一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】的一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體(rhKGF-2M)的活性穩(wěn)定劑。本發(fā)明通過對保護劑的組合方式進行篩選，將乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸作為保護劑，將其溶于緩沖溶液中得到rhKGF-2M的活性穩(wěn)定劑。將rhKGF-2M加入到活性穩(wěn)定劑中，凍干后即可得到穩(wěn)定的rhKGF-2M活性組合物，在18個月內(nèi)仍維持98％以上的初始活性。本發(fā)明的活性穩(wěn)定劑能增加rhKGF-2M的穩(wěn)定性并長時間保持其生物學(xué)活性，為rhKGF-2M的后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑。
【背景技術(shù)】
[0002]角質(zhì)細胞生長因子2(KGF_2)也叫成纖維細胞生長因子_10 (FGF-10)，是FGFs家族中角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factors,KGFs)亞家族的一員。KGFs亞家族目前只有兩個成員，即KGF(FGF-7)和KGF-2，它們的蛋白序列及結(jié)構(gòu)相似性高，而且都能與上皮細胞表面的受體FGFR2IIIb特異性結(jié)合，并促進上皮細胞的生長、增殖和分化。其中KGF因?qū)Ψ呕熞鸬酿つp傷有非常好的保護作用已經(jīng)在2004年被美國FDA批準上市，而KGF-2同樣也進入到臨床試驗階段。
[0003]KGF-2能夠參與血管生成、機體的損傷反應(yīng)和修復(fù)、細胞的分化和遷移等眾多過程。動物實驗已表明，KGF-2在促進皮膚創(chuàng)口愈合，以及預(yù)防化療和放療過程引起的黏膜炎、治療潰瘍和腸炎等方面療效顯著。另外，KGF-2能降低輻射引起的局灶性肺炎和肺纖維化程度，還能夠保護毛囊干細胞，減少輻射造成的脫發(fā)。另外，KGF-2由于其受體的特異性，使它只具有黏膜損傷保護作用，卻沒有潛在的副作用。Alderson等對人的乳腺痛、卵巢癌、肺癌等30種癌細胞系進行的體內(nèi)外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)KGF-2并不促進這些腫瘤細胞生長，表明KGF-2只選擇性作用于正常上皮細胞而不促進腫瘤細胞的增殖，同時也不影響腫瘤細胞對放療的敏感性。
[0004]鑒于KGF-2在黏膜損傷防護及治療方面的獨特功效，目前已成為國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。美國的人類基因組科學(xué)公司(Human Genome Sciences, Inc.)曾經(jīng)開展多年的KGF-2的相關(guān)研究，除臨床前試驗外，該公司已經(jīng)完成I期臨床研究，證明了其安全性，另外針對三個適應(yīng)癥進行了 II期臨床試驗，一是靜脈潰瘍，二是骨髓移植前高劑量放化療引起的黏膜損傷修復(fù)，二是潰瘍性大腸炎。
[0005]我們在前期的研究中，系統(tǒng)地研究了 KGF-2的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過生物信息學(xué)和基因定點突變技術(shù)對KGF-2改構(gòu)，構(gòu)建并篩選獲得了高活性KGF-2突變體，已經(jīng)申請國家發(fā)明專利并獲得授權(quán)(國家發(fā)明專利授權(quán)號:ZL200410034009.0)。
[0006]在此基礎(chǔ)上我們建立并優(yōu)化了重組人KGF-2突變體(recombinant humankeratinocyte growth factor2mutant,簡稱rhKGF_2M)的制備與純化工藝，實現(xiàn)了高效可溶性表達，初步藥效學(xué)研究表明其對放射性黏膜損傷有顯著的治療作用，因此是一個很有前景的放射防護和治療藥物。但是該突變體的穩(wěn)定性較差，不易長期保存，因此需要添加活性穩(wěn)定劑來保存該制品。如果沒有合適的活性穩(wěn)定劑來增強其穩(wěn)定性并且保持其活性，將嚴重影響將來的臨床應(yīng)用。目前尚無明確的用于KGF-2突變體的活性穩(wěn)定劑配方。
[0007]參考其他生長因子類藥物，目前常用的蛋白保護劑如人血白蛋白或者牛血清白蛋白因為屬于血液來 源，有潛在的感染其它血源性疾病的風(fēng)險，故本制品不做優(yōu)先考慮；而非血液來源的甘露醇-蔗糖-檸檬酸緩沖體系則不能很好的維持本生物制品的活性，因此我們通過對緩沖體系、保護劑和其它添加劑等進行組合分析，篩選得到最佳的活性穩(wěn)定劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體(recombinanthuman keratinocyte growth factor2mutant,簡稱 rhKGF_2M)的活性穩(wěn)定劑，該劑型可以增強rhKGF-2M的穩(wěn)定性并保持其生物學(xué)活性。
[0009]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]一種rhKGF_2M的活性穩(wěn)定劑，由緩沖鹽溶液和保護劑組成；上述緩沖鹽溶液的pH為6.0-8.0 ;上述保護劑由乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸組成；在活性穩(wěn)定劑中，乳糖的濃度為Iwt % -2wt%，右旋糖酐40的濃度為3wt% _4wt%，甘氨酸的濃度為20_50mM。
[0011]一種優(yōu)選的rhKGF-2M的活性穩(wěn)定劑，在活性穩(wěn)定劑中，乳糖的濃度為lwt%，右旋糖酐40的濃度為3wt%，甘氨酸的濃度為20mM。
[0012]上述緩沖鹽溶液為檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0013]其中，磷酸鹽緩沖液的配方如下:磷酸氫二鈉:2.5-19.0mM ;磷酸二氫鈉:
1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaCl:10-150mM ；pH6.0-8.0。
[0014]進一步優(yōu)選的磷酸鹽緩沖液的配方如下:磷酸氫二鈉:15.4mM ;磷酸二氫鈉:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:1OOmM ；pH7.3。
[0015]本發(fā)明還提供一種rhKGF_2M的活性穩(wěn)定劑的制備方法，其步驟如下:首先根據(jù)上述配方，配置緩沖液；然后將乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于緩沖液中，得到重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑；在活性穩(wěn)定劑中，乳糖的終濃度為lwt% -2wt%，右旋糖酐40的終濃度為3wt% -4wt%，甘氨酸的終濃度為20-50mM。
[0016]進一步優(yōu)選的制備方法，步驟如下:配制20mM pH為7.3的磷酸鹽緩沖液，其配方如下:磷酸氫二鈉:15.4mM ;磷酸二氫鈉:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:100mM ;然后將乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于緩沖液中，得到重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑；在活性穩(wěn)定劑中，乳糖的濃度為Iwt %，右旋糖酐40的濃度為3wt%，甘氨酸的濃度為20mM。
[0017]本發(fā)明還提供一種包含rhKGF_2M的活性組合物，在上述活性穩(wěn)定劑中添加rhKGF-2M，凍干后得到包含rhKGF_2M的活性組合物。
[0018]其中，在活性穩(wěn)定劑中添加rhKGF-2M至其終濃度為2_5mg/ml。
[0019]若有rhKGF_2M粉末，可以直接將其加入到活性穩(wěn)定劑中。而通常制備得到的rhKGF-2M存在于緩沖液中，針對rhKGF_2M的溶液存在形式，rhKGF_2M的活性組合物按如下方法得到:
[0020](I)配置緩沖鹽溶液，將乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于其中，使乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸的終濃度為所述活性穩(wěn)定劑中各濃度的N倍，得到NX活性穩(wěn)定劑；
[0021](2)配置與步驟(1)中一致的緩沖鹽溶液，使重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體溶于其中，得到重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體溶液； [0022](3)將重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體溶液與NX活性穩(wěn)定劑按(N-1):1的體積比混合，使重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的終濃度為2-5mg/ml，凍干。
[0023]步驟(1)中的N優(yōu)選為2，2X活性穩(wěn)定劑的具體配置方法如下:配置緩沖液溶液，如20mM pH為6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，其配方如下:磷酸氫二鈉:2.5-19.0mM ;磷酸二氫鈉:1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaCl:10-150mM ;然后將乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于緩沖液中，乳糖的終濃度為2wt% -4wt%，右旋糖酐40的終濃度為6wt% _8wt%，甘氨酸的終濃度為40-100mM，得到2X活性穩(wěn)定劑。
[0024]在進行后續(xù)凍干時，將加入rhKGF_2M的活性穩(wěn)定劑分裝，如每瓶分裝2_5ml，按常規(guī)方法進行凍干處理，即可以得到每瓶約IOmg的rhKGF-2M的活性組合物。
[0025]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明通過篩選緩沖液與保護劑的組合，得到一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體(rhKGF-2M)的活性穩(wěn)定劑，其可以在18個月內(nèi)仍保持98%以上的活性。本發(fā)明的活性穩(wěn)定劑能增加rhKGF-2M的穩(wěn)定性并長時間保持其生物學(xué)活性，為rhKGF-2M的后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明:
[0027]實施例1
[0028]將保護劑乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶于不同的緩沖液體系中，溶解后乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸的濃度分別均為1被％、3被(％和201111，然后將^11---21溶于其中。在2-8°C環(huán)境下放置2周后，測定其生物學(xué)活性，結(jié)果如表1所示。磷酸鹽緩沖液和保護劑合用具有最佳的穩(wěn)定效果，處理后的rhKGF-2M的仍有98%的初始活性；檸檬酸鹽緩沖液和保護劑合并的效果次之，但處理后的rhKGF-2M的仍有92%以上的初始活性。
[0029]表1不同緩沖體系與保護劑的組合對穩(wěn)定效果的影響
【權(quán)利要求】
1.一種重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑，其特征在于，由緩沖鹽溶液和保護劑組成；所述緩沖鹽溶液的PH為6.0-8.0 ;所述保護劑由乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸組成；在活性穩(wěn)定劑中，乳糖的濃度為1wt % -2wt%，右旋糖酐40的濃度為3wt% -4wt%,甘氨酸的濃度為20_50mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑，其特征在于，在所述活性穩(wěn)定劑中，乳糖的濃度為lwt%，右旋糖酐40的濃度為3wt%，甘氨酸的濃度為 20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑，其特征在于，所述緩沖鹽溶液為檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的配方如下:磷酸氫二鈉:2.5-19.0mM ;磷酸二氫鈉:1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaC l:10-150mM ；pH6.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性穩(wěn)定劑，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的配方如下:磷酸氫二鈉:15.4mM ;磷酸二氫鈉:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:1OOmM ；pH7.3。
6.一種包含重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體的活性組合物，其特征在于，在權(quán)利要求I中所述的活性穩(wěn)定劑中添加重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體，凍干后得到所述活性組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的活性組合物，其特征在于，在所述活性穩(wěn)定劑中添加重組人角質(zhì)細胞生長因子-2突變體至其終濃度為2-5mg/ml。
【文檔編號】C07K14/50GK103923208SQ201410166013
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】陳惠華, 鄒民吉, 徐東剛, 徐濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所