許有限程度分化的條件下對其
進(jìn)行了培養(yǎng)。由于人群中HLA類型的數(shù)千萬種可能組合，存在著一個基本問 題，即非常難以獲得充分?jǐn)?shù)量、種群和多樣性的能夠分化成能與單個患者HLA 匹配的所有細(xì)胞類型的人干細(xì)胞HLA類型。不同HLA類型的干細(xì)胞的供給嚴(yán) 重短缺。由于其在各種疾病和癥狀(包括惡性腫瘤、先天性代謝缺陷、血紅蛋 白病和免疫缺陷)治療中的重要性，獲得各種HLA類型的干細(xì)胞的足夠來源 會是非常有利的。
出于幾個原因難以獲得足夠數(shù)量的人干細(xì)胞。首先，部分是由于在血液和 組織中所發(fā)現(xiàn)的數(shù)量非常有限，在成人組織中分離正常產(chǎn)生的干細(xì)胞群在技術(shù) 上是困難的且昂貴的。其次，從胚胎或胎兒組織(包括流產(chǎn)胎兒)中獲得這些 細(xì)胞引起了倫理問題。因此，不需要使用從胚胎或胎兒組織中獲得的細(xì)胞的其他來源是進(jìn)一步發(fā)展干細(xì)胞臨床使用的根本問題。然而，只有很少的干細(xì)胞、 尤其是人干細(xì)胞的可行的其他來源，因此其供給是受到限制的。而且，從其他 來源獲得用于治療和研究目的的足夠數(shù)量干細(xì)胞通常是費(fèi)力的。
例如，美國專利No. 5,486,359公開了源自骨髓的人間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞 (HMSC)組合物。通過對不含與造血細(xì)胞或分化的間葉細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的粘附 骨髓或骨膜細(xì)胞的陽性選擇獲得均一的HMSC組合物。所分離的間葉細(xì)胞樣 細(xì)胞群表現(xiàn)出與間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞相關(guān)的特征、具有在培養(yǎng)基中不分化而再生 的能力、并且在體外誘導(dǎo)或體內(nèi)置于受損組織處時具有分化成特定間葉細(xì)胞系 的能力。然而，這樣的方法的缺點(diǎn)在于，為了隨后進(jìn)行HMSC分離，首先需 要從供體中以侵入和疼痛的方式收集骨髓或骨膜細(xì)胞。
臍帶血是另一種已知的間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞以及造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的來 源。臍帶血干細(xì)胞通常冷凍保藏用于重建造血功能，這是骨髓和其他相關(guān)移植 中使用的一種治療方法(參見例如美國專利5,004,681和5,192,553)。用于收集 臍帶血的常規(guī)技術(shù)基于使用針或套管，其在重力幫助下將臍帶血從胎盤排出 (參見例如美國專利5，004，681、 5,192,553、 5,372,581禾B 5,415,665)。針或套 管通常置于臍帶經(jīng)脈中，并輕輕按摩胎盤以幫助臍帶血從胎盤排出。然而，由 臍帶血獲得干細(xì)胞的主要限制在于所獲得的臍帶血體積經(jīng)常不足，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù) 量不足以在移植后有效重建骨髓。
干細(xì)胞具有在大量各種疾病和損傷的治療中使用的潛力，這包括神經(jīng)系統(tǒng) 損傷(例如脊髓損傷)、惡性腫瘤、遺傳疾病、血紅蛋白病和免疫缺陷。然而， 由于其收集的限制、通常從臍帶血收集的細(xì)胞數(shù)量不足(尤其是如果用于治療
成年患者)、以及建立大臍帶血庫的高成本，臍帶血干細(xì)胞嚴(yán)重短缺。因此， 在本領(lǐng)域內(nèi)，對于在細(xì)胞培養(yǎng)體系中能夠?qū)⒏杉?xì)胞擴(kuò)展到足以進(jìn)行移植的數(shù)量 的臍帶血干細(xì)胞培養(yǎng)方法存在著強(qiáng)烈需求。在本領(lǐng)域內(nèi)對于提高所移植的干細(xì) 胞的生長和存活并降低或延緩受體中的干細(xì)胞排斥的方法也存在需求。本發(fā)明 滿足了這些和其他需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了使用含鋰鹽的體外細(xì)胞培養(yǎng)體系刺激人臍帶血干細(xì)胞產(chǎn)生生長因子的方法以及擴(kuò)展(expanding)臍帶血干細(xì)胞的方法。本發(fā)明也提供了通過 移植前用鋰鹽處理細(xì)胞提高所移植的臍帶血干細(xì)胞的存活和生長的體內(nèi)方法。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過移植后給予鋰鹽降低所移植的臍帶血干細(xì)胞排斥的 體內(nèi)方法。
本發(fā)明部分基于鋰刺激干細(xì)胞產(chǎn)生或表達(dá)生長因子這一意外發(fā)現(xiàn)上。不局 限于任何具體理論，鋰對干細(xì)胞增殖、存活和免疫排斥的作用是由干細(xì)胞對鋰 鹽的應(yīng)答中產(chǎn)生或表達(dá)的生長因子的數(shù)量所介導(dǎo)的。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了用于刺激人臍帶血細(xì)胞產(chǎn)生生長因子的 方法，所述方法包括在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
鋰通常刺激諸如細(xì)胞存活因子、抗分化因子及其組合的生長因子的產(chǎn)生和 表達(dá)。細(xì)胞存活因子的例子包括但不限于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細(xì)胞因子、表皮生長 因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維生長因子(FGF)、胰島 素樣生長因子(IGF)、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、色素上皮細(xì)胞衍生因子(PEDF)、神經(jīng)鞘瘤衍生生長因子(SDGF)、 肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子ot(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子-(3 (TGF-p)、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP l-BMP 15)、生長分化因子-9 (GDF-9)、粒細(xì)胞 集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌肉生 長抑制素(myostatin) (GDF-8)、紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、 以及它們的組合。白血病抑制因子(LIF)是一種優(yōu)選的抗分化因子。
神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的例子包括但不限于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-1 (NT-1)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白 -3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生祌經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì) 細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因 子(NGF)、以及它們的組合。
非限制性的細(xì)胞因子的例子包括IL-lcc、 IL-1(3、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL隱6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-17、 IL-23、 IL-27、 TNF-a、 IFN-a、 IFN-(3、 IFN-y、 CXCLl/GR01/GROa、 CXCL2/GR02、 CXCL3/GR03、 CXCL4/PF陽4、 CXCL5/ENA-78、 CXCL6/GCP-2、 CXCL7/NAP-2、 CXCL9/MIG、 CXCL10/IP-10 、 CXCL11/I-TAC 、 CXCL12/SDF陽1 、 CXCL13/BCA-1 、 CXCL14/BRAK、 CXCL15、 CXCL16、 CXCL17/DMC、 CCL1、 CCL2/MCP隱1、
7C(X3鐘P陽la、 CCL4扁P-1(3、 CCL5/RANTES、 C(X6/C10、 CCL7/MCP-3、 CCL8/MCP-2 、 CCL9/CCL10 、 CCL11/嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白(Eotaxin)、 CCL12就P-5、 CCL13/MCP陽4、 CCL14/HCC-1、 CCL15/MIP陽5、 CCL16/LEC、 CCL17/TARC、 CCL18/MIP-4、 CCL19/MIP-3p、 CCL20/MIP-3a、 CCL21/SLC、 CCL22/MDC、 CCL23/MPIF1、 CCL24/嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白-2、 CCL25/TECK、 CCL26/嗜伊紅粒細(xì)胞趨化蛋白-3、 CCL27/CTACK、 CCL28/MEC、 CL1、 CL2、 CX3CL1、以及它們的組合。
適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰以及硫
酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實(shí)施方式中，所述鋰鹽(例如氯化 鋰)以約0.5至約5mM的濃度(例如約0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3、 3.1、 3.2、 3,3、 3.4、 3.5、 4、 4.5或5mM)存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述鋰鹽以約3 mM的濃度存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中。
在某些情況下，可以用鋰模擬化合物(l他ium mimetic compound)培養(yǎng)所述臍 帶血細(xì)胞(參見例如Gould等，7Vewra戸j;c/2o; torwflco/ogy， 30:1223-1237 (2005); 以及Gould,Op/". 77^. rwgeto， 10:377-392 (2006))。在某些其他情況 下，可以用類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細(xì)胞，例如丙戊酸(參見例如 Hahn等，尸矽c/n'a^: i e&, 39:355-363 (2005); Shao等，尸^c/z/a^y， 58:879-884 (2005);以及Dokucu等，iVewra戸;;cAo;7/2aTm"co/ogy， 30:2216-2224 (2005))、丙戊酸二鈉(參見例如Calabrese等，爿m. J /^yc/z/a^7， 162: 2152-2161
(2005) )、以及卡巴咪嗪(參見例如Bazinet等，5/o/.尸^dH'a^y, 59: 401-407
(2006) )。
在一些實(shí)施方式中，首先將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后用鋰鹽 培養(yǎng)存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，首先將收 集的臍帶血單位基本耗盡紅細(xì)胞并隨后用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細(xì)胞的臍帶血 單位中的干細(xì)胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領(lǐng)域的人員已知的任何 體外培養(yǎng)技術(shù)在耗盡血漿或耗盡紅細(xì)胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所 述臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
另一方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)展人臍帶血細(xì)胞的方法，該方法包括在含 鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。適當(dāng)?shù)匿圎}包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是
氯化鋰。在一些實(shí)施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約0.5至約5 mM的 濃度(例如約0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 4、 4.5或5mM)存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述 鋰鹽以約3 mM的濃度存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。
在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養(yǎng)所述臍帶血細(xì)胞。在某些其他情 況下，可以用類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細(xì)胞，例如丙戊酸、丙戊酸 二鈉、卡巴咪嗪、以及它們的組合。
如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng) 存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細(xì)胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基 本耗盡紅細(xì)胞并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細(xì)胞的臍帶血單位中的干細(xì) 胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領(lǐng)域的人員已知的任何體外培養(yǎng)技術(shù) 在耗盡血漿或耗盡紅細(xì)胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所述臍帶血干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)。
另一方面，本發(fā)明提供了用于提高對象中所移植的人臍帶血細(xì)胞的存活和 生長的方法，所述方法包括(a)在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及(b) 將步驟(a)的細(xì)胞給予對象。
適用于本發(fā)明所述方法用于提高所移植的臍帶血細(xì)胞的存活和生長的鋰鹽 的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。 在一些實(shí)施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約0.5至約5 mM的濃度(例 如約0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 4、 4.5或5mM)存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。在一優(yōu)選實(shí)施方式中、所述鋰鹽以約 3 mM的濃度存在于所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。
在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養(yǎng)所述臍帶血細(xì)胞。另外，可以用 類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細(xì)胞，例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、卡巴咪 嗪、以及它們的組合。
如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng) 存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細(xì)胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基 本耗盡紅細(xì)胞并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細(xì)胞的臍帶血單位中的干細(xì)胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領(lǐng)域的人員已知的任何體外培養(yǎng)技術(shù) 在耗盡血漿或耗盡紅細(xì)胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所述臍帶血干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)。
所述對象通常是一種哺乳動物，如人。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的 損傷的情況下，所述培養(yǎng)的細(xì)胞優(yōu)選脊柱內(nèi)給藥。
在某些情況下，所述方法進(jìn)一步包括將鋰鹽(如氯化鋰)給予哺乳動物(如 人)。所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限于口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮 下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、以及肌內(nèi)的方式給予。在一些實(shí)施方式中，所述鋰鹽以
約lmg/kg至約150mg/kg (例如約1、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 20、 25、 50、 75、 100、 125、或150 mg/kg)的劑量給予所述對象。在一 優(yōu)選實(shí)施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。
本發(fā)明所述培養(yǎng)的細(xì)胞和鋰鹽可以單獨(dú)或與根據(jù)給藥途徑和常規(guī)制藥實(shí)踐 所選擇的制藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實(shí)例，可以將常規(guī)緩沖鹽 溶液(例如約135-150 mMNaCl)用作制藥上允許的載體。其他適當(dāng)?shù)妮d體包 括但不限于水、緩沖的水、0.4%鹽溶液、0.3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓制 藥科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences),賓西法尼亞州費(fèi)城麥克出 版社(Mack Publishing Co.， Philadelphia, PA)，第18版，(1995))中描述了其他 適用于運(yùn)送本發(fā)明所述培養(yǎng)的細(xì)胞和鋰鹽的載體。
另一個方面，本發(fā)明提供了用于降低對象中所移植的臍帶血細(xì)胞排斥的方 法，所述方法包括細(xì)胞移植后將鋰鹽給予所述對象。
所述對象通常是哺乳動物(如人)。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的損傷 的情況下，所述細(xì)胞優(yōu)選通過脊柱內(nèi)給藥移植。
適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽的非限制性實(shí)例包括氯化鋰、碳酸鋰、和硫 酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在某些情況下，可以在細(xì)胞移植前使用體 外培養(yǎng)技術(shù)在含鋰鹽的培養(yǎng)基中對臍帶血干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)展。所述臍帶血干細(xì)胞 可以從所收集的基本耗盡血漿和/或紅細(xì)胞的臍帶血單位中獲得。
所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限于口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮 下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、以及肌內(nèi)等方式給藥。在一些實(shí)施方式中，所述鋰鹽以 約lmg/kg至約150mg/kg (例如約1， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11,12， 13， 14， 15，20， 25， 50， 75， 100， 125，或150 mg/kg)的劑量對所述對象給藥。在一優(yōu) 選實(shí)施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。在某些情況下，可以用鋰 模擬化合物或類似于鋰的精神藥物(例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、和/或卡巴咪嗪) 對對象給藥以降低所移植的臍帶血干細(xì)胞的排斥。
本發(fā)明所述的鋰鹽可以單獨(dú)或與根據(jù)給藥途徑和常規(guī)制藥實(shí)踐所選擇的制 藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實(shí)例，可以將常規(guī)緩沖鹽溶液(例如 約135-150 mMNaCl)用作制藥上允許的載體。其他適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于 水、緩沖的水、0.4%鹽溶液、0.3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓制藥科學(xué)》 (Remington's Pharmaceutical Sciences),賓西法尼亞州費(fèi)城麥克出版社， 第18版，(1995))中描述了其他適用于運(yùn)送本發(fā)明所述鋰鹽的載體。
所述鋰鹽可以在細(xì)胞移植后幾分鐘、幾小時、幾天、幾周、幾個月和/或幾 年內(nèi)給予對象。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞移植后可以用第二、第三、第四、第 五、第六、第七、第八、第九、第十或更多劑量的相同或不同的鋰鹽對對象進(jìn) 行治療。在某些情況下，也可以在細(xì)胞移植前和/或細(xì)胞移植過程中用l個或多 個劑量的所述鋰鹽對對象給藥。
本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)及其優(yōu)選實(shí)施方式會通過以下的詳細(xì)描述、
實(shí)施例和權(quán)利要求加以明確。


圖1顯示了證明鋰促進(jìn)NOl.l細(xì)胞體外增殖的數(shù)據(jù)。
圖2顯示了證明鋰刺激N01.1細(xì)胞體外生成生長因子的數(shù)據(jù)。
圖3顯示了通過定量實(shí)時PCR測定的證明鋰促進(jìn)N01.1細(xì)胞體內(nèi)增殖的數(shù)據(jù)。
圖4顯示了通過基因組PCR測定的證明鋰促進(jìn)N01.1細(xì)胞體內(nèi)增殖的數(shù)據(jù)。 圖5顯示了通過組織學(xué)分析測定的證明鋰促進(jìn)NOl.l細(xì)胞體內(nèi)存活的數(shù)據(jù)。 左嘴側(cè)部；右尾側(cè)部。比例尺=1 mm。
圖6顯示了證明鋰刺激N01.1細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生生長因子的數(shù)據(jù)。 圖7顯示了證明脊髓損傷后鋰對神經(jīng)保護(hù)的作用的數(shù)據(jù)。 圖8顯示了證明鋰促進(jìn)人臍帶血細(xì)胞體外增殖的數(shù)據(jù)。
11圖9顯示了證明鋰刺激人臍帶血細(xì)胞體外產(chǎn)生生長因子的數(shù)據(jù)。
圖10顯示了證明鋰刺激人臍帶血細(xì)胞體外生成生長因子的其他數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳細(xì)描述 I.導(dǎo)言
鋰用于治療雙相型障礙和其他神經(jīng)學(xué)癥狀已有50多年了 (參見例如Manji 等，歷o/. Z^cA/欣》46:929-940 (1999))。躁郁癥患者經(jīng)常需要終身攝入鋰， 其治療血液濃度為約l mM。盡管如此的高濃度，鋰是相對無毒的。鋰對細(xì)胞 具有許多潛在作用機(jī)制(Jope， Mo/.尸—,勿,4:117-128 (1999))。例如，鋰 調(diào)節(jié)包括GSK-3、 Akt、 cAMP依賴型激酶和蛋白激酶C在內(nèi)的多種酶及其對 應(yīng)的第二信使和轉(zhuǎn)錄因子的活性。
對鋰對神經(jīng)細(xì)胞作用的研究顯示，鋰可以刺激神經(jīng)再生(Bustuoabad等， A/^fc/"fl， 40:547-552 (1980))和神經(jīng)祖細(xì)胞增殖(Hashimoto等，A^wmsc/e"ce, 117:55-61 (2003))、在中風(fēng)模型中誘導(dǎo)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞在受傷部位附近 的增殖(Chuang， C〃Y. Wev. A^wra&b/， 16:83-90(2004))、提高膠質(zhì)細(xì)胞在腦下 垂體中的增殖(Levine等，Ce//尸ra/仏，3 5:167-172 (2002); Levine等，Ce〃尸ra/(/:, 33:203-207 (2000))、刺激白細(xì)胞遷移能力(Azzara等，//aem^o/og/c^ 72:121-127 (1987); Azzara等.^"a//aema/o/, 85:100-102 (1991))、提高海馬 神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)元分化(Kim等，J臉騰/z緩,89:324-336 (2004))、以及 增強(qiáng)小鼠海馬區(qū)中的神經(jīng)形成(Laeng等,乂7V,c/2醫(yī),91:238-251 (2004))。 然而，這些參考文獻(xiàn)都沒有考査體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細(xì)胞產(chǎn)生生長因子 的影響。同樣地，這些參考文獻(xiàn)沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細(xì)胞增殖 和存活的影響。
此外，鋰對骨髓的作用的研究顯示，鋰可以提高集落刺激活性產(chǎn)生并加快 粒細(xì)胞生成和紅血球生成(Labedzki等，A7,'". M c/zemc&, 58:211-218 (1980))、 降低化療引起的對粒細(xì)胞生成和巨核細(xì)胞生成的抑制(Korycka等，^ra^. /wm朋o/. 7%^:五;cp., 39:501-509 (1991))、加快全身輻射后的骨髓恢復(fù)(Johnke 等， /Ce〃 C/om'Mg, 9:78-88 (1991))、逆轉(zhuǎn)由同時使用環(huán)戊丙酸雌二醇和乙 烯雌酚所引起的骨髓發(fā)育不全和血細(xì)胞減少(Hall， ^4m. Awoc，200:814-816 (1992))、以及恢復(fù)氯氮平引起的粒細(xì)胞減少患者中的正常血細(xì)胞 計數(shù)(Papetti等，血,30:578-582 (2004))。然而，這些參考文獻(xiàn)都沒 有考査體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細(xì)胞產(chǎn)生生長因子的影響。同樣地，這些參 考文獻(xiàn)沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細(xì)胞增殖和存活的影響。
因此，本發(fā)明是部分基于在含有諸如氯化鋰的鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人臍帶 血干細(xì)胞可以刺激這些干細(xì)胞生成生長因子從而促進(jìn)其增殖和存活這一意外 發(fā)現(xiàn)上的。事實(shí)上，如本發(fā)明的方法所述培養(yǎng)臍帶血干細(xì)胞成倍(例如至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10倍)地提高了生長因子的表達(dá)量和干細(xì)胞數(shù)量。本 發(fā)明還基于在移植前用鋰鹽處理臍帶血干細(xì)胞提高所移植干細(xì)胞的存活和增 長、以及臍帶血干細(xì)胞移植后用鋰鹽給藥降低所移植干細(xì)胞的免疫排斥這一意 外發(fā)現(xiàn)。因此，這里所述的方法不僅允許對臍帶血中所發(fā)現(xiàn)的有限供給的干細(xì) 胞的充分?jǐn)U展，而且通過例如提高所移植干細(xì)胞的存活和生長以及/或降低所移 植干細(xì)胞的免疫排斥，提供了對移植受體臨床結(jié)果的顯著改善。
II.定義
如這里所使用的，除非另有說明，以下術(shù)語具有歸其所有的含義。 術(shù)語"干細(xì)胞"是指具有在不確定的時間段內(nèi)分裂并產(chǎn)生專門化細(xì)胞的能力 的任何細(xì)胞。干細(xì)胞源于所有胚層(即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)。典型的干 細(xì)胞來源包括胚胎、骨髓、外周血、臍帶血、胎盤血、肌肉組織和脂肪組織。 干細(xì)胞可以是全能的，這意味著它們能生長和分化成體內(nèi)的任何細(xì)胞。在哺乳 動物中，只有受精卵和早期胚胎細(xì)胞是全能性的。另外，干細(xì)胞可以是多能的， 這意味著它們能產(chǎn)生生物體內(nèi)的大部分組織。例如，多潛能(pluripotent)干 細(xì)胞可以產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肝、血液、肌肉、骨等等的細(xì)胞。多能干細(xì)胞 的例子包括但不限于臍帶血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、脂肪衍生干細(xì) 胞、間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞、胎盤衍生干細(xì)胞、乳牙衍生干細(xì)胞以及毛囊干細(xì)胞。 相反，多能(multipotent)干細(xì)胞或成人干細(xì)胞通常產(chǎn)生有限種類的細(xì)胞。除 非另有說明，這里所使用的術(shù)語干細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
術(shù)語"祖細(xì)胞"是指品系明確的細(xì)胞，即一種祖細(xì)胞可以產(chǎn)生限于單一品系 的后代。祖細(xì)胞的非限制性的例子包括神經(jīng)元系、肝系、腎組織系、脂肪組織細(xì)胞系、肺泡系、心臟系、腸系或內(nèi)皮系的前體細(xì)胞。 這里所使用的術(shù)語"培養(yǎng)"是指將干細(xì)胞保持在其能增殖并避免衰老的條件
下。例如，在本發(fā)明中，干細(xì)胞在含有鋰鹽和可選地一種或多種生長因子(即
生長因子雞尾酒)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
術(shù)語"刺激生長因子產(chǎn)生"是指使用鋰鹽提高來自干細(xì)胞的一種或多種生長
因子的表達(dá)(例如mRNA、蛋白質(zhì))。通常，生長因子表達(dá)的提高是與在無鋰 鹽條件下培養(yǎng)的對照干細(xì)胞相比而言的。如實(shí)施例1和2中所述，本發(fā)明的方 法(即當(dāng)干細(xì)胞在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時)可以顯著刺激干細(xì)胞產(chǎn)生生長因 子?？梢酝ㄟ^用鋰鹽培養(yǎng)干細(xì)胞所刺激的生長因子的例子包括但不限于細(xì)胞存 活因子(例如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細(xì)胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生 生長因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF) 等等)、抗分化因子(例如白血病抑制因子(LIF)等待)、以及它們的組合。 神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的非限制性例子包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-1 (NT-1)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3
(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì) 胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子
(NGF)(例如NGFa、 NGF卩和NGFy)、以及它們的組合。細(xì)胞因子的例子包 括如上所述的屬于白細(xì)胞介素或干擾素亞家族的那些因子。
術(shù)語"體外擴(kuò)展"是指在實(shí)驗室中培養(yǎng)干細(xì)胞。這樣的細(xì)胞從哺乳動物中提 取并通過在適當(dāng)環(huán)境中(例如在含鋰鹽的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)產(chǎn)生額外的細(xì)胞量。 如果可能，建立穩(wěn)定的細(xì)胞系以進(jìn)行細(xì)胞的連續(xù)繁殖。如實(shí)施例1和2中所述， 本發(fā)明的方法(即當(dāng)干細(xì)胞在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時)可以顯著促進(jìn)干細(xì)胞 的體外增殖。
術(shù)語"提高存活和生長"是指使用鋰鹽促進(jìn)所移植的千細(xì)胞的活力和增殖。 通常，所移植的干細(xì)胞的存活和生長的提高是與在無鋰鹽條件下培養(yǎng)和移植的 對照干細(xì)胞相比而言的。如實(shí)施例1中所述，本發(fā)明的方法(即用鋰處理的干 細(xì)胞對哺乳動物給藥)可以顯著提高所移植的干細(xì)胞的存活和生長。有活力的 細(xì)胞是活的并通常具有生長和分裂能力的細(xì)胞。精通本領(lǐng)域的人員知道確定細(xì) 胞活力的方法，例如通過其排斥臺盼藍(lán)染液的能力。
術(shù)語"降低排斥"是指使用鋰鹽以降低、延遲或消除所移植細(xì)胞的免疫排斥風(fēng)險。通常，所移植的干細(xì)胞的排斥的降低是與在無鋰鹽條件下培養(yǎng)和移植的 對照干細(xì)胞相比而言的。作為非限制性的例子，當(dāng)用諸如氯化鋰的鋰鹽對干細(xì) 胞受體給藥時，本發(fā)明的方法可以顯著延遲所移植干細(xì)胞的免疫排斥的發(fā)作。
術(shù)語"臍帶血"是指從出生后留下的臍帶血中獲得的多潛能和多能干細(xì)胞的 來源。在臍帶血中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞的例子包括但不限于間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞、造血 干細(xì)胞和祖細(xì)胞。間葉細(xì)胞樣干細(xì)胞和祖細(xì)胞通常能分化成神經(jīng)細(xì)胞、骨髓基 質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、造骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、腱細(xì)胞和韌帶細(xì)胞。造血 干細(xì)胞通常形成淋巴系、髓系和紅血球系的細(xì)胞。下文提供了用于收集和處理 臍帶血的方法的詳細(xì)描述。
這里所使用的術(shù)語"臍帶血單位"是指從單個供體收集的臍帶血的體積。本 發(fā)明的方法中通常使用單個臍帶血單位，但也可以使用多個臍帶血單位(例如 兩個臍帶血單位)以增加干細(xì)胞數(shù)。
如這里所使用的，術(shù)語"基本耗盡血漿的"和"耗盡血漿的"是指其中約30%、
35%、 40%、 45%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或 95%以上體積的血漿已經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血單位。例如，通過離心臍帶血 并將細(xì)胞組分與血漿組分分開可以基本耗盡血漿?；竞谋M后殘留的血漿體積 通常為約0%至約30% (體積比)，優(yōu)選約10%至約30% (體積比)。
這里所使用的術(shù)語"非紅細(xì)胞耗盡的"和"紅細(xì)胞未耗盡的"是指其中約 30%、 25%、 20%、 15%、 10%、 5%、 4%、 3%、 2%或1%以下體積的紅細(xì)胞已 經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血單位。
如這里所使用的，術(shù)語"紅細(xì)胞基本耗盡的"和"耗盡紅細(xì)胞的"是指其中約 30%、 35%、 40%、 45%、 50o/o、 55%、 60%、 65%、 700/。、 75。/。、 80%、 85%、 90%或95%以上體積的紅細(xì)胞已經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血。
"有核細(xì)胞"是指具有核(即含染色體DNA的細(xì)胞器)的細(xì)胞。有核細(xì)胞包 括例如白細(xì)胞和干細(xì)胞。"無核細(xì)胞"包括例如成人紅細(xì)胞。
術(shù)語"鋰鹽"是指任何制藥上允許的鋰的鹽。適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽 的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰、以及硫酸鋰、檸檬酸鋰、羥丁酸鋰、乳 清酸鋰、醋酸鋰、鋁酸鋰、氫化鋁鋰、氨基化鋰、硼酸鋰 溴化鋰、二異丙氨 基鋰、氟化鋰、氫化鋰、氫氧化鋰、碘化鋰、偏硼酸鋰、鉬酸鋰、鈮酸鋰、硝酸鋰、氮化鋰、氧化鋰、高氯酸鋰、過氧化鋰、硫化鋰、鉭酸鋰、y亞麻酸鋰、 以及它們的組合。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。 術(shù)語"對象"指一種哺乳動物，如人。
如這里所使用的，術(shù)語"給藥"指通過任何包括但不限于口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、 靜脈內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、病變內(nèi)、氣 管內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、或透粘膜給藥途徑的諸如人臍帶血細(xì)胞的干 細(xì)胞或諸如氯化鋰的鋰鹽的遞送。所述鋰鹽通常經(jīng)口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、
腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥。在某些情況下，所述鋰鹽通過使用例如Alza 公司(Mountain View, CA)提供的0111108@植入物植入在對象中的滲透泵給藥。 在某些其他情況下，所述鋰鹽通過緩釋儲庫型注射給藥。所述干細(xì)胞可以通過 例如在疾病部位、受傷部位(例如用于治療脊髓損傷的脊柱內(nèi)給藥)或諸如器 官的其他目標(biāo)部位直接注射或灌注給藥。所述干細(xì)胞和鋰鹽可以同時(例如在 相同時間)或先后(例如間隔幾分鐘、幾小時或幾天)對對象給藥。
III.臍帶血干細(xì)胞 A.臍帶血的收集
臍帶血是干細(xì)胞的豐富來源，并且可以方便地以對供體無創(chuàng)方式獲得。相 反，收集用于移植的骨髓細(xì)胞是一種有創(chuàng)過程，其根據(jù)住院所花費(fèi)的時間和金 錢而言是昂貴的。優(yōu)選地，通過從臍帶直接排出收集臍帶血。因此，嬰兒分娩 之后，可以將臍帶雙重十字夾緊并在夾鉗的擠壓部分上方切開，產(chǎn)生的臍帶血 管中的胎兒血流可以收集在收集容器中。在胎盤分離發(fā)生前，通?？梢詿o需擠 壓臍帶完成足夠量的收集，并且收集過程在約2分鐘內(nèi)完成。需要注意避免分 娩區(qū)域中母體血液、尿液或其他流體的污染。也可以通過任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的 其他方法獲得臍帶血。
針對本發(fā)明目的的供體可以包括母體供體，她們是捐贈確認(rèn)書所針對的供 體，并且是對實(shí)際新生供體具有監(jiān)護(hù)權(quán)的母親，其中臍帶血的真實(shí)供體是新生 兒。母體供體是健康狀況良好并且年齡在約16至約50歲的個人。臍帶血捐贈 之前或之后可以收集所述母體供體的某些信息以確定供體的適宜性和不存在輸 血傳播的傳染病、遺傳病和造血系統(tǒng)癌癥。例如，可以要求所述母體供體填寫
16醫(yī)學(xué)問巻。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，母體供體在捐贈前應(yīng)接受醫(yī)學(xué)檢査。 應(yīng)當(dāng)在無菌條件下進(jìn)行臍帶血收集。在一些實(shí)施方式中，收集時可以立即
將臍帶血與抗凝血劑混合。通常，約23 mL至約35 mL的抗凝血劑與最多約255 mL臍帶血(即一個臍帶血單位)混合。適當(dāng)?shù)目鼓獎┌ū绢I(lǐng)域內(nèi)已知的 任何抗凝血劑，例如CPDA (檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷)、CPD (檸檬酸鹽 -磷酸鹽-葡萄糖)、ACD (酸-檸檬酸鹽-葡萄糖)、Alsever溶液(Alsever等，W K & J M /.， 41:126 (1941))、 De Gowin溶液(De Gowin等， /爿m. Awoc' 114:850 (1940))、 Edglugate-Mg (Smith等，■/ 7Tz翻c. CaW。麗c Swg., 38:573 (1959))、 Rous-Turner溶液(Rous等乂 Exp. 23:219(1916))、其他葡萄糖
混合物、肝素、雙香豆乙酯等等。
為了幫助臍帶血處理和提高安全性，用于各種血液成分的處理袋可以是無 菌血液袋系統(tǒng)的一部分。在一種實(shí)施方式中，在所述處理袋中的一個中整合了 血漿存儲溶液。此外，收集袋和處理袋都可以配備有出入口和插拔式連接器。 所述出入口可以用于向袋內(nèi)添加材料或從袋內(nèi)抽提材料。插拔式連接器可以用 于臨時關(guān)閉袋的導(dǎo)管或入口。
臍帶血通?？梢栽诶缂s0°C至約42°C之間或約15°C至約26°C之間的溫 度下儲藏不超過約48小時。
除了臍帶血，胎盤或胎兒血可以用于獲得適于培養(yǎng)和/或移植的干細(xì)胞。可 以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法收集胎盤或胎兒血。例如，使用由超聲波、胎 盤穿刺或胎兒鏡檢引導(dǎo)的針可以在胎盤根部從胎兒循環(huán)中獲取胎兒血。通過例 如在根部和擴(kuò)張的靜脈處從分娩的胎盤中針吸可以獲得胎盤血。
在一些實(shí)施方式中，要求產(chǎn)后的婦女捐獻(xiàn)臍帶血和胎盤血。聯(lián)系醫(yī)院并要 求其參加臍帶血/胎盤血收集項目。潛在的供體是通過自然分娩或剖腹產(chǎn)方式分 娩中的和準(zhǔn)備分娩的婦女。在美國專利No. 5,993,387中描述了一種從產(chǎn)后婦女 中獲得臍帶血和胎盤血的方法，例如通過一個家庭在小孩出生前加入一個庫并 對出生后所要收集的臍帶血干細(xì)胞的收集和保存收取費(fèi)用。
在一種實(shí)施方式中，分娩后收集并檢測了臍帶血和/或胎盤血。在一些實(shí)施 方式中，檢測確保臍帶血或胎盤血適于進(jìn)一步處理。檢測可以包括檢測胎盤以 確保其完整并且不含大量胎便或膿性溢液?？梢詸z測臍帶以確定其完整地含有2條動脈和l條靜脈并且沒有打結(jié)或其他異常。如上所述，可以收集在可選地 含有諸如檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷(CPDA)溶液的抗凝血劑的袋中。
B. 耗盡血漿處理
在一些實(shí)施方式中，可以按照例如美國專利公開No. 20060275271中所述 的方法減少所收集的臍帶血的體積。作為一個非限制性例子，首先通過在約0°C 至約42°C之間、優(yōu)選約15°C至約26°C之間的溫度下對所述混合物加以離心可 以降低所收集的臍帶血的體積。進(jìn)行離心從所述混合物中去除大量體積的液體 (例如血漿)。優(yōu)選以約lOOOg至約2500g離心約5至約20分鐘，其中離心力和 離心時間足以引起大部分細(xì)胞沉淀而不會引起細(xì)胞破損。離心后，去除大量體積 的血漿以降低臍帶血混合物體積，從而產(chǎn)生未耗盡紅細(xì)胞的耗盡血漿的臍帶血單 位?；竞谋M后殘留的血漿體積通常為約原體積的0%至約30%，優(yōu)選為約原體 積的10%至約30%。在某些情況下，耗盡血衆(zhòng)的臍帶血單位中留有至少約10mL 的血漿。優(yōu)選地，正如通過上清液血漿中的細(xì)胞計數(shù)所顯示的，去除上清液時損 失少于約5%的有核細(xì)胞(例如少于約5%、 4%、 3%、 2%或1%)。
在一些實(shí)施方式中，將耗盡血漿的單位移至冷凍用容器(例如Cryocyte⑧袋)， 并冷卻至約2°C至約8°C，保持約30至約60分鐘。通過所使用的具體CryoCyte 袋的容積、冷凍保藏的細(xì)胞數(shù)量以及冷凍保藏溶液的濃度確定合適的體積。如 果耗盡血漿的臍帶血單位的體積太大導(dǎo)致該體積大于約60至約75mL，則可以 使用更大的CryoCyte⑧袋或?qū)颖痉庋b在兩個或更多的CryoCyte⑧袋中。
C. 培養(yǎng)臍帶血干細(xì)胞
可以在冷凍保藏之前或之后使用體外培養(yǎng)技術(shù)在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)存 在于臍帶血單位中的干細(xì)胞。已經(jīng)描述了各種用于臍帶血干細(xì)胞在培養(yǎng)基中生 長的方案(參見例如Smith等,S"腸腿,o/' 63:29-34 (1986); Dexter等, J. Ce//.尸— 。/, 91:335 (1977); Witlock等，尸rac.胸/. Sc/. "S丄
79:3608-3612 (1982))。精通本領(lǐng)域的人員應(yīng)該知道其他用于體外培養(yǎng)臍帶血干 細(xì)胞群的方案。
各種因子可以與鋰鹽聯(lián)合使用以刺激培養(yǎng)物中臍帶血干細(xì)胞的增殖。作為非限制性例子，諸如白介素-1 (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素-4 (IL-4)、白 介素-6 (IL-6)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的各種細(xì)胞因子和 生長因子可以與鋰鹽組合使用以刺激存在于臍帶血單位中的干細(xì)胞的離體擴(kuò)展。
通過本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的臍帶血干細(xì)胞可以不經(jīng)過進(jìn)一步純化就使用。 另外，通過各種本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)(如免疫親和色譜、免疫吸附、FACS分 選等等)可以分離所培養(yǎng)干細(xì)胞的特定群或亞群。作為一個非限制性例子，可 以在其表達(dá)的諸如CD34、 c-kit和/或CXCR-4的細(xì)胞表面標(biāo)記的基礎(chǔ)上對臍帶 血干細(xì)胞加以分離。
本發(fā)明依賴于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。精通本領(lǐng)域的人員通過使用已 知的方法學(xué)(參見例如Freshney等，《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(Culture Of Animal Cells),第三版(1994))可以確定適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)方法和條件。通常，細(xì)胞培 養(yǎng)環(huán)境包括對諸如細(xì)胞生長底物、細(xì)胞密度和細(xì)胞粘著、氣相、培養(yǎng)基和溫度 等因素的考慮。
通常在已知對細(xì)胞生長最優(yōu)的條件下進(jìn)行孵育。這樣的條件可以包括例如 約37°C的溫度和含有約5%(:02的潮濕空氣。根據(jù)所需要的結(jié)果，孵育時間可 以變化很大。使用3H胸腺嘧啶脫氧核苷結(jié)合或BrdU標(biāo)記可以方便地測定增殖。
塑料皿、燒瓶、滾瓶或懸浮液中的微載體可以用于如本發(fā)明所述的方法培養(yǎng) 臍帶血干細(xì)胞。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)容器包括例如多孔平板、皮氏平皿、組織培養(yǎng)管、 燒瓶、滾瓶等等。臍帶血干細(xì)胞通常以基于細(xì)胞類型的憑經(jīng)驗確定的最優(yōu)密度 生長，并當(dāng)細(xì)胞密度大于最佳密度時進(jìn)行傳代。
考慮到溫度的地區(qū)差異，培養(yǎng)的臍帶血干細(xì)胞通常在提供適當(dāng)溫度(例如所 獲得的細(xì)胞所屬的動物的身體溫度)的培養(yǎng)箱內(nèi)生長。通常，37。C是細(xì)胞培養(yǎng) 的優(yōu)選溫度。大部分培養(yǎng)箱加濕至近似于大氣條件。
氣相的重要組成是氧和二氧化碳。通常，將大氣的氧壓用于細(xì)胞培養(yǎng)物。培 養(yǎng)容器通常將大氣排入培養(yǎng)箱，從而通過使用透氣蓋或通過防止培養(yǎng)容器密封 進(jìn)行氣體交換。二氧化碳在穩(wěn)定pH以及在為細(xì)胞培養(yǎng)基提供緩沖方面發(fā)揮作 用，并通常以約1%至約10%的濃度存在于培養(yǎng)箱中。優(yōu)選的C02濃度通常為約 5%?？梢垣@得包裝的、預(yù)先混合的粉末或預(yù)先滅菌的溶液形式的確定成分培養(yǎng)
基。通常使用的培養(yǎng)基的例子包括但不限于Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基 (DMEM)、 DME、 RPMI1640、完全Eagle培養(yǎng)基、以及McCoy培養(yǎng)基(參 見例如基博科/生命技術(shù)公司目錄和參考指引(GibcoBRL/Life Technologies Catalog and Reference Guide);西格瑪公司目錄(Sigma Catalog))。用約0.5-5 mM (例如約0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 4、 4.5、或5mM)的鋰鹽(例如氯化鋰)補(bǔ)充確定成分細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí) 施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在。也可以用約5-20%血清(通常是 熱滅活血清，例如人、馬、小牛和胎牛血清)補(bǔ)充確定成分細(xì)胞培養(yǎng)基。通常， 在本發(fā)明的方法中使用10%胎牛血清(FBS)或人血清(HS)。所述細(xì)胞培養(yǎng) 基通常具有緩沖能力以將細(xì)胞保持在pH約7.2至約7.4之間。所述培養(yǎng)基的其 他補(bǔ)充物包括例如抗生素、氨基酸、糖(例如約5.5-16.7 mM的葡萄糖)以及 生長因子(例如EGF、 FGF等等)。
IV.所培養(yǎng)的干細(xì)胞和鋰鹽的給藥
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法將鋰鹽和如本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的干細(xì) 胞對對象給藥。適當(dāng)?shù)慕o藥方法包括例如靜脈內(nèi)或皮下給藥、或局部投放(例 如直接注射或灌注入疾病部位或其他諸如器官的目標(biāo)部位)。
這里所述的所培養(yǎng)的干細(xì)胞和鋰鹽可以單獨(dú)或與制藥上允許的載體混合給 藥。制藥上允許的載體部分通過給藥的具體成分(例如細(xì)胞、鹽等等)以及用 于所述成分給藥的具體方法加以確定。因此，對于本發(fā)明所培養(yǎng)的細(xì)胞和鋰鹽 的給藥來說，存在大量各種適當(dāng)?shù)闹扑幣浞?。作為一個非限制性例子，普通緩 沖鹽溶液(例如約135-150 mM NaCl)可以用作制藥上允許的載體。其他適當(dāng) 的載體包括但不限于水、緩沖的水、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸等等。在例如《雷 明頓制藥科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences),賓西法尼亞州費(fèi)城 麥克出版社，第18版，(1995)中描述了其他適當(dāng)?shù)妮d體。如這里所使用的，術(shù) 語"載體"包括任何及所有溶劑、散布媒劑、包被、稀釋劑、抗菌和抗真菌劑、 等滲和吸收延緩劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等等。短語"制藥上允 許的"是指當(dāng)對哺乳動物(如人)給藥時不產(chǎn)生過敏或類似的不利反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。
本發(fā)明的干細(xì)胞和鋰鹽可被制成適于給藥的制劑，例如水性的或非水性 的、等滲的無菌注射溶液，它可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得該 配方與目標(biāo)受體的血液等滲的溶質(zhì)，以及可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、 穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液。
可以由無菌粉末、顆粒和藥片制備注射溶液和懸浮液。在本發(fā)明的背景中， 對對象給藥的劑量應(yīng)當(dāng)在對象中隨時間推移足以產(chǎn)生有益的治療反應(yīng)。對于所 培養(yǎng)的干細(xì)胞而言，應(yīng)通過所使用的具體干細(xì)胞的功效和對象狀況以及所治療 的對象的體重或表面積確定劑量。也應(yīng)當(dāng)通過在具體對象中具體細(xì)胞類型給藥 所伴隨的任何不利副作用的存在、本質(zhì)和程度確定所述劑量的大小。對于鋰鹽 而言，應(yīng)通過所使用的具體鋰鹽的功效和對象狀況以及所治療的對象的體重或 表面積確定劑量。也應(yīng)當(dāng)通過在具體對象中具體鋰鹽給藥所伴隨的任何不利副 作用的存在、本質(zhì)和程度確定所述劑量的大小。
在確定這里所述的疾病或損傷的治療中給予所培養(yǎng)的干細(xì)胞有效量的過程 中，醫(yī)師對細(xì)胞毒性、移植反應(yīng)、疾病進(jìn)程、以及抗細(xì)胞抗體的產(chǎn)生進(jìn)行評估。 對于給藥而言，根據(jù)對象的體重和整體健康狀況，可以將本發(fā)明所培養(yǎng)的干細(xì) 胞以有效減少或減輕與疾病或損傷相關(guān)的一種或多種癥狀的量給藥，同時考慮 到所述細(xì)胞類型在各種濃度下的副作用?？梢酝ㄟ^單一劑量或分開的劑量完成 給藥。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于治療受疾病或殘疾(例如脊髓損 傷)困擾的對象的方法，該方法包括用如這里所述的方法收集、處理并/或培養(yǎng) 的干細(xì)胞對對象給藥。作為一個非限制性例子，可以用足以補(bǔ)充由于疾病或損 傷而損失的細(xì)胞的量的鋰刺激的干細(xì)胞對對象給藥。
在某些情況下，由于疾病需要替代的細(xì)胞是血液細(xì)胞。另外，經(jīng)受針對癌癥 的化療或放射治療的對象的骨髓細(xì)胞可能被這樣的治療所破壞，從而導(dǎo)致發(fā)生 各種傳染性疾病的易感性提高。這些對象也可以用源自本發(fā)明方法的干細(xì)胞進(jìn) 行治療。在某些其他情況下，所述干細(xì)胞可以用于治療遭受脊髓損傷、創(chuàng)傷性 腦損傷、中風(fēng)、帕金森癥、阿爾茨海默病、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等所困擾的對象。所述干細(xì)胞也可以用于治療遭受諸如白血病、淋巴瘤、貧血、多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性血液異常的疾病、以及導(dǎo)致免疫缺 陷(例如AIDS)的疾病或治療所困擾的對象。
所述干細(xì)胞可以對對象單獨(dú)或與其他治療方案聯(lián)合給藥。在某些情況下， 所述的其他治療方案包括化療和/或放射治療。在某些其他情況下，其他資料方
案包括至少一種生長因子，例如GM-CSF、 G-CSF、 M-CSF、 IL-3、 IL-7、 EPO、 TPO、 IL-5或這里所述的任何其他生長因子。治療可以是同時或先后給藥。
V.干細(xì)胞移植
在一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞移植不需要HLA分型。在其他實(shí)施方式中，對 干細(xì)胞進(jìn)行HLA分型以保證與受體的相容性。HLA標(biāo)記的匹配數(shù)取決于使用 者的要求和干細(xì)胞的來源。例如，可以使用6個標(biāo)記中具有4個、5個或6個 匹配的從包括臍帶血在內(nèi)的胚胎或胎兒組織分離的干細(xì)胞。對于來自成人的干 細(xì)胞，優(yōu)選使用6個HLA標(biāo)記都相容的。在一些免疫障礙的對象中，移植物 對宿主反應(yīng)可能受到削弱并可以使用并不完全匹配的干細(xì)胞。
通常，在移植治療性干細(xì)胞單位之前，耗盡或減少存在于對象中的正常干 細(xì)胞群?？梢允褂没?、輻射或例如美國專利No. 6,217,867中所述的其他技術(shù) 使得骨髓達(dá)到適于移植物移植的要求。最后，可以使用常規(guī)方法將治療性干細(xì) 胞單位移植入患者體內(nèi)。
在一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞與制藥上允許的載體(優(yōu)選水性載體) 一起移 植?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如緩沖鹽溶液等等。這些溶液是無菌的并通常 不含不需要的物質(zhì)。治療性干細(xì)胞單位也可以包含適當(dāng)?shù)纳項l件所需的制藥 上允許的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如醋酸鈉、氯 化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、白蛋白、葡聚糖、DMSO、它們的組合等等。 輔助物質(zhì)的濃度可以變化很大，并且應(yīng)該根據(jù)所選擇的具體給藥模式和對象需 求主要在流體體積、粘性、體重等等的基礎(chǔ)上加以選擇。
實(shí)施例
將通過以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。提供以下實(shí)施例是為了舉 例說明的目的，并不意味著以任何方式對本發(fā)明加以限制。精通本領(lǐng)域的人員應(yīng)當(dāng)容易地識別可以改變或修改以產(chǎn)生基本相同結(jié)果的各種非關(guān)鍵參數(shù)。 實(shí)施例1.大鼠新生血細(xì)胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激
這一實(shí)施例顯示了鋰促進(jìn)從新生大鼠血液中分離的干細(xì)胞(N01.1細(xì)胞)的 增殖和生長因子產(chǎn)生。鋰也提高所移植的NOl.l細(xì)胞的存活和生長。 結(jié)果
體外。圖1顯示了鋰促進(jìn)NOl.l細(xì)胞的體外增殖。將NOl.l細(xì)胞在含有3mM 氯化鋰的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。對兩組細(xì)胞都進(jìn)行細(xì)胞數(shù)計數(shù)。氯化鋰組中 的細(xì)胞數(shù)比對照組高359%。鋰處理的NOU細(xì)胞仍是干蛋白(Nestin)陽性的。
圖2顯示了鋰刺激NOl.l細(xì)胞體外產(chǎn)生生長因子。通過定量實(shí)時PCR測定 了在含或不含3 mM氯化鋰的條件下培養(yǎng)的NOl.l細(xì)胞中諸如LIF、 BDNF、 GDNF、 NGFy和NGFp的生長因子的mRNA水平。LIF和NGFp mRNA水平明 顯高于對照組。NGFy、 BDNF和GDNF的mRNA水平之間沒有顯著差異。
體內(nèi)。25 mm高落重挫傷后立即移植GFP陽性NO 1.1細(xì)胞。每天用100 mg/kg 的氯化鋰腹膜內(nèi)注射大鼠2周。對照組每天用鹽水注射2周。2周后處死動物 用于RT-PCR和組織學(xué)分析。
圖3和4顯示了鋰促進(jìn)NOl.l細(xì)胞的體內(nèi)增殖。圖3中，通過定量實(shí)時PCR 測定了用鹽水或鋰處理的N01.1移植后兩周脊髓中的GFPmRNA水平。在鹽水 處理的大鼠中，GFPmRNA的量可以檢測到，但是非常低。然而在鋰處理的大 鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中高IOOO倍。圖4中，分離了所移 植的脊髓組織的基因組DNA并用GFP引物對進(jìn)行了基因組PCR分析。在鋰處 理的組織中，所擴(kuò)增的GFPDNA的量顯著高于對照組中所觀察到的量。
圖5顯示了鋰促進(jìn)NOl.l細(xì)胞的體內(nèi)存活。將GFP陽性NOl.l細(xì)胞移植入 受傷大鼠脊髓。2周后，處死大鼠并在Zeiss Stemi解剖顯微鏡下觀察脊髓。在 鹽水處理的大鼠中，GFP熒光強(qiáng)度低且彌散(圖5A-B)。然而在鋰處理的大鼠 中，GFP熒光強(qiáng)度高并占據(jù)兩大塊區(qū)域(圖5C-D)。為了進(jìn)一步對GFP-NOl.l 細(xì)胞的分布進(jìn)行評估，將相同的脊髓徑向切片。在鹽水處理的大鼠中，GFP陽 性NOl.l細(xì)胞稀少(圖5E)。相反，鋰處理的大鼠在挫傷中心具有大量GFP陽 性NOl.l細(xì)胞。
23圖6顯示了鋰刺激NOl.l細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生生長因子。為了研究鋰對細(xì)胞因子
產(chǎn)生的作用，通過定量實(shí)時PCR分析了 4組脊髓。在"損傷"和"損傷/LiCl"組中， 生長因子mRNA水平?jīng)]有明顯變化。在"損傷/N01.1"組中，BDNF、NT3和NGFy mRNA水平提高。在"損傷/N01.1/LiCl"組中，GDNF、 LIF、 BDNF、 NT-3、 NGF(5 和NGFNGFYmRNA水平顯著提高。這些結(jié)果說明，在N01.1細(xì)胞存在的情況 下，鋰刺激生長因子產(chǎn)生。
圖7顯示了脊髓損傷后鋰對神經(jīng)保護(hù)的影響。脊髓損傷后立即注射(腹腔 內(nèi))氯化鋰或鹽水。損傷24小時后測量損傷體積。鋰處理的和鹽水處理的大鼠 之間沒有觀察到顯著差異。
討論
檢測了脊髓損傷后鋰對干細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和組織保護(hù)的影響。使用從 新生大鼠血液中分離的用綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染的表達(dá)干蛋白的細(xì)胞系 (NOl.l)，測定了鋰對培養(yǎng)物中N01.1細(xì)胞增殖和植入受損脊髓中的NOl.l細(xì) 胞的影響。將NOl.l細(xì)胞在3mM鋰中培養(yǎng)導(dǎo)致1周后細(xì)胞數(shù)提高了 359%。在 25 mm挫傷后將NOl.l細(xì)胞移植入大鼠脊髓的情況下，它們沒有脫離控制生長 并且遵守脊髓的灰質(zhì)-白質(zhì)界線。移植兩周后，檢測移植部位的GFP mRNA水 平。在鹽水處理的大鼠中，可以檢測到GFPmRNA，但量很低。然而在鋰處理 的大鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中的高IOOO倍。組織學(xué)也顯示 用鋰處理的受損脊髓中具有更多的GFP陽性細(xì)胞。鋰處理的大鼠中諸如GDNF、 LIF、 BDNF、 NT-3、 NGF(3和NGFy的生長因子的mRNA量也較高。因此，這 一實(shí)施例說明，通過在體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖和刺激生長因子表達(dá)，鋰可以用于提 高所移植的干細(xì)胞的存活和生長。因此對于接受干細(xì)胞移植的患者的組合治療 是理想的。
方法
細(xì)胞特征。從野生型新生(PO) Sprague-Dawley (SD)大鼠的血液中分離NOl 細(xì)胞并用DMEM、 10%FBS、 EGF和bFGF培養(yǎng)。6周時，60%的N01細(xì)胞是 干蛋白陽性的?？寺z驗后，選擇具有100。/。干蛋白陽性的稱為N01.1的亞克 隆。N01.1可以長時間培養(yǎng)而不會發(fā)生形態(tài)或干蛋白標(biāo)記的改變。當(dāng)從生長培 養(yǎng)基中去除血清時，N01.1細(xì)胞形成類似于由神經(jīng)干細(xì)胞所形成的神經(jīng)球的球狀結(jié)構(gòu)(Sun，第一屆干細(xì)胞研究科學(xué)年會(ist Annual Scientific Metting on Stem Cell Research),新澤西，2004)。
體外培養(yǎng)。NO 1.1細(xì)胞用3 mM氯化鋰在DMEM、 10% FBS、 bFGF和EGF 中在37。C、 5%(302的加濕培養(yǎng)箱中處理7天。
體內(nèi)脊髓損傷/細(xì)胞移植。用綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染N01.1細(xì)胞。使用77+1 天大的SD大鼠。制造挫傷(MASCIS撞擊器，25mm高)，隨后用與Hamilton 注射器相連的玻璃微移液器在距離挫傷部位2 mm的兩個位置上合計脊柱內(nèi)注 射200,000個細(xì)胞(100,000個細(xì)胞/]uL)。
體內(nèi)鋰治療。每天將氯化鋰以每次注射100mg/kg的量腹膜內(nèi)給藥兩周。
定量實(shí)時PCR。為了評估移植后兩周所植入的GFP陽性N01.1細(xì)胞的細(xì)胞 存活，通過SYBR綠色熒光在Applied Biosystems 7900HT實(shí)時PCR系統(tǒng)(Foster City, CA)上測量GFP mRNA的量。測量了 N01.1細(xì)胞移植后脊髓中LIF、 BDNF、 NT3、 GDNF、 NGFy和NGF卩的mRNA水平。
損傷體積(LV)。為了評估鋰對組織保護(hù)的作用，根據(jù)以下公式測量了損 傷后24小時的損傷體積LV=0.75-([K]t - 4)/120 x體重(Constantini等，J A^wra犯rg.' 80:97-111 (1994))。
實(shí)施例2.人臍帶血細(xì)胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激 這一實(shí)施例顯示了鋰促進(jìn)從人臍帶血細(xì)胞所分離的干細(xì)胞的增殖和生長因 子產(chǎn)生。
圖8顯示了鋰在體外促進(jìn)人臍帶血細(xì)胞增殖。從新鮮的人臍帶血中分離人 單核細(xì)胞并在含有或不含有3 mM氯化鋰的含有胎牛血清(FBS)的生長培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。在為期8周的研究過程中，在鋰處理的培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)比對照培 養(yǎng)物中的高。雖然5周后在鋰處理的和對照培養(yǎng)物中的總細(xì)胞數(shù)都降低了，第 8周時鋰處理的培養(yǎng)物中明顯具有更多細(xì)胞。
圖9顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核 細(xì)胞。細(xì)胞在含有或不含有3mM氯化鋰的含有FBS的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在 第2和第4周進(jìn)行定量實(shí)時PCR以評價生長因子mRNA水平。與對照培養(yǎng)物 相比，第4周時鋰處理的培養(yǎng)物的生長因子mRNA水平(例如GDNF、 LIF、BDNF、 NT-3、 NGFp禾卩CNTF)提高了2-5倍。
圖IO顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核 細(xì)胞。細(xì)胞在含有或不含有3mM氯化鋰(Li)的含有人血清(HS)的生長培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第1和第2周進(jìn)行定量實(shí)時PCR以評價生長因子mRNA水平。 與對照培養(yǎng)物相比，在兩個時間點(diǎn)上鋰處理的培養(yǎng)物都表現(xiàn)出生長因子mRNA 水平(例如BDNF、 CNTF、 GDNF、 LIF、 NGF卩禾QNT-3)的顯著提高。
應(yīng)當(dāng)理解，以上描述是說明性的而不是限制性的。通過閱讀以上描述，許 多實(shí)施方式對于精通本領(lǐng)域的人員來說是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍不 是通過以上描述確定的，而是應(yīng)當(dāng)通過附屬的權(quán)利要求以及這樣的權(quán)利要求所 享有的權(quán)利的全部范圍的等價物所確定的。針對所有目的，包括專利申請、專 利、PCT公開以及Genbank登錄號在內(nèi)的所有文章和參考文獻(xiàn)通過應(yīng)用整合在 本說明書中。
權(quán)利要求
1.一種用于刺激人臍帶血細(xì)胞產(chǎn)生生長因子的方法，所述方法包括在含有鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述生長因子選自由細(xì)胞存活因子、抗分化因子、以及它們的組合所構(gòu)成的組。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述生長因子是選自下組的細(xì) 胞存活因子神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細(xì)胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生 生長因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、 以及它們的組合。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞存活因子是選自下組 的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、腦衍生 神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、睫狀神經(jīng) 營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、以及它們的組合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述生長因子是抗分化因子， 其中所述抗分化因子是白血病抑制因子(LIF)。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰 或硫酸鋰。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約0.5至約5 mM 的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約3 mM的濃度存 在與所述培養(yǎng)基中。
10. —種用于擴(kuò)展人臍帶血細(xì)胞的體外方法，所述方法包括在含有鋰鹽的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸 鋰或硫酸鋰。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
13. 如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約0.5至約5 mM的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
14. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養(yǎng)基中。
15. —種提高對象中所移植的人臍帶血細(xì)胞的存活和生長的方法，所述方法包括(a) 在含有鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞；以及(b) 給予所述對象步驟(a)的細(xì)胞。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
17. 如權(quán)利要求15所述的方法
18. 如權(quán)利要求15所述的方法 的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
19. 如權(quán)利要求15所述的方法 存在與所述培養(yǎng)基中。
20. 如權(quán)利要求15所述的方法
21. 如權(quán)利要求15所述的方法傷。
22. 如權(quán)利要求15所述的方法
23. 如權(quán)利要求15所述的方法 給予所述對象鋰鹽。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法
25. 如權(quán)利要求23所述的方法
26. 如權(quán)利要求23所述的方法其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。 其特征在于，所述鋰鹽以約0.5至約5 mM其特征在于，所述鋰鹽以約3mM的濃度其特征在于，所述對象是人。 其特征在于，所述對象已被診斷為脊髓損其特征在于，所述細(xì)胞以脊柱內(nèi)方式給予。 其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括(c)其特征 于，所述對象是人。 其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。 其特征在于，所述鋰鹽是通過選自口服、 鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)的途徑給予的。
27. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約1 mg/kg至 約150mg/kg的劑量給予的。
28. 如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約10 mg/kg 的劑量給予的。
29. —種用于降低對象中所移植的人臍帶血細(xì)胞的排斥的方法，所述方法包括在細(xì)胞移植后給予所述對象鋰鹽。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述對象已被診斷為脊髓損傷。
32. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸 鋰或硫酸鋰。
33. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
34. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是通過選自口服、 鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)的途徑給予的。
35. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約1 mg/kg至 約150 mg/kg的劑量給予的。
36.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約10 mg/kg 的劑量給予的。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用含鋰鹽的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來擴(kuò)展人臍帶血干細(xì)胞的方法和刺激臍帶血干細(xì)胞產(chǎn)生生長因子的方法。本發(fā)明還提供了通過在移植前用鋰鹽處理所述細(xì)胞來提高所移植的臍帶血干細(xì)胞的存活和生長的體內(nèi)方法。還提供了通過移植后用鋰鹽給藥來降低所移植的臍帶血干細(xì)胞的排斥的體內(nèi)方法。
文檔編號C12N5/0789GK101627114SQ200780046542
公開日2010年1月13日 申請日期2007年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日
發(fā)明者D·孫, W·揚(yáng) 申請人:羅格斯，新澤西州立大學(xué)