專利名稱：：新的n-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶以及使用該酶生產(chǎn)cmp-神經(jīng)氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和用于生產(chǎn)CMP-神經(jīng)氨酸的方法，更具體涉及來源于脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶生產(chǎn)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：近來，由于對糖鏈的結(jié)構(gòu)和功能的研究迅速發(fā)展，寡聚糖、糖脂和糖蛋白以及類似物的生理活性及作為藥物或功能物質(zhì)的使用的發(fā)展受到人們的關(guān)注。其中，末端具有N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的含唾液酸的糖鏈具有重要的功能，諸如在細(xì)胞粘著或者病毒感染時起到受體的作用。含唾液酸的糖鏈一般通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化合成。唾液酸轉(zhuǎn)移酶是使用CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)作為糖供體將唾液酸轉(zhuǎn)移到受體，諸如糖鏈的酶。但是，被用作糖供體的CMP-NeuAc非常昂貴，并且僅僅供應(yīng)以僅僅足夠用作試劑的很少的量。已知的用于生產(chǎn)CMP-NeuAc的方法包括使用5'-胞苷三磷酸(CTP)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)作為底物通過CMP-NeuAc合成酶的作用合成CMP-NeuAc，但被用作生產(chǎn)CMP-NeuAc的原材料CTP和NeuAc非常昂貴，因此使用這些材料合成的CMP-NeuAc也非常昂貴。近來，發(fā)展了將乳清酸轉(zhuǎn)化成尿嘧啶5，-三磷酸(UTP)的產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)與生產(chǎn)催化UTP轉(zhuǎn)化成CTP的反應(yīng)的CTP合成酶的重組大腸桿菌和生產(chǎn)CMP-NeuAc合成酶的重組大腸桿菌組合，并在重組有機(jī)體中使用乳清酸和NeuAc作為原材料合成CMP-NeuAc的方法。雖然該方法沒有使用昂貴的CTP，但其并不被認(rèn)為是一種實(shí)用的方法，因?yàn)樵撨^程很復(fù)雜，例如，由于使用多種細(xì)菌菌株制備重組菌株，必須準(zhǔn)備用于實(shí)施該過程的很大尺寸的操作臺，并且仍然需要用昂貴的NeuAc作為原材料。同時，關(guān)于NeuAc的制備，包括從微生物中收集作為唾液酸聚合物的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸(colominicacid)并將收集的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸化學(xué)分解的方法是已知的，然而使用酶催化生產(chǎn)NeuAc的方法是新近才發(fā)展起來的。已經(jīng)報道的生產(chǎn)CMP-神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的方法包括(1)通過N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)使用N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶或者N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶催化生產(chǎn)CMP-NeuAc的方法(J.Am.Chem.Soc.,110:6481，1988;J.Am.Chem.Soc.，110:7159，1988;日本專利公開10-4961);(2)在堿性條件下通過將N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)轉(zhuǎn)化成N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)并將N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶或者N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶加入到其中以生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的方法(日本專利公開5-211884;Biotechnol.Bioeng.,66:2,1999;EnzymeMicrob.Technol.,20,1997)，(3)使用催化GlcNAc轉(zhuǎn)化成MamNAc的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶，和NeuAc裂解酶或合成酶由GlcNAc生產(chǎn)CMP-NeuAc的方法(WO95/26399;日本專利公開3-180190;日本專利公開2001-136982);以及(4)使用大腸桿菌和酵母菌合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法(WO2004/009830)。但是，方法(l)具有的問題在于原材料N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)很貴，方法(2)使用廉價的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，但具有的問題在于從GlcNAc和N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)的混合物中純化ManNAc的過程很復(fù)雜。而且，方法(3)具有的問題在于，由于GlcNAc2-表異構(gòu)酶需要昂貴的ATP，ATP必須被加入或者必須利用微生物由ATP前體腺嘌呤生產(chǎn)，方法(4)具有的問題在于，該過程由于使用大腸桿菌和酵母細(xì)胞而非常復(fù)雜。N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶已知在豬或鼠的腎臟、肝臟、脾、大腦、腸液、胸腺、胰腺、唾液腺中被發(fā)現(xiàn)，其性質(zhì)已經(jīng)使用來源于豬的酶進(jìn)行了檢査，并且表異構(gòu)酶主要從來自動物的基因中提取并進(jìn)行研究(Biochemistry,17:3363,1970;Biochem.J.，210:21,1983;PNAS，52:371，1964)。而且，作為來源于豬的基因的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶基因是已知的(J.Biol.Chem.,271:16294,1996)。在微生物中，一種藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)，集胞藻屬(Synechocystissp.)PCC6803的全基因組序列被測定，并且從基因組中確認(rèn)了N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的基因序列(DNAResearch,3:109,1996;NucleicAcidsResearch,26:63,1998)。同時，韓國專利公開10-2001-0102019涉及N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和編碼該酶的DNA，并公開了該發(fā)明的發(fā)明人在一種藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)，集胞藻屬(Synechocystis)中發(fā)現(xiàn)的N-乙酰葡糖胺曙2-表異構(gòu)酶并且使用DNA編碼該N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的的方法。而且，韓國專利公開10-2006-0010706公開了如下生產(chǎn)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法通過將胞苷酸(CMP)、N-乙酰葡糖胺、丙酮酸和酵母加入到用含有由編碼N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的基因和編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因的共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組菌株中，從而產(chǎn)生神經(jīng)氨酸，然后將CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶加入到產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸中；或者通過將胞苷酸(CMP)、N-乙酰葡糖胺、丙酮酸和酵母加入到用含有由編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因和編碼CMP-N-乙酰葡糖胺合成酶的基因的共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組菌株中。但是，該方法具有的問題在于，其中需要多個步驟來產(chǎn)生CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸，并且用作底物的胞苷酸(CMP)轉(zhuǎn)化成胞苷三磷酸(CTP)的產(chǎn)量很低。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出了極大的努力來開發(fā)以經(jīng)濟(jì)簡單的方式生產(chǎn)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人在脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343中發(fā)現(xiàn)了新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶并確定CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可通過一鍋式反應(yīng)(one-potreaction)高濃度生產(chǎn)，所述反應(yīng)使用多種底物和酶的混合物，包括N-乙酰葡糖胺-2-異構(gòu)酶，所述酶通過將表達(dá)該酶的基因轉(zhuǎn)化到重組載體中得到，廉價底物胞苷酸(CMP)和非常少量的NTP，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于提供新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和用于制備N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)用含有編碼所述酶的重組載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。本發(fā)明的另一目的在于提供通過使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶以及多種底物和酶的混合物的一鍋式反應(yīng)制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了具有氨基酸序列為SEQIDNO:2的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶。本發(fā)明還提供了編碼所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的基因，含有所述基因的重組載體，轉(zhuǎn)化有所述重組載體的重組微生物，以及制備所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述重組微生物；并回收N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶。本發(fā)明還提供了制備N-乙酰-D-甘露糖胺的方法，所述方法包括將含有N-乙酰-D-葡糖胺的反應(yīng)混合物在所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)并回收所述N-乙酰-D-甘露糖胺。本發(fā)明還提供了制備神經(jīng)氨酸的方法，所述方法包括將含有丙酮酸和N-乙酰-D-甘露糖胺的反應(yīng)混合物在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)的存在下進(jìn)行反應(yīng)；并回收所述神經(jīng)氨酸。本發(fā)明還提供了制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，所述方法包括將含有下列物質(zhì)的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)(i)胞苷5，-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，所述反應(yīng)在下列物質(zhì)存在下進(jìn)行(a)N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcNAc2-表異構(gòu)酶)，(b)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)；并且回收所述CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸。通過下列詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和方面將是顯而易見的。圖1是顯示合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的過程的示意圖。圖2顯示了含有N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶-編碼基因(nanE)的重組載體。圖3顯示了含有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶-編碼基因(nan)的重組載體。圖4顯示了含有5'磷酸激酶-編碼基因(cmk)的重組載體。圖5顯示了含有醋酸激酶-編碼基因(ack)的重組載體。圖6顯示了含有CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶-編碼基因(neu)的重組載體。圖7顯示了所進(jìn)行的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析的結(jié)果，以檢査每種酶是否被表達(dá)(第1道標(biāo)記物；第2道胞苷5，磷酸激酶；第3道醋酸激酶；第4道CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶；第5道N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶；第6道乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶)。圖8顯示了所進(jìn)行的十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析的結(jié)果，以檢査每種純化的酶是否被表達(dá)(第l道標(biāo)記物；第2道純化胞苷5'磷酸激酶；第3道純化醋酸激酶；第4道純化CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶；第5道純化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶；第6道純化乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶)。圖9顯示了CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的^核磁共振。HNMR)分析結(jié)果。圖10顯示了CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果。發(fā)明詳述以及優(yōu)選實(shí)施例在一個方面，本發(fā)明涉及在CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成中涉及的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶，編碼所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的基因，含有所述基因的重組載體，用所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組微生物，以及制備N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述重組微生物。在本發(fā)明中，所述基因優(yōu)選具有SEQIDNO:l的堿基序列。所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶是來源于脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的酶，并且顯示與集胞藻屬(Synechocystissp.)和多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的相應(yīng)基因具有35.06-32.9%的相似性。在另一方面，本發(fā)明涉及制備N-乙酰-D-甘露糖胺和神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶。在還一方面，本發(fā)明涉及通過使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的一鍋式反應(yīng)制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可通過允許下列反應(yīng)混合物來生產(chǎn)(i)胞苷5，-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，在下列物質(zhì)存在下發(fā)生反應(yīng)來生產(chǎn)(a)N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcNAc2-表異構(gòu)酶)，(b)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸9激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)。根據(jù)本發(fā)明，胞苷三磷酸(CTP)由廉價底物胞苷酸(CMP)通過CMP激酶和醋酸激酶經(jīng)胞苷二磷酸(CDP)以高于97%的產(chǎn)量來合成。作為用于所述CDP的磷酸供體，非常少量的NTP被使用，并且NDP很節(jié)約，因?yàn)槠浔贿^量乙酰Pi和醋酸激酶重新被利用。特別是，在本發(fā)明中，在反應(yīng)完成之后用于除去作為雜質(zhì)的ADP殘余物的復(fù)雜過程可通過使用CTP來代替ATP作為用于CDP的磷酸供體而被消除。而且，根據(jù)本發(fā)明，N-乙酰-D-葡糖胺(GlacNAc)由N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，并且由ManNAc和丙酮酸通過NeuAc醛縮酶合成神經(jīng)氨酸。上述合成的CTP和神經(jīng)氨酸由CMP-NeuAc合成酶合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(圖l)。在本發(fā)明中，所述核苷三磷酸(NTP)或者ATP優(yōu)選由乙酰Pi和醋酸激酶再生，所述核苷三磷酸(NTP)優(yōu)選為胞苷三磷酸(CTP)。在本發(fā)明中，所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、胞苷5'磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶優(yōu)選被固定于載體上，并且所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、胞苷5，磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶優(yōu)選分別由堿基序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:5,SEQIDNO:8,SEQIDNO:11andSEQIDNO:14編碼。根據(jù)本發(fā)明，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成成本可極大地降低，因?yàn)镃MP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可通過純化每種高表達(dá)酶并將純化的酶固定在聚合物小珠，諸如幾丁質(zhì)上，在一步工序中被合成，不需要進(jìn)行重復(fù)的合成步驟。酶的固定可使用常規(guī)酶固定化方式(共價結(jié)合，使用多官能團(tuán)試劑交聯(lián)，吸附，微囊化等等)來進(jìn)行。酶的純化可使用常規(guī)酶純化方式來進(jìn)行(鹽析，等電點(diǎn)沉淀，透析，各種色譜過程，等等)，使用所述純化工藝得到的輔酶或者純化的酶可被使用，并且將所述酶固定在聚合物小珠上的過程可使用常規(guī)的酶固定化過程來進(jìn)行。使用所述過程純化的酶在其被固定在聚合物小珠上的狀態(tài)下可被使用20次以上，因此回收酶的成本降低，其回收步驟被簡化。根據(jù)本發(fā)明，將所述各種底物和酶的混合物進(jìn)行一鍋式反應(yīng)，因此，每種酶的反應(yīng)能力可被最大化，并且CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可以超過900/0的高產(chǎn)量被合成，即便使用很少量的酶和底物也是如此。特別值得一提的是，在其中N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶單獨(dú)反應(yīng)的情況下，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成產(chǎn)量將低于50%，但當(dāng)進(jìn)行一鍋式反應(yīng)時，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可以超過90%的高產(chǎn)量被合成。在本發(fā)明中使用的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、CMP激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶是已知的酶，并且可按照常規(guī)方式來制備。但是，優(yōu)選使用重組DNA技術(shù)來制備這些酶，包括所述基因的克隆，含有克隆的DNA片段的重組載體的構(gòu)建，含有被引入到其中的重組載體的轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建，以及通過轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的目標(biāo)酶蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞沒有特別的限制，但考慮到操作和方便，優(yōu)選使用大腸桿菌。作為在本發(fā)明中使用的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶，使用從脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶編碼基因。脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC的基因組DNA的全部序列被測定(US7,090,973)，但N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的功能仍然未知。在本文中，術(shù)語"載體"指的是含有DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述DNA序列可操作地與能夠影響DNA在合適宿主中的表達(dá)的合適控制序列連接。載體的例子包括質(zhì)粒、噬菌體粒子或者簡單的潛在基因插入物。一旦被轉(zhuǎn)化到合適宿主中，載體可復(fù)制并獨(dú)立于宿主基因組起作用，或者在一些情況下可整合到基因組本身中。在本文中，術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"有時候被互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常用的載體形式。出于本發(fā)明的目的，優(yōu)選使用質(zhì)粒載體?？捎糜谠撃康牡牡湫唾|(zhì)粒載體包括如下(a)復(fù)制起點(diǎn)，通過其有效地發(fā)生復(fù)制，使每個宿主細(xì)胞中數(shù)百個質(zhì)粒載體被形成；(b)抗生素抗性基因，使用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞通過其可被選擇；和(c)限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)，外源DNA片段可插入到其中。即便合適的限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn)在載體中不存在，常規(guī)合成的寡核苷酸接頭或連接子的使用也使載體和外源DNA片段之間很容易連接(ligation)。在連接之后，載體應(yīng)當(dāng)被轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化可以使用公知的氯化鈣法很容易實(shí)現(xiàn)。選擇性電轉(zhuǎn)化(Neumann等人，EMBOJ.，1:841，1982)也可在所述宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中使用。為了大量的表達(dá)基因，本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體可在本發(fā)明中使用。當(dāng)核酸被設(shè)置成與另一核酸序列成功能關(guān)系時，其"可操作地連接"。"可操作地連接"意味著，基因和一個或多個調(diào)節(jié)序列以這種方式連接當(dāng)合適分子(例如轉(zhuǎn)錄活化蛋白)結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上時允許基因表達(dá)。例如，如果DNA被表達(dá)為在參與多肽分泌中的蛋白質(zhì)，用于前置序列或者分泌型前導(dǎo)序列可操作地連接到用于多肽的所述DNA;如果編碼序列影響序列的轉(zhuǎn)錄，啟動子或增強(qiáng)子可操作地與該編碼序列連接；或者如果編碼序列被定位以便翻譯，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地與該編碼序列連接。一般說來，"可操作地連接"的意思是被連接的DNA序列是相鄰的，并且在分泌型前導(dǎo)序列的情況下，相鄰并在開放閱讀框中存在。但是，增強(qiáng)子不一定要相鄰。連接通過在常規(guī)限制位點(diǎn)連接來實(shí)現(xiàn)。如果所述位點(diǎn)不存在，合成的寡核苷酸接頭或者連接子按照常規(guī)實(shí)踐被使用。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說公知的是，為了增加轉(zhuǎn)染的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，基因應(yīng)當(dāng)可操作地連接到可在所選表達(dá)宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列中。優(yōu)選地，相應(yīng)基因和表達(dá)控制序列包含在包括選擇性標(biāo)記物和復(fù)制起始區(qū)的表達(dá)載體中。當(dāng)表達(dá)宿主是真核細(xì)胞時，表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步包括在真核表達(dá)宿主細(xì)胞中有用的表達(dá)標(biāo)記物。使用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。在本文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指的是將DNA引入到宿主細(xì)胞中，使DNA可復(fù)制，或者作為構(gòu)成染色體的一部分(integrant)或者作為染色體外構(gòu)件。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明中提到的載體在表達(dá)DNA序列的功能并不相同。同樣地，對于相同的表達(dá)系統(tǒng)，所用到的宿主細(xì)胞也不能起到完全一樣的作用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的載體，表達(dá)控制序列和宿主細(xì)胞，而不背離本發(fā)明的精神，并且不需要過度的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。例如，在載體的選擇中，宿主細(xì)胞必須被考慮。這是因?yàn)檩d體將會在其中復(fù)制。而且，載體的復(fù)制數(shù)和控制復(fù)制數(shù)的能力以及由載體編碼的其他蛋白質(zhì)例如抗生物標(biāo)記物的表達(dá)應(yīng)當(dāng)被考慮。實(shí)施例此后，將參照實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，這些實(shí)施例僅僅用于說明的目的，而不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1:基因的克隆和轉(zhuǎn)化1-1:編碼N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的nanE基因(SEOIDNO:1)的克隆和轉(zhuǎn)化為了消除將N-乙酰-D-葡糖胺異構(gòu)化成N-乙酰-D-甘露糖胺的步驟(其在實(shí)現(xiàn)增加CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本的目標(biāo)中作為最大問題指出)，N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcNAc2表異構(gòu)酶)從各種來源尋找。三種N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶狀基因從厭氧微生物脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343(NC—003228)中被發(fā)現(xiàn)。13用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的候選基因No.l位于947856-949034的區(qū)域中，具有1179bp大小，并顯示了與苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)和人類(Homosapiens)的相應(yīng)基因具有23.68-24.44%的相似性。用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的候選基因No.2位于1996625-1997809的范圍內(nèi),具有1185bp的大小，并顯示了與集胞藻屬(Synechocystissp).禾卩多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的相應(yīng)基因具有35.06-32.9%的相似性。用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的候選基因No.3位于4765592-4766353的范圍內(nèi),具有762bp的大小，并顯示了與紅小梨形菌屬(Rhodopirellulabaltica)和集胞藻屬(Synechocystissp)的相應(yīng)基因具有48.18-34.97%的相似性。將每個基因插入到pET表達(dá)載體(Novagen)中，所述表達(dá)載體然后被轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS表達(dá)菌株中。結(jié)果，觀察到用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的候選基因No.l和2高表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)，但候選基因No.3不表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)，但表達(dá)為不溶性蛋白質(zhì)。為了檢測高表達(dá)候選基因No.l和2的活性，用于表達(dá)N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的候選基因No.l和2以及其活性被測定，使用N-乙酰-D-葡糖胺和丙酮酸作為底物在一步法過程中發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的神經(jīng)氨酸使用糖分析系統(tǒng)(Metrohm)進(jìn)行分析。結(jié)果，可以看到，用于表達(dá)N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的候選基因No.l沒有活性，而用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶候選基因No.2具有非常好的活性。而且，將候選基因的活性在相同條件下(50mMN-乙酰D-葡糖胺，100-200mM丙酮酸10mMMgCl2,50mM-100mMTrisHC1,30-40°C)與人N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(有機(jī)體="Homosapiens,ene="RENBP",由_編碼="NM—002910.4:203..1456")的活性進(jìn)行比較，結(jié)果，用于N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶候選基因No.2顯示了非常高的反應(yīng)速度和產(chǎn)量。因此，候選基因No.2被選擇作為N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶。為了克隆編碼N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcNAc-表異構(gòu)酶)的nanE基因(SEQIDNO:2)使用脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的染色體DNA作為模板和SEQIDNO:3以及SEQIDNO:4作為引物通過PCR擴(kuò)增SEQIDNO:3:5'-ctgccatggttatgaatactacagSEQIDNO:4:5'-aatggatecttatttttctgacagPCR擴(kuò)增使用lpl(10pmol)的DNA，1^1的每種引物，4^1的Primix(Genotech)和l化l的蒸餾水在防蒸發(fā)(Mastercycler)梯度PCR系統(tǒng)(Ependorf)中進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)在96'C下變性1min，在40.2t:下退火lmin并在72。C下延伸2min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)粒微-沉淀試劑盒(plasmidmini-prepkit，Solgent)純化，然后通過加入70。/。的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析以純化1.2-kb的DNA片段。純化的DNA使用限制性內(nèi)切酶Ncol和BamHI消化，并使用連接酶與使用相同的限制性內(nèi)切酶Ncol和BamHI消化的質(zhì)粒pET28a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)連接(圖2)。重組載體被引入到大腸桿菌XL-Blue中以得到抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化體，從而從其中分離質(zhì)粒pNANEe。pNANEe質(zhì)粒是其中含有脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)的nanE基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段被插入到pET28a(+)的T7啟動子的NcoI-BamHI消化位點(diǎn)下游的質(zhì)粒。使用通過氯化鈣處理將質(zhì)粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159，1970)將重組基因引入到高表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)中。得到的轉(zhuǎn)化體被命名為"E.coli/pNANe"。1-2:編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的nanA基因的克隆和轉(zhuǎn)化為了克隆編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的nanA基因(SEQIDNO:5)，nanA基因使用大腸桿菌K-12C600的染色體DNA作為模板和SEQIDNO:6以及SEQIDNO:7作為引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增SEQIDNO:6:5'-ggtatccatggcaacgaatttacgSEQIDNO:7:5'-ggtaggctcgagcgaggggaaacPCR擴(kuò)增使用lnl(10pmol)的DNA，的每種引物，4^1的Primix(Genotech)和14^1的蒸餾水在Mastercycler梯度PCR系統(tǒng)(Ependorf)中進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)在96'C下變性1min，在50.2'C下退火lmin并在72'C下延伸2min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)粒微-沉淀試劑盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)純化，然后通過加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析以純化0.9-kb的DNA片段。純化的DNA使用限制性內(nèi)切酶Ncol和Xhol消化，并使用連接酶與使用相同的限制性內(nèi)切酶Ncol和Xhol消化的質(zhì)粒pET32a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)連接(圖3)。得到的載體被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-Blue中以得到抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體，從而從其中分離質(zhì)粒pNANa。pNANa質(zhì)粒是其中含有E.coliK-12C600的nanE基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段被插入到pET32a(+)的T7啟動子的Ncol-Xhol消化位點(diǎn)下游的質(zhì)粒。使用通過氯化鈣處理將質(zhì)粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159，1970)將重組基因引入到高表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的轉(zhuǎn)化體被命名為"E.coli/pNANa"。1-3:編碼胞苷5'-磷酸激酶的cmk基因的克隆和轉(zhuǎn)化為了克隆編碼胞苷5，-磷酸激酶的cmk基因(SEQIDNO:8)，cmk基因使用大腸桿菌K-12的染色體DNA作為模板和SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10作為引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增SEQIDNO:9:5'-catatgacggcaattgccccggttattacSEQIDNO:10:5'-gaattcggtcgcttatgcgagagecPCR擴(kuò)增使用lpl(10pmol)的DNA，lpl的每種引物，4pl的Primix(Genotech)和14^1的蒸餾水在Mastercycler梯度PCR系統(tǒng)(Ependorf)中進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)在96X:下變性1min，在55.7'C下退火lmin并在72。C下延伸2min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)粒微-沉淀試劑盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)純化，然后通過加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析以純化0.7-kb的DNA片段。純化的DNA使用限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化，并使用連接酶與使用相同的限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化的質(zhì)粒pET22b(+)(Novagen)T4DNA(Takara)連接(圖4)。得到的載體被引入到大腸桿菌XL-Blue中以得到抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體，從而從其中分離質(zhì)粒pCMK。質(zhì)粒pCMK是其中含有E.coliK-12C600的cmk基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段被插入到pET22b(+)的T7啟動子的Ndel和EcoRI消化位點(diǎn)下游的質(zhì)粒。使用通過氯化鈣處理將質(zhì)粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159,1970)將重組基因引入到高表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的轉(zhuǎn)化體被命名為"E.coli/pCMK"。1-4:編碼醋酸激酶的ack基因的克隆和轉(zhuǎn)化為了克隆編碼醋酸激酶的ack基因(SEQIDNO:11)，ack基因使用大腸桿菌K-12的染色體DNA作為模板和SEQIDNO:12以及SEQIDNO:13作為引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增SEQIDNO:12:5'-catatgtcgagtaagttagtttctgSEQIDNO:13:5'-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtcPCR擴(kuò)增使用liil(lOpmol)的DNA，1|^的每種引物，4pi的Primix(Genotech)和14^il的蒸餾水在Mastercycler梯度PCR系統(tǒng)(Ependorf)中進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)在96""C下變性1min，在58/TC下退火lmin并17在72。C下延伸2min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)粒微-沉淀試劑盒(plasmidmini-prepkit，Solgent)純化，然后通過加入70。/。的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析以純化1.2-kb的DNA片段。純化的DNA使用限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化，并使用連接酶與使用相同的限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化的質(zhì)粒pET24ma(+)(Novagen)T4DNA(Takara)連接(圖5)。得到的載體被轉(zhuǎn)化引入到大腸桿菌XL-Blue中以得到抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化體，從而從其中分離質(zhì)粒pACKa。質(zhì)粒pACKa是其中含有E.coliK-12C600染色體DNA的ack基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段被插入到pET24ma(+)的T7啟動子的Ndel和EcoRI消化位點(diǎn)下游的質(zhì)粒。使用通過氯化鈣處理將質(zhì)粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159,1970)將重組基因引入到高表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的轉(zhuǎn)化體被命名為"E.coli/pACKa"。1-5:編碼CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的neu基因的克隆和轉(zhuǎn)化為了克隆編碼CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的neu基因(SEQIDNO:14)，neu基因使用腦膜炎球菌(Neisseriameningitides)(KoramBiotech)的染色體DNA作為模板和SEQIDNO:15以及SEQIDNO:16作為引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增SE(^IDNO:15:5'-aagcatatggaaaaacaaaatattgcgSEQIDNO:16:5'-gtggaattcttagctttccttgtgPCR擴(kuò)增使用lpl(10pmol)的DNA，1^1的每種引物，化l的Primix(Genotech)和14|il的蒸餾水在Mastercycler梯度PCR系統(tǒng)(Ependorf)中進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)在96'C下變性1min，在57.7'C下退火lmin并在72'C下延伸2min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)粒微-沉淀試劑盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)純化，然后通過加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳分析以純化0.7-kb的DNA片段。純化的DNA使用限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化，并使用連接酶與使用相同的限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI消化的質(zhì)粒pET32a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)連接(圖6)。得到的載體被引入到大腸桿菌XL-Blue中以得到抗氨節(jié)青霉素的轉(zhuǎn)化體，從而從其中分離質(zhì)粒pSYNb。質(zhì)粒pSYNb是其中含有腦膜炎球菌(Neisseriameningitides)的synB基因的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段被插入到pET24ma(+)的T7啟動子的Ndel和EcoRI消化位點(diǎn)下游的質(zhì)粒。使用通過氯化鈣處理將質(zhì)粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.，53:159,1970)將重組基因引入到高表達(dá)菌株大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)中。得到的轉(zhuǎn)化體被命名為"E.coli/pSYNb"。實(shí)施例2:酶表達(dá)分析將通過在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)每種轉(zhuǎn)化體E.coli/pNANe,E.coli/pNANa,E.coli/pCMK,E.coli/pACKa禾卩E.coli/pSYNb得到的500ml種子培養(yǎng)物接種到5升的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞濃度(OD,)達(dá)到大約3-5時，收獲細(xì)胞。含有各種酶的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件在下表1中顯示。收獲的細(xì)胞使用超聲破碎儀(disruptor)或者法式壓濾壺(Frenchpress)破碎，然后每種酶的表達(dá)通過十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析(圖7)。結(jié)果，可以觀察到由插入到每種轉(zhuǎn)化體中的基因編碼的酶被大量的表達(dá)。表l:制備每種酶的菌株的培養(yǎng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例3:酶的純化將所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcAc2-異構(gòu)酶)，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuAc醛縮酶),胞苷5'-磷酸激酶，醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)使用硫酸銨沉淀并使用離子交換樹脂柱純化(蛋白質(zhì)純化技術(shù)"Proteinpurificationtechniques"，第二版,OxfordUniversityPress，2001)。用于每種酶沉淀的硫酸銨的濃度可在30-80%的范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)節(jié)。每種酶使用硫酸銨在低于l(TC的冰箱中，優(yōu)選的是3-5"C，并攪拌l-5小時被沉淀。將沉淀的酶溶解在微量的50mMTrisHCI(pH7.5)緩沖液中并通過透析膜脫鹽。純化并濃縮的酶溶液在填充有強(qiáng)離子交換樹脂的UNOsphereQ(Bio-RAD)柱上使用洗脫液A(20mMTrisHCI(pH7.5))和洗脫液B(20mMTrisHCl/lMNaCl(pH7.5))作為洗脫液梯度洗脫來純化。純化的酶通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析(圖8)。實(shí)施例4:酶的固定將3升2.5%的戊二醛加入到lkg(大約l升)的聚合物小珠中，然后在室溫下攪拌2小時以活化聚合物小珠?；罨木酆衔镄≈楸贿^濾然后清洗，并將實(shí)施例3中純化的每種酶以每克聚合物小珠3mg的量加入到聚合物小珠中。然后，將混合物在室溫下攪拌6小時以將酶固定在聚合物小珠上。酶固定化的程度和量參考Bradford法(Anal.Biochem.,72:248,1976)進(jìn)行分析。實(shí)施例5:CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成將使用2MNaOH在37。C下保持pH6.5-8.0的20-100g的20-80mM胞苷5'-磷酸(CMP，ShanghaiQZUBioscience&Biotechnology),34.15-136.6g的20-80mMN-乙酰-D-葡糖胺(ShanghaiJiubangChemical),33.9-101.7g的40-120mM丙酮酸，30.9g的20mMMgCl2H20(Duksan),3.72g的1mMCTP(Sigma),84-525g的80-500mM乙酰磷酸(Sigma)和7升的50mMTrisHCl緩沖液(pH7.0)與在實(shí)施例4中制備的聚合物小珠混合，所述聚合物小珠上固定有胞苷磷酸激酶(CMK)、醋酸激酶(ACK)、NeuAc醛縮酶(NAN)、CMP-NeuAc合成酶(NEU)和GlcNAe-2-表異構(gòu)酶。然后，將混合物在反應(yīng)器中攪拌5-12小時。為了分離并檢測反應(yīng)上清液，Thermo42柱(ThermoElectronCorporation)被使用，并且使用洗脫液A(IOOmM101204/1^21^04)和洗脫液B(甲醇)以90%(洗脫液A):10%(洗脫液B)的比例進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)。結(jié)果，可以看到，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸以大約90%的產(chǎn)量被合成。實(shí)施例6:CMP-神經(jīng)氨酸的純化將在實(shí)施例5中合成的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸注入到陰離子交換樹脂柱(Dowex-lx2;C廣形式)的上部，并用鹽濃度梯度洗脫。所需材料的洗脫百分比再次被濃縮并通過葡聚糖(SephadexG-10)凝膠滲透脫鹽，從而得到高純度的終產(chǎn)物。產(chǎn)物通過冰凍干燥濃縮。通過每個純化步驟并通過核磁共振(NMR)和高效液相色譜(HPLC)分析，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸最終產(chǎn)量達(dá)到81%(圖9和圖10)。工業(yè)實(shí)用性如上面詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明具有提供使用新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶大量生產(chǎn)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法的效果。根據(jù)本發(fā)明，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可使用作為廉價底物的胞苷酸和N-乙酰-D-葡糖胺通過一步反應(yīng)大量生產(chǎn)。而且，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可以低成本生產(chǎn)，因?yàn)楹塑杖姿?NTP)或ATP可以通過乙酰Pi和醋酸激酶再生。雖然已經(jīng)參照特定特征對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，該描述僅僅用于說明優(yōu)選實(shí)施例，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同技術(shù)限定。權(quán)利要求1、一種N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcAc2-表異構(gòu)酶)，具有氨基酸序列為SEQIDNO2。2、一種編碼權(quán)利要求1的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2的基因，其特征在于，具有堿基序列SEQIDNO:4、含有權(quán)利要求2的基因的重組載體。5、使用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化的重組微生物。6、一種制備N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求5的重組微生物；并回收所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶。7、一種制備N-乙酰-D-甘露糖胺的方法，所述方法包括將含有N-乙酰-D-葡糖胺的反應(yīng)混合物在權(quán)利要求1的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)；并且回收所述N-乙酰-D-甘露糖胺。8、一種制備神經(jīng)氨酸的方法，所述方法包括將含有丙酮酸和由權(quán)利要求7的方法制備的N-乙酰-D-甘露糖胺的反應(yīng)混合物在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)的存在下進(jìn)行反應(yīng)；并且回收所述神經(jīng)氨酸。9、一種制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，所述方法包括將含有下列物質(zhì)的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)(i)胞苷5'-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，所述反應(yīng)在下列物質(zhì)存在下進(jìn)行(a)N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶(GlcNAc2-表異構(gòu)酶)，(b)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)；并且回收所述CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸。10、根據(jù)權(quán)利要求9的制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸(NTP)或者ATP由乙酰Pi和醋酸激酶再生。11、根據(jù)權(quán)利要求9或10的制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸(NTP)是胞苷三磷酸(CTP)。12、根據(jù)權(quán)利要求9的制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶具有氨基酸序列為SEQIDNO:2。13、根據(jù)權(quán)利要求9的制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、胞苷5'-磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶被固定在載體上。14、根據(jù)權(quán)利要求9的制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶、胞苷5'-磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶分別由堿基序列SEQIDNO:1,SEQIDNO:5,SEQIDNO:8,SEQIDNO:11以及SEQIDNO:14編碼。全文摘要本發(fā)明涉及新的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和用于生產(chǎn)CMP-神經(jīng)氨酸的方法，更具體涉及來源于脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶和使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表異構(gòu)酶生產(chǎn)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。根據(jù)本發(fā)明，CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸可使用作為廉價底物的胞苷磷酸和N-乙酰-D-葡糖胺通過一步反應(yīng)被大量經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)。文檔編號C12N9/00GK101668850SQ200780046422公開日2010年3月10日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者吉泰建,姜善燁,宋在京,張慶淳,徐元敏,梁智英,沈相熙,禹真錫,許仁康,鄭永洙,金大熙,金秉祺申請人:基因化學(xué)株式會社